Xác định chỉtiêu sinh hóa và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm càng xanh (macrobrachium rosenbergii) bị đục cơ nuôi ở thành phố Cần Thơ

cơ bám vào mang tơm. Nếu khơng xử lý kịp thời sẽ làm tơm nhiễm bệnh từ vi khuẩn. Bình thường bệnh đen mang xảy ra lúc tơm lớn (tơm được hai tháng rưỡi tới ba tháng trở lên). (Viện nghiên cứu nuơi trồng thủy sản 1) 2.2.4.3. Bệnh tơm trắng (White Prawn Disease, WPD) Dấu hiệu đặc trưng của bệnh này là cĩ những đốm màu trắng đục trên lớp vỏ ngồi nhưng cơ thì bình thường và WPD thường xảy ra trên tơm trưởng thành (Delves-Broughton and Poupard, 1976). Tuy nhiên bệnh này cĩ ảnh hưởng rất thấp trong ao nuơi. Ở Thái Lan, vấn đề dinh dưỡng được xem là nguyên nhân gây ra bệnh này (trích dẫn bởi Nguyễn Kim Cương, 2006). 2.3 Sơ lược về bệnh đục cơ 2.3.1 Dấu hiệu bệnh lý Hậu ấu trùng nhiễm bệnh đục cơ cĩ trạng thái lờ đờ, giảm ăn và phần cơ bụng cĩ màu trắng đục. Vùng đuơi (telson) bị đục trước và hiện tượng đục thân này tấn cơng dần lên phần đầu của tơm. Sau cùng, tất cả các vùng cơ thuộc phần bụng và phần đầu ngực đều bị tấn cơng cĩ thể quan sát rõ các vết đục dưới ánh nắng mặt trời, tơm bệnh nặng mang chuyển màu trắng đục vỏ mềm, khi luộc chính cĩ màu hồng nhợt nhạt. Tỉ lệ chết cao, tối đa là 95% nhưng khơng đồng nhất. (Bùi Quang Tề và ctv, 2004). 2.3.2 Tác nhân Tác nhân của đục cơ (White tail disease- WTD hay cịn gọi là bệnh đuơi trắng) hiện nay cịn nhiều tranh luận. Theo Winton Cheng và Jiann- Chu Chen (1998- 2001) thì tác nhân là do cầu khuẩn Lactococcus garvieae (Enterococcus seriolicida). Là vi khuẩn gram (+), cĩ dạng hình cầu hay hình trứng, phát triển ở 10-40oC, độ muối thích hợp là 0.5-6ppt, pH=9.6.Theo phân lập của viện nghiên cứu nuơi trồng thủy sản 1 ở một mẫu tơm càng xanh bị bệnh đục cơ tại Hải PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 6 Phịng, đã phân lập được cầu khuẩn gram (+) và trực khuẩn dung huyết mạnh, gram(-) (Bùi Quang Tề và ctv 2004). Nhưng hiện nay lại cĩ nhiều báo cáo cho là cĩ 2 loại virut: MrNV ( Macrobrachium rosenbergii Nodavirus) và XSV (Extra small virus) gây ra bệnh trắng đuơi xảy ra ở trại ương và ao nuơi ở Ấn Độ, Trung Quốc, Đài Loan. Cả hai lồi virus này được phân lập từ tơm càng xanh cĩ dấu hiệu bệnh đục cơ. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của hai lồi virus này thì vẫn cịn trong quá trình nghiên cứu (Hameed, 2005). Mặt khác Wang và ctv (2007) đã xác định tác nhân gây bệnh đục cơ là M. rosenbergii nodavirus (MrNV) và extra small virus (XSV). 2.3.3 Phân bố và lan truyền bệnh 2.3.3.1 Thế giới Bệnh đục cơ (White muscle disease) cịn được gọi là bệnh trắng đuơi (White tail disease) ở tơm Càng Xanh (Macrobrachium rosenbergii) là một trong những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho người sản xuất giống cũng như người nuơi tơm thương phẩm. Bệnh được mơ tả lần đầu tiên vào năm 1997 và đến nay đã xuất hiện ở một số quốc gia trong khu vực châu Á (Bùi Việt Hùng). Bệnh đục cơ do virus gây ra được báo cáo đã xuất hiện ở các nước như: Trung Quốc, Đài Loan, Ấn độ và vùng Caribbean (Cộng hồ Dominican, French West Indies). Tại Thái Lan, bệnh đục cơ được biết là gây tỉ lệ chết cao ở tơm càng xanh giai đoạn hậu ấu trùng, dao động trong khoảng 30-100%. Tơm càng xanh sau khi chuyển sang giai đoạn hậu ấu trùng được 2-3 ngày cĩ dấu hiệu bị đục cơ. Tỉ lệ chết bắt đầu xuất hiện và cĩ khả năng gây chết đến 100% trong vịng 5 ngày kể từ khi phát hiện cĩ tơm mang dấu hiệu đục cơ.(Hameed, 2005) Ngồi ra, tại Trung Quốc, Đài Loan tỷ lệ nhiễm đục cơ từ 30- 75% ở các ao nuơi tơm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii). (Bùi Quang Tề và ctv, 2004). Khoảng giữa tháng một đến tháng 3 năm 2006, bệnh đục thân được biết cĩ sự hiện diện trên tơm càng xanh bột và giống tại các trại nuơi, ương ở Kaohsiung và Pingtung thuộc miền nam Đài Loan. (Hsieh và ctv, 2006) 2.3.3.2 Việt Nam Ở Việt Nam, đục cơ cũng đã xuất hiện một vài năm nay từ năm 2000 khi nhập tơm càng xanh bột cĩ nguồn gốc từ Trung Quốc về Thanh Trì-Hà Nội, đã cĩ hiện tượng tơm đục cơ và chết hàng loạt. Đầu năm 2002, đàn tơm bố mẹ 5-6 tạ của một trại sản xuất tơm giống ở Hải Phịng đã bị đục cơ. Sau khi cho nở ấu trùng và PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 7 ương thành tơm bột, tỷ lệ sống rất thấp chỉ đạt khoảng 1%. Tháng 5/2002, một số ao nuơi tơm càng xanh ở Thanh Trì, Hà Nội thả giống cỡ 0.2g/con nuơi sau 15- 20 ngày tơm đã xuất hiện bệnh đục cơ và chết rải rác. Tỷ lệ nhiễm bệnh trong đàn tơm nuơi ở Thanh Trì từ 6-90%. (Đỗ Thị Hịa và ctv, 2004) Riêng ở Thành Phố Cần Thơ, từ năm 2004 đến nay hiện trạng về đục cơ ngày càng gia tăng. Năm 2004 bệnh đục cơ đã gây thiệt hại 10 ha diện tích nuơi tơm càng xanh ở Cờ Đỏ và gây hao hụt từ 60-70%. Năm 2005, bệnh đục cơ gây thiệt hại một số mơ hình nuơi ở Cờ Đỏ, mức độ hao hụt từ 70-100% (Theo thơng tin ghi nhận từ 1 số hộ nuơi ở Cờ Đỏ). Từ đầu năm 2006 đến nay, tình hình bệnh đục cơ lại xuất hiện ở một số trại giống trên địa bàn Thành phố Cần Thơ gây hao hụt lớn cho các ao nuơi thịt và tỷ lệ hao hụt lên đến 70-100% sau 1 tuần thả nuơi. 2.3.4 Các biện pháp phịng trị bệnh đục cơ do vi khuẩn Phịng bệnh: khơng để tơm bị sốc vì mơi trường nuơi xấu; nhiệt độ trong ao để biến thiên trong ngày quá 30C, thiếu oxy vào buổi sáng, pH=7.5-8.5; H2S=0,01mg/l. Bĩn vơi CaCO3 với liều lượng 1-2kg/100m3 nước ao. Cho ăn vitamin C với liều lượng 2-3g/kg thức ăn, mỗi tháng 2 đợt, mỗi đợt 1 tuần (Bùi Quang Tề và ctv, 2004) Trị bệnh: cho ăn một số kháng sinh Amikacin hoặc Ciprofloxancin liều lượng 100mg/kg tơm/ngày thứ 1 và từ ngày thứ 2-7 cho ăn liều 50mg/kg tơm/ngày. (Bùi Quang Tề và ctv, 2004). 2.4 Sơ lược về vi khuẩn gây bệnh trên tơm 2.4.1 Đặc điểm vi khuẩn Aeromonas Aeromonas hydrophila thuộc họ Aeromonadaceae cĩ tiên mao nên cĩ khả năng di đơng, gram âm, dạng hình que ngắn, kích thước 0,5x1,0-1,5µm, hai đầu hơi trịn, yếm khí tùy tiện, cĩ phản ứng Cytochrom oxidase dương tính, cĩ khả năng khử nitrat, khơng mẫn cảm với Vibriostat 0/129 (Bùi Quang Tề và ctv, 2004). Giống Aeromonas là lồi vi khuẩn phân bố rộng trong mơi trường, cả ở nước ngọt và nước lợ, cĩ trong cơ thể cá và động vật khơng xương sống. Cĩ một vài báo cáo Aeromonas cĩ tiềm năng gây bệnh trên con người (Deodhar et al., 1991) (Từ Thanh Dung và ctv.,2005). 2.4.2 Đặc điểm vi khuẩn Vibrio Vibrio spp. thuộc họ Vibrionaceae là vi khuẩn gram (-), dạng hình que hay hình dấu phẩy, kích thước tế bào từ 0,3–0,5x1,4–2,6µm, cĩ khả năng di chuyển nhờ PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 8 tiên mao. Hầu hết vi khuẩn thuộc giống này đều cho phản ứng Oxydase dương tính, cĩ khả năng lên men, oxy hĩa trong mơi trường O/F glucose, khơng cĩ khả năng sinh H2S và mẫn cảm với Vibriostat (O/129). Dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên mơi trường chọn lọc Thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS) Vibrio spp. được chia thành 2 nhĩm: nhĩm cĩ khả năng lên men đường sucrose cĩ khuẩn lạc màu vàng, nhĩm khơng lên men đường sucrose cĩ khuẩn lạc màu xanh lá cây.(Bùi Quang Tề và ctv, 2004) 2.4.3 Đặc điểm vi khuẩn Pseudomonas Pseudomonas spp. là vi khuẩn gram âm, hình que, kích thước 0,5–1x1,5–5µm, phát triển trên mơi trường đơn giản vá hiếu khí. Đa số các lồi thuộc nhĩm này cĩ phản ứng oxy hĩa hoặc một số ít khơng oxy hĩa và khơng lên men trong mơi trường O/F glucose. Giới hạn nhiệt độ từ 4-43oC. Phân bố khắp nơi trong mơi trường, trong đất và trong nước. Cĩ lồi phân bố ở nước ngọt: Pseudomonas flourescens và lồi phân bố nước ở biển: Pseudomonas anguilliseptica, Pseudomonas chlororaphus. (Bùi Quang Tề và ctv, 2004) 2.4.4 Đặc điểm cầu khuẩn Lactococcus garvieae Cầu khuẩn Lactococcus garvieae hay cịn gọi là Enterococcus seriolicida. Là các vi khuẩn gram (+), cĩ dạng hình cầu hay hình trứng. Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ 10-400C, độ muối thích hợp 0,5-6,0 %o, pH 9,6 (theo Winton Cheng, Jiann-Chu Chen, 1998-2001 được trích dẫn bởi Bùi Quang Tề và ctv, 2004) 2.5 Các nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản Ở Chille, Miranda et al. (2003) đã tìm ra 25 chủng vi khuẩn khác nhau đã kháng với Oxytetraxyline từ 4 nơng trại nuơi cá. Ở ĐBSCL đã phân lập được 169 dịng vi khuẩn từ các ao nuơi thủy sản và thử với 6 loại kháng sinh và kết quả cho thấy 2% kháng với Chloramphenicol, cĩ 59% dịng vi khuẩn kháng với 4 hay 5 loại kháng sinh trong đĩ cĩ Chloramphenicol. Cĩ 34% kháng nhiều loại kháng sinh như Chloramphenicol, Ampicilline, Tetracyline, Trimethoprim + Sulfamchoxazole, Nitrofurantion (Đặng Thị Hồng Oanh và ctv., 2005). Kết quả kháng sinh đồ của 26 trong số 27 dịng vi khuẩn phát sáng được thử với 6 loại thuốc kháng sinh thường dùng trong nuơi thủy sản cho thấy 100% số dịng vi khuẩn thử nghiệm kháng với ampicilin. Các dịng vi khuẩn phát sáng thử nghiệm mẫn cảm với chloramphenicol, norfloxacin và nitrofurantoin hơn so với tetracycline và trimethoprim/sulfamethoxazole. Phần lớn các dịng vi khuẩn thử PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 9 nghiệm chỉ kháng với một loại kháng sinh (77%). Cĩ khoảng 15% dịng vi khuẩn kháng với 2 loại kháng sinh, và 4% kháng với 4 loại thuốc được thử. Cĩ 4% số dịng vi khuẩn kháng với cả 6 loại kháng sinh thử nghiệm.(Đặng Thị Hồng Oanh và ctv, 2006). Gần đây, Pender et al. (2008) đã nghiên cứu sự kháng thuốc của Aeromonas phân lập từ mơi trường nước của các ao nuơi cá da trơn, cá chình và trại sản xuất giống ở Hà Lan. Kết quả cho thấy sự kháng thuốc của Aeromonas như sau: ampicilin và oxytetracyclin là 100%, sulfamethoxazole 24%, trimethoprim 3% và ciprofloxacin và chloramphenicol là 0%. Năm 1988, khảo sát sự kháng thuốc kháng sinh Tetracycline và Oxytetracycline của vi khuẩn Aeromonas gây bệnh trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) thì đã phân lập được 146 dịng vi khuẩn của giống Aeromonas trong đĩ thì cĩ 89 dịng vi khuẩn kháng với Oxytetracycline chiếm 61% và 32 dịng vi khuẩn kháng với Tetracycline chiếm 22% (Depaola et al., 1988). Và đến năm 2006 thì Mohamed et al., (2006) đã phân lập được 81 dịng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas đã kháng với Tetracycline. Qua kết quả cho thấy sự kháng thuốc của vi khuẩn đã tăng lên về số lượng chủng vi khuẩn kháng và loại kháng sinh bị kháng. Waltman and Shotts (1986) đã kiểm tra sự kháng thuốc trên 118 chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập được ở Mỹ với 37 loại kháng sinh. Kết quả nghiên cứu cho thấy, đa số các vi khuẩn gram âm nhạy với hầu hết các loại thuốc đã thí nghiệm. Tuy nhiên, hơn 90% số chủng vi khuẩn kháng với colistin và sulfamid. Khi được kiểm tra sự nhạy cảm tự nhiên đối với 71 lồi kháng sinh của 102 dịng vi khuẩn Edwarsiella (trong đĩ cĩ 41 chủng E. ictaluri) cho rằng tất cả các dịng Edwarsiella đều nhạy cảm tự nhiên với nhĩm kháng sinh tetracycline, β-lactamin, quinolone, chloramphenicol, nitrofurazion… Đồng thời tất cả các chủng đều kháng tự nhiên với nhĩm kháng sinh macrolid và kháng sinh oxonilic acid ( Stock et al., 2001). Đối với bệnh mủ gan trên cá tra nuơi ở Việt Nam thì vi khuẩn phân lập được từ cá bệnh và được định danh là E. ictaluri và cũng đã được nghiên cứu sự kháng thuốc của lồi vi khuẩn này. Kết quả nghiên cứu cho thấy lồi vi khuẩn này thể hiện tính đề kháng và đa kháng với các loại kháng sinh thường được sử dụng trong điều trị bệnh. Tuy nhiên, số lượng, tỷ lệ chủng đề kháng và loại kháng sinh bị kháng khá khác nhau theo địa phương cĩ bệnh xảy ra (Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan., 2007) điều này cũng phù hợp với, một nghiên cứu của Crumlish et al. (2002). Kết quả nghiên cứu này cho rằng Vi khuẩn E. ictaluri phân lập trên cá tra nuơi thuộc tỉnh An Giang thì chỉ kháng với Oxolinic acid PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 10 trong khi vi khuẩn được phân lập từ cá nuơi thuộc tỉnh Cần Thơ thì lại cho kết quả kháng với oxytetracyclin và sulphomamid. Đồng thời, cùng với sự nghiên cứu của Depaola et al. (1995) cịn cho thấy số lượng và tỉ lệ chủng đề kháng khác nhau theo mùa vụ nuơi. Ngồi ra, thì sự kháng kháng sinh cũng rất khác nhau giữa các lồi vi khuẩn gây bệnh ví dụ như sự kháng Aminoglycoside của E. coli được phân lập vào mùa xuân thì cao hơn các lồi khác (Depaola et al., 1995). Theo một điều tra của Mattyar et al. (2004) sự kháng thuốc của vi khuẩn cịn khác nhau tùy theo vị trí phân lập được chúng. Kết quả từ nghiên cứu cho thấy vi khuẩn phân lập từ mang của cá thì đã kháng với 7 loại kháng sinh trong khi vi khuẩn phân lập được trong nội tạng thì chỉ kháng với 5 loại kháng sinh. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 11 PHẦN III VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1 Thời gian thực hiện Từ tháng 03/2009 đến tháng 05/2009 3.1.2 Địa điểm Phịng thí nghiệm, khoa thủy sản – Đại Học Cần Thơ. 3.2 Nội dung thực hiện - Xác định chỉ tiêu sinh hĩa bằng kit API 20E. - Lập kháng sinh đồ 3.3. Vật liệu nghiên cứu 3.3.1 Dụng cụ - Đèn cồn, bình xịt cồn, que cấy, giấy vệ sinh, cốc thủy tinh, bút lơng dầu, cân, thước đo, pipet, micropipette, hộp đầu col, đầu col, đĩa Petri, ống nghiệm, chai nấu, ống nhỏ giọt, mơi trường, kính hiển vi, máy ảnh, bút chì, sổ ghi chép. - Tủ ấm, tủ cấy vi khuẩn, tủ lạnh, nồi autoclave, tủ sấy. 3.3.2 Hĩa chất và mơi trường - Mơi trường nuơi cấy vi khuẩn: NA (Nutrient agar), Rimler – shotts , TCBS agar, mơi trường OF(oxidation- fermentation medium) - Nước cất, muối NaCl, cồn tuyệt đối, dầu paraffin, glucose, BaCl2, H2SO4 - Các hĩa chất mơi trường test sinh hĩa: H2O2, giấy test oxydase thương mại, vaselin. - Bộ kit API 20E, ống McFarland 3. - Các loại đĩa thuốc kháng sinh thương mại ( Oxoid, Biorad) dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ: Flofenicol (30µg), Oxolinic acid (2µg), Amoxycillin (25µg), Doxycycline (30µg), Ciprofloxacin (5µg), Norfloxacin ( 10µg), Streptomycin (10µg), Colistin (50µg); đĩa 0/129 (150µg). - Hĩa chất nhuộm gram: PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 12 o Dung dịch 1: crystal violet, ethanol 95 %, ammonium oxalate, nước cất. o Dung dịch 2: iodine, potassium iodide, nước cất. o Dung dịch 3: 95% ethanol:5% acetone. o Dung dịch 4: safranin, ethanol 95%, nước cất. 3.3.3 Đối tượng nghiên cứu. Những chủng vi khuẩn phân lập từ huyết tương tơm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) bị bệnh đục cơ. Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn nghiên cứu STT Kí hiệu mẫu Nguồn gốc phân lập Địa điểm thu Kết quả định danh 1 P2P2N3 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT Aeromonas 2 P2P2N12 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT Aeromonas 3 P2P1N6 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT Aeromonas 4 P2P2N10 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT Aeromonas 5 P2P2N17 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT Aeromonas 6 P2P1N3 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT Aeromonas 7 P2P2N13 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT Aeromonas 8 P2P2N11 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT Aeromonas 9 P2P2N14 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT Aeromonas 10 P2P2N16 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT Aeromonas 11 P2P2N15 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT A. hydrophila 12 P13b1N1 M. rosenbergii Thới Lai-Cần Thơ Aeromonas 13 P2P1N9 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT Enterobacter 14 P2P1N12 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT Enterobacter 15 P2P1N4 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT Enterobacter 16 P2P2N1 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT Pantoea 17 P2P2N4 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT - 18 P2P1N1C M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT - 19 P6M1N3 M. rosenbergii Thới Lai-Cần Thơ - 20 P6M1N4 M. rosenbergii Thới Lai-Cần Thơ - 21 P6M1N12 M. rosenbergii Thới Lai-Cần Thơ - 22 P3P1N16 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT - 23 P3P2N4 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT - 24 P3P2N14 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT - 25 P3P1N10 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT - 26 P6M1N10 M. rosenbergii Thới Lai-Cần Thơ - 27 P6M1N16 M. rosenbergii Thới Lai-Cần Thơ - 28 P3P2N13 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT - 29 P3P1N18 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT - 30 P3P2N19 M. rosenbergii Khu 2-Nơng trường sơng Hậu-CT - CT: Cần Thơ PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 13 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phương pháp xác định chỉ tiêu sinh hĩa - Xác định hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc, tính rịng . - Thực hiện các test cơ bản: nhuộm gram, di động, Oxidase, Catalase, O/F. Phương pháp thực hiện được trình bày chi tiết ở phần phụ lục . - Định danh bằng kit API 20E theo hướng dẫn của nhà sản xuất (BioMerieux) o Cho một ít nước cất hoặc nước máy vào trong khay nhựa của bộ kit để giữ ấm trong quá trình ủ trong tủ ấm. o Đặt kit API vào khay nhựa o Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn: dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý hoặc nước cất tiệt trùng lắc trộn đều. Các bước thực hiện: o Dùng dung dịch vi khuẩn cho vào đầy các ơ CIT, VP và GEL. o Tương tự chi vi khuẩn vào đầy phần tuýp các ơ ADH, LCD, ODC, H2S và URE, kế tiếp cho dầu paraffin vào đầy phần lõm các ơ này. o Tiếp theo dùng dung dịch vi khuẩn cho vào đầy phần tuýp các ơ cịn lại. o Đậy nắp khay và ủ trong tủ ấm ở 26-28oC o Đọc kết quả sau 24-48 giờ - Đọc kết quả: - Kiểm tra và ghi nhận các chỉ tiêu khơng cần thêm thuốc thử. - Kiểm tra kết quả test API 20E - Các chỉ tiêu cần thêm thuốc thử: - Cho một giọt thuốc thử TDA vào ơ TDA, đọc kết quả sau vài giây. - Cho một gọt thuốc thử IND vào ơ IND, đọc kết quả sau vài giây. - Cho một giọt thuốc thử VP1 sau đĩ cho tiếp giọt thuốc thử VP2 vào ơ VP, đọc kết quả sau 10-15 phút. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 14 - Trước khi đọc kết quả , bộ kit API 20E phải đạt tối thiểu 3 chỉ tiêu cho kết quả dương tính. Ngược lại cần ủ mẩu thêm vài giờ. - Sau khi cho thuốc thử vào thì đậy nắp khay nhựa lại. - Khi đã cho thuốc thử vào các chỉ tiêu rồi thì khơng nên ủ lại trong tủ ấm Bảng 3.2: Đọc kết quả bộ kit API 20E. 3.4.2 Phương pháp lập kháng sinh đồ Phương pháp làm kháng sinh đồ nhĩm vi khuẩn bằng phương pháp Kirbry-Bauer (1966), sử dụng mơi trường NA (Nutrient Agar), chọn 8 loại kháng sinh: (Oxoid, Biorad) dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ: Flofenicol (FFC,30µg), Oxolinic acid (2µg), Amoxycilin (25µg), Doxycycline (30µg), Ciprofloxacin (5µg), Norfloxacin ( 10µg), Streptomycin (10µg), Colistin (50µg). Chỉ tiêu Âm tính Dương tính ONPG Khơng màu Vàng ADH Vàng Đỏ/cam LDC Vàng Đỏ/cam ODC Xanh nhạt/vàng Xanh lá/xanh CIT Khơng màu/xám nhạt Vệt đen mãnh H2S Vàng Đỏ/cam URE Vàng Nâu đỏ nhạt TAD Xanh nhạt/vàng Hồng IND Khơng màu Hồng/đỏ VP Khơng cĩ màu đen Khuyếch tán màu đen GEL Xanh/xanh lá Vàng GLU Xanh/xanh lá Vàng MAN Xanh/xanh lá Vàng INO Xanh/xanh lá Vàng SOR Xanh/xanh lá Vàng RHA Xanh/xanh lá Vàng SAC Xanh/xanh lá Vàng MEL Xanh/xanh lá Vàng AMY Xanh/xanh lá Vàng ARA Xanh/xanh lá Vàng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 15 Bảng 3.3: Đường kính chuẩn vịng vơ trùng chủng E.coli LMG8223 (theo NCCLS - National Committee Clinical Laboratory Standard, 1998 & 2004). Thuốc kháng sinh Đường kính vịng vơ trùng (mm) Kháng TB nhạy Nhạy Streptomycin (S, 10µg) ≤11 12 – 14 ≥15 Colistin (Cs, 10µg) ≤ 8 9 – 10 ≥11 Norfloxacin(Nor,10ppm) ≤12 13 – 16 ≥17 Flofenicol (Ffc,30µg) ≤16 17 – 19 ≥20 Oxolinic acid (O, 2µg) ≤10 – ≥11 Amoxycillin (Amx, 30µg) ≤16 17 – 19 ≥20 Doxycycline (Do, 30µg) ≤12 13 – 15 ≥16 Ciprofloxacin (Cip, 5µg) ≤15 16 – 20 ≥21 Các bước lập kháng sinh đồ theo phương pháp của Kirbry-Bauer (1966) Phương pháp xác định mật số vi khuẩn dựa vào ống chuẩn McFarland số 3 Vi khuẩn sau khi được phục hồi và tách rịng đến thuần thì tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ. Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 5 ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng. Trộn đều và so sánh độ đục với ống chuẩn McFarland số 3 (9,7 ml 1% H2SO4 và 0,3 ml 1% BaCl2). Nếu độ đục thấp hơn ống chuẩn McFarland thì tiếp tục cho khuẩn lạc vào, ngược lại nếu độ đục cao hơn thì cho thêm nước muối sinh lý vào cho đến khi độ đục ngang bằng với ống chuẩn McFarland. Khi đĩ mật vi khuẩn trong ống nghiệm vào khoảng 9x108 cfu/ml. Sau khi đã xác định mật số vi khuẩn thì tiến hành cho vi khuẩn lên mơi trường thạch Cách trãi dung dịch vi khuẩn: dùng pipet tiệt trùng hút 0,1ml dung dịch vi khuẩn cho lên mơi trường thạch NA. Dùng que trãi thủy tinh trãi đều đến vừa khơ. Sau đĩ để yên khoảng 1 phút rồi dùng pel tiệt trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa Petri sao cho khoảng cách giữa 2 tâm của các đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa Petri 10-15 mm. Mỗi đĩa Petri (Ө 100 cm) mơi trường đặt tối đa 6 đĩa kháng sinh. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 16 Đọc kết quả Đo đường kính vịng vơ trùng (mm) dựa vào chuẩn đường kính vịng vơ trùng theo NCCLS (National Committee Clinical Laboratory Standard, Bảng 3.3) để xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình nhạy và kháng. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 17 PHẦN VI KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả định danh vi khuẩn bằng bộ kit API 20E Các chủng vi khuẩn sau khi phục hồi từ tủ -80°C được kiểm tra tính rịng qua kết quả nhuộm gram và các chỉ tiêu cơ bản gồm hình dạng, khả năng di động, oxidase, catalase và O/F. Aeromonas Kết quả định danh vi khuẩn Aeromonas được thể hiện ở Bảng 4.1. Nhĩm này gồm cĩ 12 chủng, trong đĩ 1 chủng là Aeromonas hydrophila (P2P2N15 ) cịn lại 11 chủng chỉ định danh được đến giống. Từ Bảng 4.1, ta thấy tất cả các chủng đều cĩ dạng hình que, gram âm (Hình 4.1), dương tính với oxidase, catalase, cĩ khả năng di động, cĩ khả năng lên men trong mơi trường O/F glucose (Hình 4.2) (trừ chủng P10: P2P2N16). Hình 4.1: Hình nhuộm gram của vi khuẩn Aeromonas Ngồi ra, vi khuẩn sau khi tách rịng đều cho khuẩn lạc dạng trịn, hơi nhơ trên mặt thạch agar, cĩ màu vàng kem nhạt trên mơi trường NA (Nutrient agar) và màu vàng trên mơi trường đặc trưng Aeromonas agar (Hình 4.3), đồng thời kháng với 0/129. (Bảng 4.1 và Hình 4.4). Từ kết quả sinh hĩa bằng API 20E (Bảng 4.1), tất cả các chủng đều cĩ khả năng phân giải arginine, sinh indol và sử dụng glucose nhưng khơng cĩ khả năng sử dụng H2S, inositol, urea, khơng cĩ khả năng phân giải ornithin. Đặc biệt hầu hết các chủng đều chỉ sử dụng 2-3 loại đường.(Hình 4.5). Riêng chỉ cĩ 2 chủng P5 và P9 sử dụng nhiều loại hơn các PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 18 chủng cịn lại (glucose, mantose, sorbitol, rhamnose, sucrose, melibiose, arabinose). Bảng 4.1 Các chỉ tiêu sinh lý và kết quả kiểm tra sinh hĩa bằng kit API 20E Ghi chú: (+): phản ứng dương tính; (-): phản ứng âm tính; d: phản ứng thay đổi; k: kháng; q: hình que. ONPG: Ortho-nitrophenyl galactosidase; ADH: Arginine; LDC: Lysine; ODC: Ornithine; CIT: Sodium sitrate; H2S: sinh H2S; URE: Urea; TDA: L- Tryptophane; IND: Indole; VP: phản ứng Voges-Proskauer; GEL: Gelatin; GLU: Glucose; MAN: Manitol; INO: Inositol; SOR: Sorbitol; RHA: Rhamnose; SAC: Sucrose; MEL: Melibiose; AMY: Amygdalin: ARA: Arabinose.Từ P1 – P12: các chủng vi khuẩn P1: P2P2N3 P7: P2P2N13 P2: P2P2N12 P8: P2P2N11 P3: P2P1N6 P9: P2P2N14 P4: P2P2N10 P10: P2P2N16 P5: P2P2N17 P11: P2P2N15 P6: P2P1N3 P12: P13 b1 N1 Chỉ tiêu Chủng vi khuẩn P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 Gram - - - - - - - - - - - - Hình dạng q q q q q q q q q q q q Di động + + + + + + + + + + + + Oxidase + + + + + + + + + + + + Catalase + + + + + + + + + + + + O/F -/+ -/+ +/+ +/+ -/+ +/+ -/+ +/+ +/+ +/- +/+ +/+ O/129 k k k k k k k k k k k k ONPG + + + + + + - + - + + + ADH + + + + + + + + + + + + LDC + + + + + + - + - + + + ODC - - - - - - - - - - - - CIT + + + - + + - - - + + + H2S - - - - - - + - - - - - URE - - - - - - - - - - - - TAD + + + - + + + + - + - + IND + + + + + + + + + + + + VP + + + + + + + + - + - + GEL + + + + + + - + + + + + GLU + + + + + + + + + + + + MAN + + + + + + - + + + + + INO - - - - - - - - - - - - SOR - - - - + - - - + - - - RHA - - - - + - - - + - - - SAC + + + + + + - + + - - - MEL - - - - + - - - + - - + AMY - - - + - + - + - + d - ARA + - - - + - + - + + - d PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 19 Hình 4.2: Khả năng lên men và oxi hĩa trong mơi trường O/F glucose của vi khuẩn Aeromona. (1) (3) (5): Khơng phủ paraffin, kiểm tra tính hiếu khí. (2) (4): Phủ paraffin, kiểm tra khả năng lên men glucose. Hình 4.3:Khuẩn lạc của Aeromonas Hình 4.4: Đường kính vịng vơ trùng của trên mơi trường Aeromonas agar O/129 khi kiểm tra với Aeromonas Hình 4.5: Kết quả test sinh hĩa của Aeromonas bằng kit API 20E. (-): phản ứng âm tính; (+): phản ứng dương tính; 1: Ortho-nitrophenyl galactosidase(+); 2: Arginine (+); 3: Lysine (+); 4: Ornithine (-); 5: Sodium sitrate (+); 6: sinh H2S (-); 7: Urea (-); 8: L-Tryptophane (+); 9: Indole(+); 10: phản ứng Voges-Proskauer(+); 11: Gelatin(+); 12: Glucose(+); 13: Manitol (+); 14: Inositol(-); 15: Sorbitol(-); 16: Rhamnose(-); 17: Sucrose(-); 18: Melibiose(+); 19: Amygdalin(-): 20: Arabinose: phản ứng thay đổi. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 20 Enterobacter Kết quả định danh Enterobacter thể hiện ở Bảng 4.2. Nhĩm này gồm 3 chủng, khơng xác định được đến lồi mà chỉ định danh được đến giống. Cả 3 chủng vi khuẩn này rất giống nhau về đặc tính sinh lý cũng như sinh hĩa. Bảng 4.2 Chỉ tiêu sinh lý và kết quả test API 20E của Enterobacter Chỉ tiêu Vi khuẩn P2P1N9 P2P1N4 P2P1N12 Gram - - - Hình dạng q q q Di động + + + Oxidase - - - Catalase + + + O/F +/+ +/+ +/+ ONPG + + + ADH + + + LDC - - - ODC + + + CIT + + + H2S - - - URE - - - TAD - - - IND - - - VP + + - GEL - - - GLU + + + MAN + + + INO - - - SOR - - - RHA + + + SAC + + + MEL - - - AMY + + + ARA + + + Ghi chú: (+): phản ứng dương tính; (-): phản ứng âm tính; d: phản ứng thay đổi; k: kháng; q: hình que ngắn. ONPG: Ortho-nitrophenyl galactosidase; ADH: Arginine; LDC: Lysine; ODC: Ornithine; CIT: Sodium sitrate; H2S: sinh H2S; URE: Urea; TDA: L-Tryptophane; IND: Indole; VP: phản ứng Voges-Proskauer; GEL: Gelatin; GLU: Glucose; MAN: Manitol; INO: Inositol; SOR: Sorbitol; RHA: Rhamnose; SAC: Sucrose; MEL: Melibiose; AMY: Amygdalin: ARA: Arabinose PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 21 Từ Bảng 4.2, cả 3 chủng đều là vi khuẩn gram (-), hình que, di động, cĩ khả năng lên men và oxi hĩa glucose, âm tính với oxidase và catalase dương tính. Tất cả các chỉ tiêu đều hồn tồn giống nhau (chỉ cĩ VP của P2P1N12 là âm tính khác với 2 chủng cịn lại(+)), cĩ khả năng sử dụng citrate, các loại đường glucose, mantose, arabinose, sucrose, rhamnose và tạo men Beta-galactosidase; cĩ khả năng phân giải arginine, ornithine; khơng tạo H2S và khơng cĩ khả năng sinh indol. Pantoea Nhĩm này chỉ cĩ một chủng và cũng chỉ định danh được đến giống. Đặc trưng của nhĩm này là hình que ngắn, gram âm, di động, cĩ khả năng lên men, oxi hĩa đường O/F glucose, dương tính với catalase ngược lại oxidase âm tính. Cĩ khả năng sử dụng glucose, mantose, sorbitol, sucrose, arabinose và tạo men Beta- galactosidase. Cịn lại tất cả các chỉ tiêu đều âm tính trừ VP (+) (Bảng 4.3). Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra sinh lý và test API của Pantoea Chỉ tiêu P2P2N1 Gram - Hình dạng Que ngắn Di động + Oxidase - Catalase + O/F +/+ ONPG + ADH - LDC - ODC - CIT - H2S - URE - TAD - IND - VP + GEL - GLU + MAN + INO - SOR + RHA - SAC + MEL - AMY - ARA + PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 22 4.2 Kết quả kháng sinh đồ. Các chủng vi khuẩn được kiểm tra với 8 loại kháng sinh: Streptomycin (S, 10µg), Colistin (CS,10µg), Norfloxacin (NOR,10ppm), Flofenicol (FFC,30µg), Oxolinic acid (O, 2µg), Amoxycilline (AMX,30µg), Doxycycline (DO,30µg), Ciprofloxacin (CIP,5µg). Qua biểu đồ cho thấy cả 3 nhĩm vi khuẩn đều nhạy với norfloxacin, doxycycline, flofenicol, colistin, streptomycin và ciprofloxacin ngược lại oxolinic acid và amoxicillin thì bị kháng. Tuy nhiên, oxolinic acid chỉ cĩ một nhĩm kháng thuộc Aeromonas với tỉ lệ tương đối thấp là 8,33 %. Riêng amoxicillin chiếm tỉ lệ kháng cao với cả 3 nhĩm vi khuẩn. Trong đĩ Aeromonas và Pantoea là kháng hồn tồn chiếm 100% cịn Enterobacter cũng kháng đến 66,67%. Nhưng xét một cách tổng thể tính nhạy của vi khuẩn phân lập từ huyết tương tơm càng đục cơ đối với kháng sinh cũng khá cao, vịng vơ trùng cũng tương đối lớn (Hình 4.7) 0 0 0 0 0 0 8.33 0 0 0 0 0 100 66.67 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tỉ lệ kháng(%) NOR DO OA FFC AMX CS S CIP Tên thuốc Aeromonas Enterobacter Pantoea Hình 4.6: Biểu đồ thể hiện tính kháng của vi khuẩn đối với từng loại kháng sinh. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 23 Hình 4.7: Tính nhạy của Enterobacter với kháng sinh Kết quả từ Bảng 4.4 thấy được cả 3 nhĩm vi khuẩn đều nhạy với norfloxacin nhưng Aeromonas cĩ đường kính vịng vơ trùng dao động khá nhiều từ 19 – 39mm trong đĩ chỉ cĩ 1 chủng đường kính khơng lớn lắm là P2P2N3 (19mm). Hai nhĩm vi khuẩn cịn lại đường kính vịng vơ trùng cũng tương đối lớn (26-37mm). Đối với flofenicol thì nhĩm Aeromonas khá nhạy, đường kính vịng vơ trùng tương đối đều nhau ( 29-44mm), nhĩm Enterobacter cũng rất đều nhưng tính nhạy khơng cao (24-26mm) và thấp nhất là nhĩm Pantoea (P2P2N1) cĩ 1 chủng duy nhất nhạy ở cấp trung bình (20mm). Ciprofloxacin cĩ đường kính lớn nhất trong 8 loại thuốc kháng sinh, lớn nhất là 45mm thuộc Aeromonas (P2P2N13), khoảng dao động của đường kính từ 23-45mm. Tính mẫn cảm của vi khuẩn đối với doxycyline, colistin và streptomycin, oxolinic acid cũng khá cao. Doxycyline, colistin và streptomycin chỉ cĩ 1 chủng nhạy trung bình và oxolinic acid cũng chỉ cĩ một chủng kháng là Aeromonas (P2P2N3) cịn lại tất cả đều nhạy. Tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với oxolinic acid tương đối lớn, dao động từ 24-34mm. Những chủng mẫn cảm cao đều là Aeromonas (P2P2N10, P2P2N13, P2P2N16, P2P2N15) đồng thời những chủng ít mẫn cảm đã cĩ 3 chủng là Aeromonas (P2P1N6, P2P2N11, P2P2N14) và một chủng ít mẫn cảm nữa thuộc nhĩm P2P1N9 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 24 Pantoea (P2P2N1). Cịn lại 3 chủng Enterobacter cĩ khoảng đường kính rất đều nhau ( 24-26mm). Bảng 4.4 Đường kính vịng vơ trùng của 16 dịng vi khuẩn đối với kháng sinh. Ghi chú: 1-12 là Aeromonas; 13-15: Enterobacter; 16: Pantoea S: Streptomycin, CS: Colistin, NOR: Norfloxacin, FFC: Flofenicol, OA: Oxolinic acid, AMX: Amoxycillin, DO: Doxycycline, CIP: Ciprofloxacin. Tính nhạy, kháng, trung bình nhạy dựa vào đường kính chuẩn Bảng 3.3 Phần III) Colistin khơng cĩ chủng nào kháng lại tuy nhiên tính nhạy khơng cao, đường kính vịng vơ trùng tương đối nhỏ, dao động khoảng 10-12mm khá nhiều lớn nhất cũng chỉ cĩ 16mm thuộc nhĩm Aeromonas (P2P2N10 ) và duy nhất chỉ cĩ một chủng trung bình nhạy cũng thuộc Aeromonas, P2P1N3 (10mm). Như colistin, streptomycin cũng hồn tồn khơng bị kháng nhưng tính nhạy cũng khơng cao khoảng dao động từ 15-24mm, nhạy nhất là ở 24mm thuộc nhĩm Aeromonas (P2P2N13) và thấp nhất là trung bình nhạy (14mm) cũng là Aeromonas (P2P2N17). STT Chủng NOR (mm) DO (mm) OA (mm) FFC (mm) AMX (mm) CS (mm) S (mm) CIP (mm) 1 P2P2N3 19 16 0 33 10 11 18 23 2 P2P2N12 27 28 28 32 0 11 17 30 3 P2P1N6 22 26 14 29 14 15 18 22 4 P2P2N10 34 30 30 33 11 16 21 34 5 P2P2N17 27 24 26 33 8 11 14 29 6 P2P1N3 31 27 27 31 0 10 17 35 7 P2P2N13 36 32 34 44 14 15 24 45 8 P2P2N11 27 22 12 35 9 12 17 29 9 P2P2N14 27 28 13 35 10 11 18 27 10 P2P2N16 30 30 30 35 14 11 20 35 11 P2P2N15 39 28 30 35 15 12 18 40 12 P13b1N1 34 29 29 35 9 11 20 37 13 P2P1N9 26 20 24 25 13 12 20 26 14 P2P1N12 25 13 26 26 17 12 15 29 15 P2P1N4 37 16 25 24 12 12 20 42 16 P2P2N1 31 22 14 20 12 12 19 32 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 25 Với doxycyline, tuy khơng cĩ chủng nào kháng nhưng đường kính vịng vơ trùng tương đối khơng lớn lắm (13-32mm) khoảng dao động từ 13-27mm khá nhiều. Riêng amoxycilin bị kháng hầu như hồn tồn (93,75%) 15 chủng bị kháng và chủng cịn lại cũng chỉ mẫn cảm trung bình (P2P1N12) thuộc nhĩm Aeromonas. Nhìn chung, từ kết quả kháng sinh đồ cho thấy tính kháng thuốc của vi khuẩn chỉ xảy ra đối với amoxycillin, các thuốc cịn lại đều nhạy, riêng chỉ cĩ 1 chủng thuộc Aeromonas kháng với oxolinic acid. Nhưng cũng cần lưu tâm đến colistin khi sử dụng vì tính nhạy tương đối thấp. Xét trên những nhĩm nhạy, thì ciprofloxacin cĩ đường kính vịng vơ trùng lớn nhất kế đến là flofenicol, thấp nhất là colistin và streptomycin. Như vậy, những vi khuẩn phân lập từ huyết tương tơm càng xanh bị đục cơ vẫn cịn mẫn cảm cao với kháng sinh trừ amoxicillin. Hầu hết kháng sinh vẫn cịn hiệu lực đối với những vi khuẩn này. Từ kết quả trên cho thấy, khơng nên sử dụng amoxycillin trong ao càng xanh bị đục cơ trong bất kì trường hợp nào vì tỉ lệ kháng thuốc khá cao sẽ hạn chế tác dụng của thuốc hoặc khơng cĩ tác dụng khi điều trị. Trong 16 chủng vi khuẩn kiểm tra kháng sinh đồ thì đã cĩ 12 chủng là Aeromonas. Tính mẫn cảm của Aeromonas đối với 8 loại kháng sinh kiểm tra cũng khá tương tự với nhiều kết quả nghiên cứu trước đây. Kết quả kháng sinh đồ nghiên cứu trên 10 dịng Aeromonas phân lập từ mẫu nước vùng nước ngọt Bangladesh cũng kháng với Amoxycillin và nhạy với Streptomycin (Bazlur & Valerie, 1994). Lê Trung Tín (2007) thì cho rằng A.hydrophila khá nhạy với oxolinic acid, doxycycline nhưng chỉ nhạy trung bình đối với norfloxacin và streptomycin. Ngồi ra, Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008) thì cho rằng A.hydrophila kháng với amoxicillin, và cả doxycylin. Qua nhiều nghiên cứu lại cho nhiều kết luận cĩ phần trái ngược nhau. Cĩ thể nĩi, mỗi vùng và mỗi thời điểm lượng kháng sinh sử dụng sẽ khác nhau nên kết quả nghiên cứu cũng cĩ thể khác nhau. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 26 PHẦNV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Qua kết quả kiểm tra hình thái sinh hĩa bằng nhuộm gram, tính di động, test các phản ứng cơ bản Oxidase, catalse, O/F, O/129 và bằng bộ kit API 20E đã xác định được 12 chủng là Aeromonas trong đĩ cĩ 1 chủng là A. hydrophila (P2P2N15), 3 chủng là Enterobacter (P2P1N9, P2P1N12, P2P1N4) và 1 chủng là Pantoea (P2P2N1). Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ nhìn chung đều dễ mẫn cảm với Norfloxacin, Docycycline, Oxolinic acid, Flofenicol, Colistin, Streptomycin, Ciprofloxacin, chỉ cĩ 1 chủng Aeromonas (P2P2N3) kháng với oxolinic acid. Riêng amoxycillin thì kháng gần như hồn tồn chiếm tỉ lệ 93,75%. 5.2 Đề xuất Do thời gian đề tài cĩ hạn nên các nghiên cứu tiếp theo cần tạo điều kiện tiến hành trên diện rộng hơn với các tỉnh đồng bằng sơng Cửu Long để tìm hiểu sự đa dạng vi khuẩn trên mầm bệnh đục cơ. Nghiên cứu MIC với các kháng sinh trong kháng sinh đồ để xác định được lượng kháng sinh phù hợp khi sử dụng. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Bùi Quang Tề, Đỗ Thị Hịa, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội. 2004. Bệnh học thủy sản. Nhà xuất bản nơng nghiệp – TPHCM. 2 Bùi Việt Hùng. Tổng quan bệnh đuơi trắng ở tơm Càng Xanh - Tơm - Nơng nghiệp Việt Nam. 3 Crumlish, Tu Thanh Dung, J.F Turnbull, Nguyen Thi Nhu Ngoc, H.W Ferguson. 2002. Indentification of E. ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypothalamus culture in the MeKong Dalta VietNam, 25, 733 – 736. 4 Đặng Thị Hồng Oanh, Đồn Nhật Phương, Nguyễn Thanh Phương, Nguyễn Thị Thu Hằng. 2006. Xác định vị trí phân loại và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tơm sú (Penaeus monodon). 5 Đặng Thị Hồng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, Temdoung Somsiri, Supranee Chinabut, Fatimah Yussoff, Mohamed Shariff, Kerry Bartie, Geert Huys, Mauro Giacomini, Stefania Berton, Jean Swingsand Alan Teale. 2005. Xác định tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ các hệ thống nuơi thủy sản ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long, Việt Nam. Tạp chí Nghiên Cứu Khoa Học, 2005. 4 x-y. 6 Depaola A., James T. Peeler and Gary E. Rodrick.. 1995. Effect of Oxytetraxycline-Medicated Feed on Antibiotic Resistance of Gram- Negative Bacteria in Catfish Ponds. Applied and Environmental Microbiology, June 1995, p. 2335-2340. 7 Depaola, A., Pauline, A. Flynn, R. Merrill McPhearson and Stuart B. Levy. 1988. Phenotypic and Genotypic Characterization of Tetracycline and Oxytetraxycline Resistance Aeromonas hydrophila from Cultured Channel Catfish (Ictalurus punctatus) and their Environments. Applied and Environmental Microbiology, July 1988, p. 1861-1863. 8 Hameed, A.S.S.2003. White tail disease. 9 Hsieh, C.Y., Z.B. Wu, M.C. Tung, CTu, S.P. Lo, T.C. Chang, C.D. Chang, S.C. Chen. In situ hybridization and RT-PCR detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man), in Taiwan. Journal of Fish Diseases Volume 29 Issue 11 Page 665 - November 2006. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 28 10 Kumar, G.R. ,. V.Rao, K.R.S.S. Rao. 2004. Appendage deformity syndrome-anutritional diease of Macrobrachium rosenbergii. Disease of aquatic Organism. Vol.59: 75-78. 11 Lê Trung Tín. 2007. Độ nhạy và nồng độ diệt khuẩn của kháng sinh với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra giống (Pangasianodon hypothalamus). Thực tập tốt nghiệp đại học. Khoa thủy sản – ĐHCT. 12 Lightner , D.V. 1996. A handbook of pathology and Diagnostic Procedures for disease of Penaed shimp. World Aquaculture Society. 13 Mai Văn Tài, Tống Hồi Nam, Lý Thị Thanh Loan, Phạm Văn Tình…2004. Điều tra đánh giá hiện trạng các loại thuốc, hĩa chất và chế phẩm sinh học dung trong nuơi trồng thủy sản nhằm đề xuất các giải pháp quản lý. Báo cáo đề tài khoa học, Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản 1. 24 trang. 14 Mattyar F., S. Dincer, A. Kaya, and Ư. Çolak. 2004. Prevalence and resistance to antibiotics in Gram negative bacteria isolated from retail fish in Turkey, Annals of Microbiology, 54 (2), p.151-160. 15 Mohamed Nawaz, Kindon Sung, Saeed A. Khan, Ashraf A. Khan, and Roger Steele. 2006. Biochemical and Molecular Characterization of Tetracycline-Resistance Aeromonas veronii Isolates from Catfish. Applied and Environmental Microbiology, Oct 2006, p. 6461-6466. 16 Nguyễn Kim Cương. 2006. Khảo sát kí sinh trùng, mơ học và thử nghiệm cảm nhiễm bệnh đốm trắng trên tơm càng xanh nuơi ruộng lúa. Luận văn tốt nghiệp Đại học. Khoa thủy sản – Đại học Cần Thơ. 17 Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan. 2007. Phân lập và khảo sát đặc điểm kháng sinh của Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasius hypophthamus) nuơi thâm canh. Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Nơng Lâm Nghiệp số 1&2/2007. Trang 175-179. 18 Nguyễn Thị Thúy Hằng. 2008. Tiêu chuẩn hĩa phương pháp lập kháng sinh đồ trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila tại khoa thủy sản. Luận văn tốt nghiệp Đại học. Khoa thủy sản – Đại học Cần Thơ. 19 Nguyễn Thị Đẹp, Chi cục thuỷ sản Cần Thơ. 20 Pender J. and E.E. Stobberingh.2008. Antibiotic Resistaceof motile Aeromonads in indoor catfish and farms in the southern part of th PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 29 Nethelands. International journal of Antimicrobial Agents, March 2008, p.261-265. 21 Sahul Hameed, A.S. 2005. White Tail Disease - disease card. Developed to support the NACA/FAO/OIE regional quarterly aquatic animal disease (QAAD) reporting system in the Asia-Pacific. NACA, Bangkok, Thailand. 7 pp. 22 Sahul Hameed, A.S., K. Yoganandhan, J. Sri Widada, J.R. Bonami. 2004. Experimental transmission and tissue tropismof Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and its associated extra small virus (XSV). Disease of aquatic organisms. pp. 191-196. 23 Stock I., and B. Wiedemann. 2001. Natural Antibiotic susceptibilities of Edwardsiella tarda, E. ictaluri and E. hoshinac. Antibiomicrobial Agenrs and chemotherapy, Aug, 2001, P.2245-2255. 24 Tài liệu hứơng dẫn thực tập giáo trình chuyên mơn Bệnh học thủy sản 1. 2008. 25 Thơng tấn xã Việt Nam. Diện tích nuơi tơm càng xanh ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long tăng gấp 10 lần. 26 Triệu Thanh Tuấn. 2006. Khảo sát mối quan hệ giữa kiểu gen của White spots syndrome (WSSV) với bệnh đốm trắng trên tơm sú (Penaeus monodon) nuơi tại Bạc Liêu và Cà Mau. Luận văn tốt nghiệp. Khoa thủy sản – Đại học Cần Thơ. 45 trang. 27 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hồng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa. 2005. Giáo trình Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản- Trường Đại Học Cần Thơ 28 Từ Thanh Dung. 2008. Bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sinh. Khoa thủy sản – Đại Học Cần Thơ. 29 Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản I. 1998 30 Waltman W.D. and E.B. Shotts. 1986. Antibiomicrobial susceptibility of Edwardsiella ictaluri, Journal of U’ildife Disrasrs.21(21.1986), pp17: 3- 17. 31 Wang C.S., J.S. Chang, H.H. Shih and S.N. Chen. 2007. RT-PCR amplification and sequence analysis of extra small virus associated with white tail disease of Macrobrachium rosenbergii (de Man) cultured in Taiwan. Journal of Fish Diseases 2007, 30, 127-132. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 30 32 Xianle, Y. and Huang, Y. 2003. The status and treatment of serious disease of freshwater prawn and crabs in China. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 31 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A v Cách pha dung dịch nhuộm gram + Dung dịch 1: Crystal violet 2g Ethanol 95 % 20ml Ammonium oxalate 0,8g Nước cất. 80ml Hịa tan crystal violet trong ethanol, hịa tan ammoniumoxalat trong nước cất. Trộn dung dịch lại để yên sau 24h rồi lọc. + Dung dịch 2: Iodine 1g Potassium iodide 2g Nước cất. 300ml Hịa tan Potassium iodide trong 20ml nước cất. Cho them iodine vào và để yên qua đêm. Sau đĩ cho thêm thể tích cịn lại. + Dung dịch 3: Pha dung dịch theo tỉ lệ 95% ethanol : 5% acetone. + Dung dịch 4 Safranin 0,25g Ethanol 95% 10ml Nước cất 90ml Hịa tan Safranin trong ethanol sau đĩ cho nước cất vào. Cách pha ống chuẩn McFarland: 1%H2SO4 & 1% BaCl2 Ống McFarland 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1% BaCl2 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1%H2SO4 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0 Mật độ vi khuẩn khoảng ( x 108) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 20 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 32 v Nhuộm Gram Cho một giọt nước muối sinh lý lên lame. Dùng que cấy triệt trùng lấy một ít khuẩn lạc trãi đều lên lame. Để lame khơ tự nhiên. Hơ lướt lame lên ngọn đèn cồn, để cố địnhvi khuẩn, để nguội. Nhuộm Crystal violet (dd1) khoảng 1 phút, rữa lame bằng nước. Nhuộm iodine (dd2) trong 1 phút, rửa lame bằng nước. Rửa lame bằng dung dịch alcohol/acetone (dd3) từ 2-3 giây. Rửa lame lại bằng nước sạch. Nhuộm safranin (dd4) khoảng 2 phút, rửa lại bằng nước sạch và để khơ. Quan sát lame trên kính hiển vi quang học (40X và 100X) Vi khuẩn Gram (+): màu xanh / tím. Vi khuẩn Gram (-): màu hồng v Tính di động Cho Vaseline lên 4 gĩc của lamelle và đặt ngữa lamelle lên bàn. Dung pipet tiệt trùng nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên lamelle. Tiệt trùng que cấy, lấy một ít khuẩn lạc hịa tan vào giọt nước muối trên lamelle. Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame khơng chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn. Cẩn thận lật nhanh lame để giọt nước được treo ngược trên lamelle Đặt lame lên kính hiển vi, quan sát tính di động của vi khuẩn ở vật kính 40X v Phản ứng Oxidase Chạm nhẹ que thử oxidase vào một khuẩn lạc trên đĩa agar hoặc dung que cấy nhặt một khuẩn lạc cho tiếp xúc trên que thử oxidase Quan sát que thử trong 30 giây và quan sát sự thai đổi màu sắc: que thử chuyển màu xanh đậm cho phản ứng oxidase dương tính (+) và khơng chuyển màu âm tính (-). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 33 v Phản ứng Catalase Nhỏ một giột dung dịch H2O2 3% lên lame. Dung que cấy triệt trùng lấy một ít vi khuẩn cho vào dung dịch H2O2 3% Phản ứng Catalase dương tính cĩ hiện tượng sủi bọt, catalase âm tính khơng sủi bọt. v Khả năng lên men và oxy hĩa đường glucose (O-F test) Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa mơi trường O/F đã tiệt trùng. Dung que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn trên đĩa agar và cấy thẳng vào 2 ống nghiệm chứa mơi trường O/F, sau đĩ phủ 0,5-1 ml dầu paraffin tiệt trùng vào một ống nghiệm tạo điều kiện yếm khí trong ống nghiệm (F), ống cịn lại sẽ kiểm tra tính hiếu khí của vi khuẩn (O). Để 2 ống nghiệm vào trong tủ ấm 28-30oC. Đọc kết quả sau 1-7 ngày Lên men (F) khi ống cĩ phủ dầu paraffin chuyển màu vàng. Oxy hĩa (O) khi ống khơng cĩ phủ dầu paraffin chuyển sang màu vàng Khơng phản ứng khi 2 ống nghiệm đều màu xanh. Bảng kiểm tra kết quả test O/F Ống tiếp xúc với khơng khí Ống phủ dầu paraffin Kết quả Xanh lá cây Xanh lá cây Khơng phản ứng với glucose Xanh lơ ở phần trên Xanh lá cây Phản ứng kiềm tính Vàng Xanh lá cây Phản ứng oxy hĩa Vàng Vàng Phản ứng lên men PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 34 v Phương pháp định danh vi khuẩn bằng bộ kit API 20E (BIOMÉRIEUS). Cho một ít nước cất hoặc nước máy vào trong khay nhựa của bộ kit để giữ ấm trong quá trình ủ trong tủ ấm. Đặt kit API vào khay nhựa Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn: dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý hoặc nước cất tiệt trùng lắc trộn đều. Các bước thực hiện: Dùng dung dịch vi khuẩn cho vào đầy các ơ CIT, VP và GEL. Tương tự chi vi khuẩn vào đầy phần tuýp các ơ ADH, LCD, ODC, H2S và URE, kế tiếp cho dầu paraffin vào đầy phần lõm các ơ này. Tiếp theo dùng dung dịch vi khuẩn cho vào đầy phần tuýp các ơ cịn lại. Đậy nắp khay và ủ trong tủ ấm ở 26-28oC Đọc kết quả sau 24-48 giờ Đọc kết quả: Kiểm tra và ghi nhận các chỉ tiêu khơng cần thêm thuốc thử. Các chỉ tiêu cần thêm thuốc thử: Cho một giọt thuốc thử TDA vào ơ TDA, đọc kết quả sau vài giây. Cho một gọt thuốc thử IND vào ơ IND, đọc kết quả sau vài giây. Cho một giọt thuốc thử VP1 sau đĩ cho tiếp giọt thuốc thử VP2 vào ơ VP, đọc kết quả sau 10-15 phút. Trước khi đọc kết quả , bộ kit API 20E phải đạt tối thiểu 3 chỉ tiêu cho kết quả dương tính. Ngược lại cần ủ mẩu them vài giờ. Sau khi cho thuốc thử vào thì đậy nắp khay nhựa lại. Khi đã cho thuốc thử vào các chỉ tiêu rồi thì khơng nên ủ lại trong tủ ấm Kiểm tra kết quả test API 20E PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 35 Bảng đọc kết quả test API 20E Chỉ tiêu Thành phần Phản ứng/enzyme Âm tính Dương tính ONPG Ortho-nitrophenyl galactosidase Β-galactosidase Khơng màu Vàng ADH Arginine Arginine hidrolate Vàng Đỏ/cam LDC Lysine Lysine decarboxylate Vàng Đỏ/cam ODC Ornithine Ornithine decarboxylate Xanh nhạt/vàng Xanh lá/xanh CIT sodium citrate Sử dụng citrate Khơng màu/xám nhạt Vệt đen mãnh H2S Sodium Thiosulphate Sản phẩm H2S Vàng Đỏ/cam URE Urea Men urease Vàng Nâu đỏ nhạt TAD L-Tryptophane Tryptophane deaminase Xanh nhạt/vàng Hồng IND L-Tryptophane Sản phẩm indole Khơng màu Hồng/đỏ VP Sodium Pyruvate Sản phẩm acetone Khơng cĩ màu đen Khuyếch tán màu đen GEL Gelatin Gelatinase Xanh/xanh lá Vàng GLU D-glucose Lên men/oxh glucose Xanh/xanh lá Vàng MAN D-manitol Lên men/oxh manitol Xanh/xanh lá Vàng INO Inositol Lên men/oxh Inositol Xanh/xanh lá Vàng SOR D-sorbitol Lên men/oxh sorbitol Xanh/xanh lá Vàng RHA L-Rhamnose Lên men/oxh Rhamnose Xanh/xanh lá Vàng SAC D-sucrose Lên men/oxh sucrose Xanh/xanh lá Vàng MEL D-melibiose Lên men/oxh melibiose Xanh/xanh lá Vàng AMY Amygdalin Lên men/oxh Amygdalin Xanh/xanh lá Vàng ARA L-arabinose Lên men/oxh arabinose anh/xanh lá Vàng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 36 PHỤ LỤC B Kết quả đường kính vịng vơ trùng của thuốc kháng sinh lập kháng sinh đồ và đường kính test O/129. Ghi chú: S: Streptomycin ( 10µg), CS: Colistin (10µg), NOR: Norfloxacin (10µg), FFC: Flofenicol (30µg), OA: Oxolinic acid (2µg), AMX: Amoxycilin ( 30µg), DO: Doxycycline (30µg), CIP: Ciprofloxacin (5µg) STT Chủng NOR DO OA FFC AMX CS S CIP 0/129 1 P2P2N3 19 16 0 33 10 11 18 23 15 2 P2P2N12 27 28 28 32 0 11 17 30 15 3 P2P1N6 22 26 14 29 14 15 18 22 12 4 P2P2N10 34 30 30 33 11 16 21 34 14 5 P2P2N17 27 24 26 33 8 11 14 29 9 6 P2P1N3 31 27 27 31 0 10 17 35 9 7 P2P2N13 36 32 34 44 14 15 24 45 14 8 P2P2N11 27 22 12 35 9 12 17 29 15 9 P2P1N9 26 20 24 25 13 12 20 26 20 10 P2P2N1 31 22 14 20 12 12 19 32 15 11 P2P1N4 37 16 25 24 12 12 20 42 22 12 P2P1N12 25 13 26 26 17 12 15 29 0 13 P2P2N4 18 19 19 10 20 10 17 21 16 14 P2P1N1C 38 30 30 35 10 12 19 39 12 15 P2P2N14 27 28 13 35 10 11 18 27 15 16 P2P2N16 30 30 30 35 14 11 20 35 12 17 P2P2N15 39 28 30 35 15 12 18 40 15 18 P6M1N3 30 21 21 16 0 11 16 23 16 19 P6M1N4 26 17 0 19 23 12 20 25 24 20 P6M1N12 29 16 0 21 19 11 21 29 20 21 P3P1N16 24 24 26 22 32 12 17 30 24 22 P3P2N4 20 26 20 15 23 11 15 20 15 23 P3P2N14 27 16 0 20 18 12 21 27 16 24 P3P1N10 0 11 0 0 0 10 0 0 0 25 P6M1N10 30 22 23 20 9 11 17 30 15 26 P13b1N1 34 29 29 35 9 11 20 37 15 27 P6M1N16 26 24 0 11 25 12 20 27 24 28 P3P2N13 27 20 20 20 9 11 17 28 16 29 P3P1N18 26 10 0 19 20 11 18 30 16 30 P3P2N19 25 13 23 22 11 12 18 40 15 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version