Chapter 42: Choosing Microorganisms for Industrial Microbiology and Biotechnology

Click to edit Master title style Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level 12/23/2013 ‹#› MINISTRY OF INDUSTRY AND TRADEHO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF FOOD INDUSTRY FACULITY OF BIOTECHNOLOGY AND ENVIRONMENTAL ENGINEERINGMICROBIOLOGY Chapter 42: Students: Group 16 Lecture: Quynh Mai, Nguyen Thi Ho Chi Minh City, December, 2013 Choosing Microorganisms for Industrial Microbiology and Biotechnology Danh sách các thành viên nhóm 16 STT Họ & tên MSSV 1 Trần Hoài Tâm (NT) 2008120178 2 Nguyễn Thị Lang 2008120154 3 Ngô Thị Như Sương 2008120181 4 Nguyễn Thị Lập 2008120139 Choosing Microorganisms forIndustrial Microbiology and Biotechnology II. Thao tác di truyền trên vi sinh vật (Genetic Manipulation of Microorganisms) III. Bảo quản vi sinh vật (Preservation of Microorganisms) Tìm kiếm VSV trong tự nhiên (Finding Microorganisms in Nature) Nhiệm vụ đầu tiên cho một nhà VSV học công nghiệp là việc tìm thấy một loài vi sinh vật phù hợp, để sử dụng trong các quá trình mong muốn. Một loạt các phương pháp tiếp cận đã có sẵn như: phân lập VSV từ môi trường đến việc sử dụng kỹ thuật phân tử tinh vi để sửa đổi một VSV hiện có. LỰA CHỌN LOÀI VSV CHO VSV CÔNG NGHIỆP VÀ CNSH Lời mở đầu I. Tìm kiếm VSV trong tự nhiên(Finding Microorganisms in Nature) Trái cây hỏng ái cây Bánh Mì Nước Đất Môi trường nuôi cấy vi sinh vật để sử dụng trong công nghiệp vi sinh vật TỰ NHIÊN I. Tìm kiếm VSV trong tự nhiên(Finding Microorganisms in Nature) VSV học ngày càng phát triển,các loài VSV được khám phá nhiều hơn với những đặc tính hữu ích và ứng dụng tộng rãi trong công nghiệp vi sinh và công nghệ sinh học Các VSV tham gia vào các mối quan hệ tương hỗ và có sự hợp tác sơ khai với các VSV khác, cả với thực vật và động vật bậc cao Các phản ứng sinh học vẫn đang tiếp tục được chú trọng trong mọi lĩnh vực , việc tổ chức nghiên cứu ra các tiềm năng mới đang được phổ biến. Loài Ước tính tổng số loài Số loài đã biết % Viruses 130.000b 5.000 [4]c Archaea ?d <500 ? Bacteria 40.000b 4,800 [12] Fungi 1,500,000 69,000 5 Alage 60,000 40,000 67 Bảng 42.1. ƯỚC TÍNH TỔNG SỐ LOÀI VÀ SỐ LOÀI ĐÃ BIẾT ĐƯỢC TỪ CÁC NHÓM VSV KHÁC NHAU Môi trường Ước tính phần trăm nuôi cấy Nước biển 0.001 – 0.100 Nước ngọt 0.25 Hồ trung dưỡng 0.1 – 1.0 Nước ở cửa sông bị ô nhiễm 0.1 – 3.0 Bùn hoạt tính 1 – 15 Trầm tích 0.25 Đất 0.3 Bảng 42.2: Ước tính về phần trăm vi sinh vật "nuôi cấy" trong các môi trường khác nhau Đột biến (Mutation) Sự dung hợp tb trần Kĩ thuật di truyền tự nhiên Sửa đổi biển hiện gen Chuyển giao thông tin di truyền giữa các VSV khác nhau Chèn chuỗi DNA ngắn Nội dung chính II. Thao tác di truyền trên vi sinh vật(Genetic Manipulation of Microorganisms) www.themegallery.com Company Logo II.1 Đột biến (Mutation) 1943, chủng Penicillium chrysogenum được phân lập là NRRL 1951-đã được cải thiện hơn thông qua đột biến. Môi trường nuôi cấy đầu tiên của Penicillium notatum, có thể được phát triển trong những điều kiện tĩnh, mang lại nồng độ Penicillin thấp. Một loạt các kỹ thuật có thể được sử dụng để cải thiện môi trường nuôi cấy (chất gây đột biến hóa học và tia cực tím) Hình 42.1 Đột biến làm tăng năng suất lên men. Tác nhân gây đột biến Vật lý (nhiệt độ, tia X, UV, ….) Hóa học (5BU, consisin, nicotine, dioxine,…) II.2 Sự dung hợp tế bào trần II.2 Phân loại Sử dụng rộng rãi ở nấm men và nấm mốc Chất tái tổ hợp mong muốn được xác định bằng các phương tiện kỹ thuật cấy ria chọn lọc VSV SS vô tính làm giảm cơ hội của ĐB ngẫu nhiên có thể dẫn đến chủng thoái hóa Protoplasts sau đó được tái sinh sử dụng, giúp ổn định thẩm thấu như sucrose. protoplasts được tổng hợp bằng cách phát triển tế bào trong một dung dịch đẳng trương trong khi xử lý chúng với enzym, bao gồm cellulase và beta-galacturonidase www.themegallery.com Company Logo II.2 Sự dung hợp tế bào trần - Sau khi tế bào tái sinh, sản phẩm chất nguyên sinh phản ứng tổng hợp mới có thể được sử dụng trong nghiên cứu tiếp theo. - Một lợi thế lớn của kỹ thuật thể nguyên sinh kết hợp tế bào trần là protoplasts của các loài vi sinh vật khác nhau có thể được hợp nhất, ngay cả khi chúng không liên kết chặt chẽ phân loại học. Ví dụ, protoplasts của Penicillium roquefortii đã được hợp nhất với P. chrysogenum. Thậm chí protoplasts và hồng cầu có thể được hợp nhất. II.3 Chèn chuỗi DNA ngắn Độ dài ngắn của các trình tự ADN được tổng hợp có thể được chèn vào các vi sinh vật bởi quá trình đột biến. Điều này có thể tạo ra sự thay đổi di truyền nhỏ dẫn đến sự thay đổi của 1 hoặc 1 số aa trong protein Thay đổi aa nhỏ đã được tìm thấy, trong nhiều trường hợp, những thay đổi bất ngờ trong các đặc tính protein đã tạo ra các sản phẩm mới như các E đề kháng với môi trường hơn và các E có thể kích thích phản ứng mong muốn Các phương pháp tiếp cận này là một phần trong lĩnh vực công nghệ protein. Tạo ra các enzyme và peptide hoạt tính sinh học với các đặc tính khác nhau (sự ổn định, động lực học, các hoạt động) . Một trong những điểm nổi bật nhất là việc tạo ra các vùng enzyme đặc hiệu hoạt động để thúc đẩy việc sửa đổi "chất không tự nhiên." Có thể dẫn đến cải thiện chuyển đổi nguyên liệu bắt buộc, hay thậm chí là sự suy thoái của các nguyên liệu mà trước đó không được tuân theo quá trình sinh học II.4: Chuyển giao thông tin di truyền giữa các sinh vật khác nhau Sinh tổ hợp * Là quá trình sử dụng vi sinh vật tổng hợp nên các hợp chất có đặc tính như mong muốn. Việc chuyển giao axit nucleic giữa các sinh vật khác nhau là một phần của sinh học tổ hợp phát triển mạnh. Điều này liên quan đến việc chuyển gen để tổng hợp của một sản phẩm cụ thể từ một sinh vật vào nhau, đưa ra các khả năng tiếp nhận khác nhau như tăng công suất tiến hành sự suy thoái hydrocarbon Ví dụ * Việc tạo ra các "superbug“, bằng sáng chế của AM Chakarabarty (1974), trong đó có một khả năng gia tăng sự suy thoái hydrocarbon. Các gen để sản xuất có thể được chuyển giao cho một vi sinh vật sản xuất khác, hoặc thậm chí đến một vi sinh vật không sản sinh kháng sinh. * Hay các gen tổng hợp của bialophos (một loại thuốc kháng sinh diệt cỏ) đã được chuyển giao từ Streptomyces hygroscopicusto vào S. lividans. * Ví dụ khác ở creatininase enzyme của E. coli, từ Pseudomonas putida sản xuất pediocin, một bacteriocin, trong một men được SD trong quá trình lên men rượu với mục đích kiểm soát chất gây ô nhiễm rượu nhờ vi khuẩn. Đặc tính hoặc SP được chuyển giao Vi sinh vật sử dụng Quy trình tổ hợp SX ethanola Escherichia coli Tích hợp của pyruvate decarboxylase và alcohol dehydrogenase II từ Zymomonas Mobilis. SX 1,3-Propanediol E. coli Giới thiệu các gen từ lớp Klebsiella pneumoniae DHA sang vi khuẩn E. coli có thể thực hiện kỵ khí sản xuất 1,3-propanediol. Cephalosporin precursor synthesis Penicillium chrysogenum Sản xuất 7-ADC and 7-ADCAatiền thân do sự sát nhập của gen expandase của Cephalosoporin acremonium vào chuyển đổi Penicilliumby. Bảng 42.3:Sinh học tổ hợp CNSH: Các biểu hiện của gen trong các loài sinh vật khác để cải thiện quy trình và sản phẩm SX axit lactic Saccharomyces cerevisiae Một loài bò bắp thịt lactate gen dehydrogenase (LDH-A) thể hiện trong S. cerevisiae. 95% chuyển đổi xylitol từ xylose thu được bằng cách chuyển gen XYLI của Pichia stipitis một reductase xylose vào S. cerevisiae, làm cho vi sinh vật này một sinh vật hiệu quả để sản xuất xylitol, dùng làm chất tạo ngọt trong ngành công nghiệp thực phẩm. SX xylitol S. cerevisiae Creatininase E. coli Biểu hiện của gen creatininase từ Pseudomonas putida R565. Gen đưa vào bằng một vector pUC18 Pediocin S. cerevisiae Sự biểu hiện của bacteriocin từ Pediococcus acidilactici trong S. cerevisiaeto ức chế chất gây ô nhiễm rượu SX Acetone và butanol Clostridium acetobutylicum Giới thiệu một vector vận chuyển C. acetobutylicum bằng sự cải thiện chuỗi vận chuyển điện tử và kết quả trong acetone và hình thành butanol Biểu hiện DNA trong các sinh vật khác nhau có thể nâng cao hiệu quả sản xuất và giảm thiểu các bước tinh chế cần thiết trước khi sản phẩm sẵn sàng để sử dụng. Một loạt các thông tin di truyền cũng có thể được chèn vào các vi sinh vật bằng sử dụng các vector và kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Vector bao gồm nhiễm sắc thể nhân tạo chẳng hạn như đối với nấm men (YACs), vi khuẩn (BACS), nhiễm sắc thể vi khuẩn P1 có nguồn gốc từ (PAC), và nhiễm sắc thể nhân tạo từ động vật có vú (MAC). YACs đặc biệt có giá trị bởi vì trình tự DNA lớn (trên 100 kb) có thể được duy trì trong YAC như một nhiễm sắc thể riêng biệt trong tế bào nấm men. Chuyển giao thông tin di truyền cho phép SX các protein và peptide bởi các sản phẩm tương tự có thể được tổng hợp trong cơ thể ban đầu. Cách tiếp cận này có thể làm giảm thời gian và chi phí phục hồi và làm sạch SP. Đặc trưng này là cần thiết để tránh các tác dụng phụ có hại có thể có của phân lập bất hoạt, như đã xảy ra trong thảm họa thalidomide. Một ví dụ của việc SD vector cung cấp bởi các loại VK gây bệnh lở mồm long móng ở gia súc. Thông tin di truyền ở chân và miệng do bệnh vi-rút kháng nguyên có thể đưa vào VK E. coli, sau đó là thể hiện thông tin này di truyền và tổng hợp SP gen để SD trong SX vắc xin Hình 42.2 tái tổ hợp sản xuất vắc xin. Gen mã hóa cho các sản phẩm mong muốn có thể được thể hiện trong các sinh vật khác nhau. Bằng cách sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp, vắc-xin lở mồm long móng được sản xuất thông qua nhân bản gen vaccine trong Escherichia coli Ngoài việc đưa các gen mới vào các sinh vật, ta còn có thể thay đổi quy chế gen bằng cách thay đổi phiên mã gen, tổng hợp protein, tạo quảng bá lai, và loại bỏ các quy chế kiểm soát thông tin phản hồi Những cách tiếp cận này làm cho nó có thể sản xuất thừa một loạt các sản phẩm, (bảng 42.4). Một ví dụ khác, gen để tổng hợp các actinorhodin kháng sinh đã được chuyển giao vào sản xuất các chủng khác kháng sinh, dẫn đến việc sản xuất hai loại thuốc kháng sinh do cùng một tế bào. II.5 Sửa đổi biểu hiện gen Sản phẩm Vi sinh vật Kiểu sửa đổi Actinorhodin Streptomyces coelicolor thay đổi quá trình phiên mã của gen Cellulase Clostridium genes in Bacillus Khuếch đại của bài tiết thông qua khuếch đại DNA nhiễm sắc thể Recombinant protein albumin Saccharomyces cerevisiae Fusion với việc SX một loại cao protein Heterologous protein Saccharomyces cerevisiae Sử dụng cảm ứng promoter lai mạnh mẽ UASgal/ CYC Enhanced growth ratea Aspergillus nidulans Sản xuất quá mức glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Amino acidsb Corynebacterium Phân lập gen sinh tổng hợp dẫn đến tăng cường các hoạt động enzyme hoặcloại bỏ các quy chế thông tin phản hồi Bảng 42.4: Ví dụ về các hệ thống tái tổ hợp DNA sử dụng để sửa đổi biểu hiện gen Cách tiếp cận này, biểu hiện của gen thay đổi cũng có thể được sử dụng để làm thay đổi con đường chuyển hóa bằng cách khử hoạt hoặc bãi bỏ quy định những gene đặc biệt, đó là con đường kiến trúc (hình 42.3) Cách thay thế có thể được sử dụng để thêm ba nhóm chức năng vào một phân tử. Cách tiếp cận này đã được sử dụng để cải thiện sản lượng penicillin bằng kĩ thuật chuyển hóa(MPE). II.5 Sửa đổi biểu hiện gen Hình 42.3: Con đường kiến trúc, một yếu tố quan trọng trong kĩ thuật chuyển hóa Các bước thay thế bổ sung của ba nhóm chức năng cho một bộ xương hóa chất cơ bản, có thể có hiệu quả khác nhau, và rất quan trọng để lựa chọn sự kết hợp hiệu quả nhất giữa các bước enzyme hoặc con đường để mang lại sản phẩm mong muốn. E1 → E12 enzyme khác nhau; P: các sản phẩm trung gian sau khi việc bổ sung các nhóm chức năng đầu tiên và thứ hai, và FP: sản phẩm cuối cùng. Một cải tiến gần đây là việc sử dụng các biểu hiện biến đổi gen để sản xuất biến thể của erythromycin kháng sinh. Ngăn chặn các bước sinh hóa riêng trong con đường cho sự tổng hợp của một tiền thân của kháng sinh dẫn đến sản phẩm cuối cùng bị sửa đổi. Những sản phẩm bị thay đổi, trong đó có cấu trúc hơi khác nhau, có thể được thử nghiệm cho hiệu năng chống vi thể của nó. Hình 42.4 Kỹ thuật chuyển hóa để tạo kháng sinh thay đổi Tạo ra khả năng trao đổi chất mới cho một VSV, trong đó sử dụng đột biến evolutionandadaptive cưỡng bức. Đây là quá trình sử dụng áp lực môi trường cụ thể để "buộc" vi sinh vật biến đổi và thích ứng, do đó tạo ra các vi sinh vật với khả năng sinh học mới. Các cơ chế của các quá trình đột biến thích nghi bao gồm sắp xếp lại DNA, trong đó yếu tố chuyển vị và các loại tái tổ hợp đóng vai trò quan trọng (bảng 42.5). II.6 Kỹ thuật di truyền tự nhiên Bảng 42.5: Hệ thống kỹ thuật di truyền tự nhiên ở VK Cơ chế kỹ thuật di truyền Thay đổi DNA trung gian Đột biến địa hóa SOS Sự thay thế cơ bản, khung Sự xê dịch khung thích nghi Sự xê dịch khung Tn5, Tn9, TN10 cắt bỏ chính xác Tái tổ hợp đối ứng của sườn 8/9 lặp đi lặp lại bp; phục hồi trình tự ban đầu Cơ chế xóa, đảo ngược, hợp nhất và hình thành nhân bản Tái tổ hợp thường đối ứng của chuỗi ngắn lặp đi lặp lại, đôi khi không tương đồng Tái tổ hợp topoisomerase loại 2 Xóa và hợp nhất bằng sự tái tổ hợp không tương đồng, đôi khi lặp đi lặp lại ở ngắn Tái tổ hợp địa điểm cụ thể (topoisomerases loại 1) Chèn thêm, cắt xén / xóa, đảo ngược bởi các phản ứng phân cắt-thắt phối hợp hoặc liên tiếp ở chuỗi ngắn lặp đi lặp lại; dung nạp sự không phù hợp Các yếu tố chuyển vị (nhiều loài) Chèn, chuyển vị, hợp nhất đơn vị sao chép, xóa liền kề / cắt xén, liền kề inversionsby thắt của 3 'OH transposon kết thúc 5' nhóm PO4 từ cắt giảm lảo đảo tại các địa điểm mục tiêu không tương đồng Sự hấp thu DNA (khả năng  chuyển đổi) Hấp thụ độc lập dải đơn của chuỗi, hoặc sợi đôi DNA mang loại chuỗi nhận dạng III. Bảo quản VSV Phương pháp Cơ sở Chuyển chu kỳ Biến chuyển định kỳ nuôi cấy  mới bao gồm tần số chuyển nhượng, vừa sử dụng, và giữ nhiệt độ, điều này có thể dẫn đến tỷ lệ đột biến tăng và sản lượng của các biến thể Mặt nghiêng dầu khoáng Một môi trường nuôi cấy gốc được trồng trên một dốc và bao phủ bởi dầu khoáng vô trùng; nghiêng có thể được bảo quản ở nhiệt độ tủ lạnh Nhiệt độ tối thiểu, nước cất, hoặc môi trường thạch nước Môi trường nuôi cấy rửa được lưu trữ trong tủ lạnh, những nuôi trường nuôi cấy có thể khả thi cho 3-5 tháng hoặc lâu hơn Bảng 42.6 Phương pháp sử dụng để bảo quản môi trường nuôi cấy VSV có ích cho Công nghiệp VSV và CNSH Đông lạnh Không bền, có thể gây hại cho các cấu trúc vi sinh vật, với một số vi sinh vật, tuy nhiên, điều này có thể là một công cụ hữu ích duy trì nuôi cấy Phơi khô Môi trường nuôi cấy  được sấy khô trên đất vô trùng (cổ phiếu đất), trên đĩa giấy lọc vô trùng, hoặc trong gelatin giọt; này có thể được lưu trữ trong một bình hút ẩm ở nhiệt độ lạnh, hoặc đông lạnh để cải thiện khả năng tồn tại Đông khô (lyophilization) Nước được loại bỏ bằng cách thăng hoa, trong sự hiện diện của một đại lý cryoprotective; niêm phong trong một ampule có thể dẫn đến khả năng tồn tại lâu dài, với 30 năm đã được thông báo Ultrafreezing Nitơ lỏng ở -196 ° C được sử dụng, và nuôi trường nuôi cấy của các vi sinh vật khó tính đã được bảo tồn trong hơn 15 năm * Câu hỏi củng cố 1. Sự đông khô (lyophilization) là gì? A. Là quá trình nước được lấy ra khỏi mẫu khi chúng đang ở trạng thái lạnh sâu B. Là quá trình loại bỏ nước bằng cách thăng hoa giúp vsv tồn tại trên 30 năm C. Là quá trình sấy khô trên môi trường vô trùng, được lưu trữ trong bình hút ẩm ở nhiệt độ đông lạnh B Congratulations! 2. Sự dung hợp tế bào trần (protoplast Fusion) được sử dụng rộng rãi ở loài vi sinh vật nào? A. Nấm men và nấm mốc C. Virút và nấm mốc B. Xạ khuẩn và nấm men D. Virút và xạ khuẩn A A. Biến đổi toàn bộ trình tự các nucleotit trên gen. B. Tạo đột biến chuyển đoạn DNA . C. Gây ra đột biến lặp đoạn. D. Tạo ra sự thay đổi di truyền nhỏ dẫn đến thay đổi 1 hoặc một số aa trong protein. 3. Nguyên tắc của kỹ thuật chèn chuỗi DNA ngắn vào các VSV bởi quá trình đột biến là gì? Chọn đáp án đúng nhất D A. Ổn định nhiệt độ môi trường. D. Cả 3 chức năng trên. B. Ổn định pH. 4. Trong kỹ thuật dung hợp tế bào trần thì việc tạo ra protolasts là một trong những thành tựu nổi bật nhất .Vậy, theo bạn, protolasts có tác dụng gì? C. Ổn định thẩm thấu như sucrose. C 5. Sản phẩm nào sau đây không được tạo thành nhờ sự chuyển giao thông tin di truyền giữa các sinh vật khác nhau? D C. Protolasts B. Protolasts A. Bialophos D. Superbug NHÓM 16 VSV123 Thank you