Tổng quan về Enzyme protease

Một số nấm mốc nhưA.candidatus, P.camerberti, P.roqueforti…cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat. Nấm mốc 2.3.3 Xạ khuẩn Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm ra được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.fradiae, S.Terimosus,… Xạ khuẩn Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được chiết tách từ S.grieus, enzyme này có tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 13 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amina acid. Ở Liên Xô (cũ) người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S,grieus có tên là protelin. Từ S.fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân keratin. Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-zim dùng trong sản xuất Da. Protease từ S.fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong nghiệp chê biến thịt. Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptide đinh trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong hệ hai pha lỏng. Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau: • Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy và giống vi sinh vật. • Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16 – 100 giờ nên có thể thu hoạch nhiều lần quanh năm. • Có thể điều khiển sinh tông hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi. • Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất. Tuy nhiên, trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố ( gây độc, gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý. Để sản xuất chế phẩm enzyme , người ta có thể phân lập giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 14 Phần III – Thu nhận và làm sạch enzyme protease từ vi simh vật và thực vật 3.1 Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật. Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn. Quá trình sản xuất cá chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạn chủ yếu: Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Môi trường nuôi cấy vi sinh tổng hợp enzyme Tách và làm sạch chế phẩm enzyme Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 15 Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme 3.1.1 Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao. Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta có thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành các biến chủng có khả năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu. 3.1.1.1 Phương pháp gây đột biến. Đây là phương pháp hay được dùng nhất nhằm để: -Tạo những đột biến tổng hợp enzyme có cấu trúc bậc 1 thay đổi do đó có thể giảm độ thay đổi với kiểu kìm hãm theo cơ chế liên hệ ngược. Nếu sự thay đổi cấu trúc bậc 1 xảy ra ở vùng trung tâm hoạt động hoặc ở gần đó thì có thể làm thay đổi rõ rệt hoạt tính của enzyme. Gây đột biến đoạn gene hoạt hoá promotor để làm tăng áp lực của nó đối với ARN-polymerase do đó làm tăng tốc độ sao chép mã… Dùng biện pháp này có thể làm tăng lượng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 lần. Hiện tượng đột biến thường liên hệ với sự thay đổi một gene, chẳng hạn bị “lỗi” một bazo khi tái tạo phân tử AND. Để tạo một đột biến gene có thể dùng tác nhân vật lý (tia tử ngoại, tia phóng xạ) hay hoá học (các hoá chất) tác dụng lên tế bào sinh vật. 3.1.1.2 Phương pháp biến nạp. Là sự biến đổi tính trạng di truyền của một nòi sinh vật dưới ảnh hưởng của AND trong dịch chiết nhận được từ tế bào của sinh vật khác. Ở đây yếu tố biến nạp là AND. Sự chuyển vật liệu di truyền (AND) từ tế bào cho đến tế bào nhận có thể xảy ra trong ống nghiệm (invitro) khi cho tế bào nhận tiếp xúc với dịch chiết từ tế bào cho mà không có sự tiếp xúc giữa các tế bào. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 16 Các tế bào có thể nhận bất kỳ loại AND nào chứ không đòi hỏi phải là AND từ các giống họ hàng. Tuy nhiên tế bào chỉ có thể nhận một số đoạn AND nhất định, thường không quá 10 đoạn. Các đoạn AND được di truỳền trong biến nạp có M=106-107 và phải có cấu trúc xoắn kép. Hiện tượng biến nạp phổ biến ở nhiều loại vi khuẩn như: Diplococus, Staphylocus, Hemophilus, Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Xantomonas. 3.1.1.3 Phương pháp tiếp hợp gene. Khác với biến nạp, ở đây vật liệu di truyền chỉ được từ tế bào cho đến tế bào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau. Do vậy các vi sinh vật có khả năng biến nạp thì sẽ không có khả năng tham gia tiếp hợp gene nữa. Hiện nay quá trình tiếp hợp gene đã được nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như E.coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa. 3.1.1.4. Phương pháp tải nạp Vật liệu di truyền (AND) được chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ vai trò trung gian của thực khuẩn thể (phage). Trong quá trình tải nạp, các đoạn AND được chuyển từ tế bào cho đến tế bào tiếp hợp với AND của tế bào nhận. Do đó làm biến đổi tính chất di truyền của tế bào nhận. 3.1.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật. Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng, đã được kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần đặc biệt lưư ý đến điều kiện bảo quản giống. Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyển và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu. • Phương pháp cấy chuyển. Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi trường thạch (thạch nghiêng, hộp petri,…) với thành phần môi trường nuôi cấy và Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 17 điều kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3-400C và sau mỗi tuần phải cấy chuyển lại. Khi cấy chuyển chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn lạc mà không nên lấy cả môi trường dinh dưỡng để đảm bảo không chuyển các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể gây biến đổi bất lợi không thể lường hết được). Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên giữ trong đất để khử trùng. Để kéo dài thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến 1 năm, người ta phủ 1 lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó. Cần lưu ý chỉ phủ lớp dầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chin sinh lý. Phương pháp cấy chuyển rất có hiệu quả để bảo quản các giống nấm men, vi khuẩn và rất hữu hiệu, dễ dàng triển khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫn đến hư hỏng giống gốc. 3.2. Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch • Phương pháp làm khô Bằng cách giữ giống trên cát, đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều được khử trùng cẩn thận). Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục của giống khi bảo quản. Phương pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ khuẩn, một vài loại nấm men, vi khẩn thời gian giữ giống có thể được một nă. Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản, không cần dụng cụ đắt tiền. Tuiy nhiên giống như phương pháp cấy chuyển thời gian bảo quản tương đối ngắn. • Phương pháp đông khô Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và đượclàm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 18 số virut. Tuy nhiên phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật. • Phương pháp bảo quản lạnh sâu Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196oC -> -80oC). Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt đọ khác nhau như -20oC, -30oC, -40oC,-70oC, -140oC và -196oC. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30oC cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut. Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và các dòng tế bào động vật. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro nhue cháy nổ… Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô. 3.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease. Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng cso ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. trong thành Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 19 phần môi trường phải có đủ các chất bảo quản được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho khồng bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác. 3.3.1. Nguồn cacbon. Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tuỳ thuộc vào đặc tính của enzyme và nòi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp. Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp đối với nấm mốc sinh ra enzyme protease có hoạt lực cao. Các nguồn cacbon có tác dụng đến sinh tổng hợp proteinase cảu nấm mốc có thể theo thứ tự: Đối với Asp.flavus 74: fructoza → glucoza → sacaroza → ramnoza → manoza → galactoza → arabinora → lactoza. Đối với Asp. Awamori 200: fructoza → manit → sacaroza → arabinora → manoza → galactoza → lactoza. Đối với Asp. Oryzae 79: fructoza → sacaroza → maltoza → glucoza → manit → arabinora → galactoza. Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme Protease. Ví dụ: VI khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở môi trường tinh bột >8%. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 20 Nhiều xạ khuẩn ưu nhiệt, trong đó Micromonospora vulgaris 42, mọc tốt và sinh tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng đọ tinh bột từ 0,25 – 1,5% sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzyme. Nếu tăng nồng độ tinh bột hơn nữa sẽ không thu được kết quả dương tính. Tỷ số giữa cacbon và nitơ cần phải là 4:1. trên môi trường có maltoza (0,5 – 2%) vi sinh vật phát triển bình thường, nhưng tổng hợp protease ngoại bào bị ức chế. Xạ khuẩn không phát triển được ở trên môi trường có các nguồn cacbon duy nhất là sacaroza, lactoza hoặc arabinoza. Glucoza, manoza,fructoza, xyloza có trong môi trường (0,2 – 5%) làm ức chế sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp enzyme. Ngoài ra, một số loại hydrocacbon cũng có nguồn cacbon có 125 chủng vi sinh vật. Chẳng hạn chủng Ps. Seruginosa có thể đồng hoá hydrocacbon và có khả năng sinh tổng hợp protease có hoạt lực cao trên môi trường n-parafin với 12, 14 và 16 nguyên tử cacbon, dầu nặng hoặc propylenglycol. Chúng khôgn chỉ đồng hoá đươch cả hydrocacbon béo mà còn đồng hoá cả hydrocacbon thơm. 3.3.2. Nguồn nitơ. Nguồn nitơ sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ. Đối với một số laòi nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger, A. flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp protease axit cao. Tren môi trường kzapek NaNO3 đwocj thay bằng cả cazein và bổ sung pepton hoạt lực enzyme tăng 6lần. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ. Cho thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực enzyme protease tăng 22 – 74%. Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp protease nói chung. Trong quá trình nuôi cáy vi khuẩn, trong đó có B. subtilis và B. mesentericus, các hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ được dùng phối hợp trong môi Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 21 trường sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sinh tổng hợp protease. Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH4, H2PO4 là tốt hơn cả. Những muối khác NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3, NaNO3, KNO3. Ca(NO3)2 làm giảm hoạt lực protease tới 30-50%, còn amylaza giảm 7-10 lần. Còn trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ hoạt lực protease và amylaza cũng thấp hơn trong môi trường đối chứng (NH4)2HPO4 và nước chiết đậu tương. Đối với xạ khuẩn ưu nhiệt Actynomyces Vulgaris U2 thì peptin là chất cảm ứng sinh tổng hợp enzyme protease là tốt nhất. Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh vật. Glỹin, alanin, metionin và lơxin cso tác dụng làm tăng hoạt lực protease cảu chủng đột biến A. oryzae 251-90 đến 6-9% và nguyên chủng A. oryzae 132-63 tới 7-24%. Nhiều axit amin có tcs dụgn ức chế đến sinh tổng hợp enzyme, Valin, Axit glutamic, izolỡin và valin ức chế tổng hợp enzyme ở B. megaterium 60%. Còn đối với B. subtilis các axít amin ức chế trong quá trình này là glyxin, metinonin, axit glutamic, alamin, lơxin,… Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đang kể sinh tổng hợp proteinza vi sinh vật. 3.3.3. Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sinh trưởng. Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật. Ion Mg2+ cso tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme cso hoạt tính ở nhiệt độ cao. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25-30oC. Trị số pH ban đầu cảu môi trường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 22 Độ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy môi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ở môi trường bề sâu (môi trường dịch thể), thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc thì việc này cực kỳ quan trọng). Độ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy bề mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt. Khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến cả thành phần định tính và định lượng sao chi quá trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn là cao nhất. Muốn vậy người ta có thể sử dụng một số phương pháp: Phương pháp tối ưu hoá quy hoạch thực hiện toàn phần. Phương pháp toán học môhình hoá thực nghiệm. 3.4. Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme. Có thể chia làm 2 loại: môi trường tổng hợp và môi trường tự nhiên. Môi trường tổng hợp: là môi trường bao gồm các chất với liều lượng xác định (qua tìm hiểu, nghiên cứu), chẳng hạn nguồn cacbon có thể là tinh bột, xenluloza, đường, axit, rượu, nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ. Loại môi trường này được sử dụng chomục đích nghiên cứu. Môi trường tự nhiên: thường dùng các loại phế liệu, nguyên liệu có chứa các nguồn cacbon, nitơ, khoáng, các yếu tố sinh tổng hợp trưởng. Mặt khác, các nguyên liệu này có sẵn, rẻ tiền nên được sử dụng rất nhiều trong công nghiệp sản xuất các phế phẩm enzyme từ vi sinh vật. Các nguyên liệu để chuẩn bị làm môi trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép hoa quả, rau, khô dầu, bã rượu, rĩ đường, sản phẩm phân huỷ nấm, men bia, trấu, lõi ngô. Khi lựa chọn sử dụng môi truờng cần chú ý đến các chất cso tác dụng điều hoà sinh tổng hợp enzyme, đặc biệt các chất cảm ứng. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 23 Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25-30oC. Trị số pH ban đầu cảu môi trường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật. 3.5. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật. • Nuôi cấy bề mặt: Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương (đậu tương lên men-misô) đã được nấu chín trộn hạt cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương). Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… cso chất phụ gia là trấu. Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mông, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc rượu.
Quy trình công nghệ: Làm nguội, tơi. Thanh trùng bằng nhiệt độ. Làm ẩm. trộn nguyên liệu. Nuôi cấy, theo dõi, xử lý. Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy. Gieo trồng vsv lý.
Ưu nhược điểm: Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật. Trong công nghiệp rượu muốn đường hoá 100kg tinh bột chỉ cần 5kg chế phẩm nấm mốc bề mặt nhưng phải cần đến 100lít nấm mốc chìm để lọc bã và tế bào vi sinh vật. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 24 Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp mà không cần khâu tách và làm sạch enzyme. Tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện qui mô gia đình, trang trại cũng như qui mô đến 20T/ngày. Nuôi cấy trong điều kiện vô cùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy đều có nhiễm trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó. Tuy nhiên phương pháp bề mặt cso năng suất thấp, khó cơ khí hoá, tự động hoá, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều. • Nuôi cấy chìm Vi sinh vật được nuoi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất chủ yếu trong đa số trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống vsv dùng nguồn cơ chất cacbon là đường glucoza, saccharoza. Thực tế, trong một số trường hợp đường hoá sơ bộ tinh bột trước khi thanh trùng. Khi đó đường maltoza được tạo thành là chất cảm ứng tốt, môi trường thường giảm độ nhớt nên dễ dàng cho quá trình khuấy trộn và sục khí. Phương pháp nuôi cấy bề sâu đồi hỏi phải được vô trùng tuỵet đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy. Các giai đoạn chính cảu quá trình nuôi cấy chìm 1 bước gồm: chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất.
Ưu nhược điểm Phương pháp nuôi cấy hiện đậi dễ cơ khí hoá, tự động hoá, năng suất cao, dễ tổ chức sản xuất. Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến cso khả năng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện vệ sinh, vô trùng. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 25 Tuy nhiên do thu được canh trường và nông độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn. 3.6 Tách và làm sạch chế phẩm enzyme. Một điều cần nói thêm nữa là enzyme thường chứa ở các tế bào vi sinh vật gọi là các enzyme trong tế bào (intracellular), nhuwnh nó cũng có thể được các vi sinh vật tiết ra môi trường sống. Đó là các enzyme ngoài tế bào (extracellular). Enzyme vi sinh vật thương chiết là enzyme ngoại bào. Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng tế bào và màng của các cấu tử của tế bào. Do đó có thể chiết rút các enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch. Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cat thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa (homogenzizator). Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lí và hóa học khác nhau như sóng siêu âm. Dùng các dung môi hữu cơ như buthanol, aceton, glycerin, ethyl acetate… và chất detergent. Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ. Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc bằng các dung dịch muối trung tính. Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý. Trước hết đó là nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần thiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 5 oC). Các thao tác phải nhanh. Một số chất điện li làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl2, CaCl2. Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 26 Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường… là các tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có phân tử lượng cao khác người ta hay dung kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion) điện di, phương pháp lọc gel. Mục đích yêu cầu: Các chế phẩm enzyme được sử dụng ở các dạng khác nhau theo mức độ tinh khiết (hoạt độ riêng). Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa enzyme được sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất nếu chúng không gây ảnh hưởng đáng kể đến sản phẩm và qui trình công nghệ sau này( ví dụ: sản xuất rượu, nước chấm thực vật, da). Cũng có khi người ta cần sử dụng chế phẩm enzyme tinh khiết trong công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học. Enzyme nói chung rất dễ giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài do đó khi tách và tinh chế enzyme để tránh sự biến hình protein ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp, độ pH thấp không có mặt các chất gây biến hình enzyme. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 27 3.6.1 Phương pháp kết tủa Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theo % nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dung dịch enzyme. Các loại muối có thể được dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4… ngươi ta đã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme. Loại muối này lại rẻ và phổ biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hào 767 g/l ở 25 0C). 3.6.2 Phương pháp sắc ký *Các kỹ thuật sắc ký cột Dịch chiết enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng vẫn chưa đảm bảo độ đồng nhất cần thiết. Do đó dịch chiết enzyme được tiếp tục làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột. - Phương pháp dùng chấ rây phân tử (lọc gel – gel filtration) Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra. Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme. Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các yeus tố về cơ học cũng như sinh học. Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước (hydrophyl). Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 28 - Phương pháp sắc ký trao đổi ion Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau điện tích tổng số của các protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao dổi ion. Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh ion hoặc là chất ionit. Đây là những chất giá trơ, không tan trong nước, có bản chát là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa polystiron. Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa. Các chất trao dổi ion có chất giá là cellulose, sephadex, molselect thông thường được dùng để tách protein enzyme, còn các chất trao đổi ion có chất giá là polystirol (ví dụ như Dowex, Amberlite) chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn. Anionit DEAE – cellulose (diethylamino – ethyl – cellulose) là dẫn xuất este của cellulose. C2H5 C2H5 Cellulose – O – CH2 – N C2H5 Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 29 Trong H2O nó được phân li: Cellulose – O – C2H4 – N – (C2H5) + H2O C2H5 Cellulose – O – C2H4 – N+ + OH C2H5 H Đây là chấ trao đổi anion Nếu chất giá là sephadex thì chúng ta có chất trao đổi ion sephadex. Đó là cacs loại DEAE – sephadex và CM – sephadex. Ưu điểm của loại này là vừa tách được protein enzyme về kích thước và về điện tích tổng số của các protein enzyme. Trường hợp CM – sephadex trên chất giá sephadex có gắn nhóm COO- - O – CH2 – COOH Phân ly COO – (mang điện tích) Đây là chất trao đổi cation. Ngoài ra, có các phương pháp : - Phương pháp dùng cháy phụ - Phương pháp dùng chất phụ đặc hiệu sinh học hay là phương pháp sắc ký ái lực (afinity chromatography). 3.6.3 Phương pháp tách hệ hai pha nước Cơ sở kỹ thuật này dựa vào sự phân bố khác nhau của hỗn hợp trong dung dịch hai pha không hòa tan vào nhau. Các hệ hai pha đặc trưng bằng cách trộn các hệ dung môi vào nhau đẻ tạo thành hai pha riêng biệt. Hệ dung môi được sử dụng trong phương pháp này có thể là polymer/polymer như: polyethylene glycol (PEG) và dextran hoặc heejpolymer/muối như PEG và potasium phosphate, sodium Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 30 phosphate , sodium sulphate… Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì vậy phương pháp pháp này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia các enzyme trong suốt quá trình tinh sạch protein. Hệ hai pha nước được xem là phương pháp tốt cho việc phân tách và tinh sạch các hỗn hợp, vì phân tách chất lỏng có mật độ khác nhau dễ dàng hơn phân tách các chất rắn ra khỏi các chất lỏng. So với các phương pháp tinh sạch khác thì hệ hai pha nước có một số ưu điểm hơn như: có độ hòa tan trong nước của hai pha lớn (70 – 80 5), đạt độ tinh sạch cao, hiệu suất cao, dễ dàng sử dụng ở quy mô lớn và đặc biệt polymer được tái sử dụng. Sự phân tách đạt hiệu quả cao tùy thuộc vào các thông số như khối lượng phân tử và điện tích của đối tượng nghiên cứu, nồng độ và khối lượng phân tử của các polymer, nhiệt độ, pH, thời gian, lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của các loại muối đa hóa trị như phosphaste hoặc sulphate… PHẦN IV. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE 4.1 Quy trình công nghệ lên men tạo enzyme protease 4.1.1 Giới thiệu chung Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy vi sinh vật thường được thực hiện theo phương pháp bề mặt. Phương pháp này được phát triển rất rỗng rãi, không chỉ để thu nhận chế phẩm enzyme ma trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng sinh và nột số quá trình lên men truyền thống. 4.1.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt. Phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bầ mặt môi trường. Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là: - Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ thường không phức tạp. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 31 - Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bê mặt cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh. - Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối vi sinh vật, enzyme và nước). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và bảo quản. - Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vưà đơn giản vừa không tốn kém. - Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vưc đo ra khỏi toàn bộ khối nuôi cấy, những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn. Phương pháp nuôi cấy bề mặt cũng có những khuyết điểm cần được quan tâm và khắc phục để hoàn thiện phương pháp này. Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất là phương pháp này khá tốn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường nên rất cần diện tích. a. Môi trường lỏng. Ở môi trường lỏng, vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng ( môi trường) và pha khí ( không khí). Ở đây, vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường. Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối vi sinh vật. Nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo phương pháp cấy bề mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác. Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn, vi sinh vật sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 32 dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi trường nhỏ, sẽ thiếu thành phần chất dinh dường, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao. Trong nhiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong khay nuôi cấy có chiều cao môi trường từ 5-7cm là hợp lý. b. Môi trường đặc Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme khi nuôi cấy vi sinh vật thu nhan enzyme người ta thương sử dụng môi trường đặc. Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường. Trong trường hợp này, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật. Vi sinh vật không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( môi trường) và pha khí ( không khí) mà còn phất triển trên bè mặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại, không khí không thẻ xâm nhập vào lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp quá se không thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý. Nếu sử dụng cám là nguyên liệu chính để nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme, người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp mooi trường, tạo điều kiện thuận lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường. Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn ( môi trương đặc) này rất thích hợp cho lên men ở nấm mốc Asporyzae. 4.1.3 Sản xuất nấm mốc giống – nuôi cấy tạo sinh khối. a. Môi trưòng cho sản xuất mốc giống. Dùng môi trường tổng hợp Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 33 Môi trường Benhamin. Bột ngô 20g Glucose 10g Pepton 10g Cao nấm men 4g Nước 1000ml b. Chuẩn bị mốc giống. Nuôi cấy giống bao gồm: - Trong ống thạch nghiêng hay giữ ống trong ống nghiệm. - Trong bình tam giác ( nhân giống nhỏ). - Trên sàng, khay ( nhân giống lớn). c. Nuôi cấy tạo sinh khối. Sau khi phân lập thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa Petri cấy chuyển những mốc sợi sam ( hay lấy nấm mốc từ ống giống) ống thạch khác. Yêu cầu ống giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn lộn bất kỳ một loài vi sinh vật nào khác. Môi trường thạch nghiêp phải đảm bảo đầy đủ dinh dưỡng. Tiếp tục nhân giống và nuôi cấy cho đến khi đạt được sinh khôi theo mong muốn. 4.2 Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae a. Sinh trưởng và sinh tổng hợp protease từ nấm Khi nuôi vi sinh vật tạo protease có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau. Quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hoặc ngoài môi trường. Ở một số vi sinh vật, quá trình sinh tổng hợp protease tiến hành song song với quá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính và sự tăng khối. Trong trường hợp này, sinh tổng hợp enzyme protease kết thúc ở pha logarit Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 34 cùng đồng thời với sự ngừng sinh trưởng và sự bắt đầu pha phát triển ổn định tiếp theo sau. Tuy nhiên theo ý kiến của nhiều tác giả, sự tạo thành protease cực đại thường xảy ra sau khi quần thể tế bào vi sinh vật đạt điểm sinh trưởng. Trong trường hợp này, sinh trưởng của vi sinh vật hầu như không kèm theo sự tích lũy enzyme protease trong canh trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp enzyme cực lớn. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 35 b. Quy trình thu nhận enzyme protease Nuôi cấy Thu nhận phế phẩm chế phẩm enzyme thô Enzyme thô đem sử dụng chế phẩm enzyme thô đem tinh chế nghiền mịn trích ly Lọc bã dùng trong chăn nuôi kết tủa enzyme cồn hoặc sulfat amon thu nhận kết tủa sấy kết tủa sử dụng chế phâm enzyme tinh sạch tinh chết kết tủa thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết enzyme kết tinh Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 36 4.3 Quy trình thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Asp.oryzae Thu nhận sinh khối Chế phẩm enzyme (enzyme thô) thô đem sử dụng Chế phẩm enzyme thô đem tinh chế sấy Nghiền mịn Trích ly Lọc Bã dùng trong chăn nuôi Kết tủa enzyme Thu nhận kết tủa Sấy Chế phẩm enzyme kỷ thuật. Tinh chế Nước Nguyên liệu dinh dưỡng (bột bắp, nấm men, pepton) Khoáng hỗn hợp Hấp thanh trùng Làm nguội đến 300C Đổ lên khay Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng Giống Asporyzae Thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 37 * Thuyết minh quy trình công nghệ a. Lý do chọn chủng nấm mốc Asp.oryzae Asp.ryzae có cơ thể sinh trưởng của nó bao gồm nhiều sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7µm, phân nhánh và có rất nhiều vách ngang, chia sợi thành nhiều tế bào. Đặc điểm của giống Asp.oryzae rất giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào ( amylase, protease, pectinase,…), ta rất hay gặp chúng trong các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa bột, gạo …đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lõi ngô, bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành nấm mốc mới. b. Kỷ thuật nuôi cấy Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dày 2-3cm, rồi được đưa và môi trường nuôi cấy, đặt trên nhưng giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí. Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28-320C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao qua đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển. Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bấn rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường. Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 30-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asporyzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau: Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 38 • Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ khi bắt đầu nuôi cấy. Enzyme mới bắt đầu được hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. • Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Enzyme proteasen được tổng hợp mạnh. Lượng O2 trong không khí giảm và lượng CO2 tăng dần, do đó trong giai đoạn này phải thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29- 300C là tốt nhất. • Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí/thể tích pòng nuôi cấy/1 giờ. Nhiệt độ nuôi duy trì ở 300C, trong giai đoạn này bào tử được hình thành nhiều do đó lượng enzyme protease tạo ra sẽ giảm xuống. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzyme rất cần thiết. c. Thu nhận sản phẩm Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme protease, chế phẩm này được gọi là enzyme thô ( vì ngoài thành phần enzyme ra còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước trong môi trường). Để đảm bảo chế phẩm enzyme protease không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp ( thiết bị sấy thường dùng ở đây là máy sấy chân không). Độ ẩm cần đạt được sau khi quá trình sấy kết thúc là nhỏ hơn 10% độ ẩm. Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 3-400C. Enzyme protease ở nấm mốc Asporyzae sẽ bị mất hoạt tính nếu nhiệt độ lên đến 60-700C. Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phẩm thô không cần phải quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta cần phải tiến hành làm sạch enzyme. Để sản xuất enzyme tinh khiết người ta phải tiến hành như sau: Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 39 Toàn bộ khối lượng enzyme thô protease được đem đi nghiền nhỏ. Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzyme nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ đễangf thoát ra khỏi tế bào. Phần lớn enzyme protease ngoại bào khi được tổng hợp và thoát ra khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường. Khi ta nghiền nhỏ, enzyme thoát ra khỏi thành phần này dễ dàng hơn. Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường họp này được dùng là cát thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thuỷ tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100oC để loại bỏ nước và tiêu diệt vi sinh vật. Trích ly: Sau khi nghiền mịn người ta cho nước vào để trích ly enzym protease. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người ta cho4- 5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc(chú ý cần loại bỏ các thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn) Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó chứa nước và các chất hòa tan khác từ khối lượng môi trường nuôi cấy. việc tiếp theo là làm sao tách enzym ra khỏi vật chất này. Quá trình kết tủa enzym protease: Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzym nhờ những tác nhân gây tủa. Trong công nghệ tinh chế enzym, người ta thường dùng cồn và sunfat amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác. Trong khi tiến hành kết tủa , người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym. Khi đổ chất làm kết tuarenzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 40 Trong quá trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sunfat amon với liều lượng như sau: Cứ một phần dung dịch enzym thô người ta cho 2 đến 2.5 lần cồn hoặc sulfat amon. Khi cho chất kết tủa vào dung dịch enzym thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ sau đó để yên trong điêù kiện nhiệt độ lạnh (thường là 4 đến 7 oC) theo thời gian các enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa dạng paste( độ ẩm lớn hơn 70%W) ở trạng thái này enzym rất dẽ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người tta sấy kết tủa enzym ptotease ở 40 oC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8%W( thiết bị sấy thường dùng làm máy sấy phun sương- có thể xem ở phần phụ lục) Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzym ptotease ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa 1 số enzym ta quan tâm. PHẦN V. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE Protease không những được ứng dụng nhiều trong y dược, hóa học, trong nông nghiệp mà trong công nghiệp protease chiếm vai trò quan trọng, việc sử dụng enzyme trong công nghiệp là đa dạng, phong phú và đã đạt được nhiều kết quả to lớn. Thử nhìn thống kê sơ bộ sau đây về các lĩnh vực đã dùng protease ta có thể thấy được sự đa dạng: công nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá, công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh mỳ, bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô và bột trứng, công nghiệp hương phẩm và mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp phim ảnh, công nghiệp y học,… Sau đây là những ứng dụng mà protease mang lại trong công nghiệp thực phẩm: Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 41 5.1 Trong công nghiệp chế biến thịt. - Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt. Có thể ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định – phương pháp này phổ biến và thuận lợi nhất; tẩm hỗn hợp làm mềm thịt ( E, muối, bột ngọt ), tiêm dung dịch enzyme vào thịt ( tiêm dung dịch enzyme vào con vật trước khi giết mổ ). 5.2 Trong chế biến thủy sản - Khi sản xuất nước mắm thì thời gian chê biến thường là dài nhất, hiệu suất thủy phân ( độ đạm ) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme protease để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Phương pháp sử dụng protease trong sản xuất nước mắm: + Nước mắm truyền thống là kết quả của quá trình thủy phân protein thịt cá dưới tác động của hệ protease nội tại trong điều kiện có muối theo cơ chế: Protease Protease Protease Protein polipeptid peptid amino - acid Trong 24h đầu tiên, dưới tác động của các hệ protease nội tại của cá một phần protein thịt cá bị thủy phân thành peptid, polipeptid hòa tan trong nước bổi. Sau đó protein thịt cá, polipeptid và các peptid được tạo thành này tiếp tục bị thủy phân mạnh mẽ bởi các protease kim loại tạo thành các acid amin tự do, các peptid ngắn và đã có sự hình thành hương vị của nước mắm. 5.3 Trong công nghiệp sữa Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 42 - Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số sinh vật như A.candidus, P.roquerti, B.mesentericus, ….được dùng trong sản xuất phomat. Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ, bánh quy,…protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn. 5.4 Trong sản xuất Bia - Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của Bia vả rút ngắn thời gian lọc.Protease của Aps.oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý Bia tốt hơn. Ứng dụng enzyme protease để làm trong và ổn định chất lượng nước quả và rượu vang – một trong những nguyên nhân chính gây khó khăn cho việc làm trong nước quả và gây đục nước quả là protein. 5.5 Trong công nghiệp Da - Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phần một phần protein của da, chủ yếu là collagel, thành phần chính làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (B.mesentericus, B.subtilis ), nấm mốc ( A.oryzae, A.flavus ) và xạ khuẩn (S.fradiae, S.grieus, S.rimosus,… ) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần chiếm một vị trí quan trọng. 5.6 Trong công nghiệp dệt. - Protease vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo ( các sơ nhân tạo được bằng các dung dung dịch cazein, getalin ) để sợi được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hóa chất để tẩy trắng. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 43 Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như: - Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng. - Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amilaza tạo thành hỗn hợp enzyme làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm. - Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh,…. Sản xuất thuốc - Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm… Sản xuất xà phòng Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 44 Kết luận Tóm lại, có thể nói rằng , việc nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm enzym càng được chú trọng ở các lĩnh vực khác nhau. Trong 20 năm cuối thể kỷ XX và các năm đầu thế kỷ XXI các enzym khác nhau đã được ứng dụng ở Việt Nam bước đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các enzym trong chế biến nông sản, thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến bột ( viện công nghiệp thực phẩm,Viện công nghệ sinh học –công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội…)Việc nghiên cứu các enzyme phục vụ nông nghiệp công nghiệp cũng đã được quan tâm và có kết quả đáng kể. Ví dụ, chế phẩm enzym mới ra đời phục vụ nông nghiệp E 2001 có tác dụng tăng độ phì nhiêu đất, tăng năng suất cây trồng. Đã có các nghiên cứu ứng dụng protease trong sản xuất rượu, bia rút ngắn thời kỳ lên men cũng như sản xuất nước mắm ngắn ngày bằng công nghệ enzym protease./.