Chuẩn đoán Virus PMWS bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào

1  BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI SVTH: LÂM THIÊN NGỌC 2  MỞ ĐẦU Hội chứng còi cọc sau cai sữa là 1 bệnh đang phổ biến trên heo. Những triệu chứng được quan sát lần đầu ở Canada vào năm 1991, từ đó nhiều nghiên cứu đã được ghi nhận. heo nhiễm PMWS trở nên còi cọc sau cai sữa có thể có hoặc không có biểu hiện khó thở,tiêu chảy, xanh xao, vàng da và có nhiều thay đổi đặc tính mô bệnh học. Dòng circovirus heo dạng 2 , khác với dạng 1 về mặt kháng nguyên và di truyền, gây ra sự nhiễm bệnh liên tục cho nhiều dòng tế bào heo, lúc đầu được cho là do PMWS. Tuy nhiên những nghiên cứu về sau cho thấy sự nhiễm trùng chỉ PCV2 thường không gây ra PMWS vì hầu hết heo thí nghiệm được tiêm dòng PCV2 chỉ bị lây nhiễm cận lâm sàng. Hơn nữa, 1 cuộc khảo sát đã cho thấy tỷ lệ cao heo với kháng thể PCV2 ở những nông trại mà PMWS không được ghi nhận. Việc phát hiện PCV2 do đó không đủ thuyết phục để thiết lập cách chẩn đoán PMWS và việc xác định những trường hợp bị PMWS vẫn còn là tranh cãi. Sự chẩn bệnh chính xác cho từng heo hiện nay đang dựa trên tất cả 3 điều kiện sau: những dấu hiệu lâm sàng điển hình gồm còi cọc sau cai sữa; những bệnh tích vi thể; phát hiện PCV2 trong những bệnh tích tương ứng. Ở những nông trại kinh doanh, PMWS cho thấy sự gia tăng liên tục số lượng những heo tăng trưởng chậm và không có hiệu quả kinh tế. Do sự chết ở heo tăng cao quá mức so với quá khứ nên trong những trường hợp xác định bệnh hiện nay ở mức độ đàn gia súc cũng xem sự chết đó như là 1 tiêu chuẩn quan trọng. Sự phát sinh bệnh của PMWS cũng còn khó hiểu. Những đồng tác nhân gây nhiễm, có thể 1 mình hoặc kết hợp, được cho là nhân tố nguy hiểm cho sự phát triển hoặc sự kịch phát của PMWS. Những thí nghiệm với sự lây nhiễm kép đã xác định porcine parvovirus (PPV), virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo ( PRRS), mycoplasma hyopnemoniae như là những đồng tác nhân. Cũng có những bằng chứng cho thấy việc sử dụng 3  những vaccin hay kích thích miễn dịch nhất định có thể ảnh hưởng đến sự phát triển PMWS. Những khác biệt trong sự phổ biến của PMWS ở các nước có thể góp phần vào sự hiểu biết về sự phát sinh bệnh của tình trạng này. Đến nay, nhiều nghiên cứu về bệnh này đã được báo cáo. Có nhiều phương pháp để xác định sự có mặt của PCV2, bài này chỉ đề cập đến việc phát hiện PCV2 trên môi trường nuôi cấy tế bào.Việc phát hiện PCV2 chỉ cho phép kết luận thú bị nhiễm PCV2 nhưng không thể kết luận thú bị PMWS. TỔNG QUAN GIỚI THIỆU PMWS ( Hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa) là 1 căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm và phổ biến, ảnh hưởng đến nền công nghiệp nuôi heo trên toàn cầu. Bệnh được phát hiện đầu tiên ở tây Canada 1991, với những triệu chứng như mất trọng lượng liên tục, bệnh hô hấp và vàng da. Những triệu chứng tương tự cũng xuất hiện trên heo ở Mỹ, Pháp, bắc Ireland, Tây Ban Nha, Đan Mạch và Đức. Việc xác định kháng nguyên PCV và nucleic acid trong những bệnh tích đưa đến khả năng là virus PCV mới và độc hại hơn đã xuất hiện trong những đàn heo ở những nước này. Tất cả PCV phân lập từ PMWS đều có những nhóm có liên hệ về trình tự nucleotide, 96% trình tự nucleotide intragroup được xác định nhưng có vài sự khác biệt với PCV phân lập từ dòng tế bào PK15, ít hơn 80% trình tự nucleotide được xác định. Người ta cho rằng PCV gây ra PMWS nên được xem như là PCV loại 2 và PCV gây bệnh trong môi trường tế bào PK15 là PCV loại 1. Khi chưa có những nghiên cứu về dịch tễ phân tử, có 2 giả thiết liên quan đến PCV2: một, PCV2 chính là PCV1 nhưng do sự thay đổi về kỹ thuật chăm sóc nuôi dưỡng heo cũng như những yếu tố môi trường khác đã tạo điều kiện cho PCV1 trở 4  nên có độc lực và gây bệnh tương tự như 1 số loài vi sinh vật khác sống cộng sinh trên cơ thể vật chủ; hai, PCV1 dưới tác động của những thay đổi điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng và môi trường đã biến đổi trở thành loài virus gây bệnh mới. Do PCV1 và PCV2 cùng có thể hiện diện trên cùng 1 heo và giữa chúng có sự tương đồng nhất định về gen nên dịch tễ học phân tử cần phân biệt chúng với nhau để có những đánh giá chính xác về tình hình dịch tễ PMWS. Porcine circovirus dạng 2 ( PCV 2) thuộc họ Circoviridae, giống Circovirus, là 1 DNA virus chuỗi đơn vòng. PCV 2 lan tràn trên khắp thế giới ở những đàn heo nuôi thuần hóa, với nhiều triệu chứng như bệnh Porcine circovirus (PCVD), hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa ( PMWS), hội chứng viêm da va viêm thận ở heo (PDNS) và rối loạn khả năng sinh sản. PCV được phát hiện đầu tiên năm 1974 như là 1 chất gây nhiễm không gây bệnh tế bào ở liên tiếp dòng tế bào thận heo ( PK15). Kháng thể huyết thanh đối với PCV gây bệnh trong môi trường tế bào PK15 được chứng minh ở nhiều đàn heo trên thế giới. Tuy nhiên, sự xâm nhiễm cho heo trong phòng thí nghiệm với virus này thất bại trong việc tạo ra những bệnh lâm sàng. Theo phòng thí nghiệm chẩn đoán thú y trường đại học bang Iowa, các trường hợp PCV2 gây bệnh trên heo đã tăng nhanh chóng ở Mỹ trong giai đoạn những năm 1998-2000. PCV2 kết hợp với bệnh viêm phổi là 1 trong những biểu hiện phổ biến nhất của sự nhiễm PCV2 . PMWS là biểu hiện phổ biến thứ 2 do nhiễm PCV2. Chẩn đoán PMWS dựa vào tiền sử còi cọc, sự mất lympho và viêm u hạt trong hạch lympho nhờ kiểm tra mô bệnh học và chứng minh kháng nguyên PCV2 kết hợp với bệnh tích lympho. Dạng phổ biến thứ 3 là PCV2 kết hợp với nhiễm hệ thống, sự chẩn đoán này dựa trên những trường hợp có tiền sử còi cọc và sự vỡ tế bào bạch cầu hoặc viêm u hạt được quan sát trong nhiều cơ quan có liên quan với kháng nguyên 5  PCV2. Sự thiếu hụt tế bào bạch cầu không được quan sát hoặc mô lympho không được chấp nhận trong những trường hợp này. Có vài dấu hiệu bệnh lâm sàng cơ bản của PMWS làm tiền đề cho những chẩn đoán lâm sàng bệnh bao gồm sưng hạch lympho, còi cọc, khó thở, tiêu chảy, vàng vọt, vàng da. Những dấu hiệu này không xuất hiện riêng lẻ ở từng con heo, đa số heo trong trang trại bị nhiễm bệnh sẽ có biểu hiện lâm sàng bệnh. Để xác định bệnh cần: sự hiện diện của những dấu hiệu lâm sàng bệnh, những bệnh tích mô học và sự hiện diện của PCV 2 trong những bệnh tích đó. Dấu hiệu lâm sàng của PMWS bị giới hạn bởi tuổi cai sữa của heo. PMWS xuất hiện trên heo tuổi từ 25 đến 120 ngày, tập trung cao nhất trong khoảng tuổi từ 60 đến 80 ngày tuổi. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY PMWS ( POSTWEANING MULTISYSTEMIC WASTING SYNDROME) II.1 Phát hiện DNA PCV2 trong nuôi cấy tế bào Để phát hiện DNA PCV2 bằng nuôi cấy tế bào, 5g mỗi bộ phận (phổi, hạch lympho, hạch amidan) được thu thập, hòa lẫn trong 10 ml PBS (phosphate – buffered saline) và đồng nhất. Ly tâm dung dịch ở 1,500×g trong 30 phút ở 4°C, dịch nổi được thu thập lại và lọc (0.45 μm, Sartorius,Göttingen, Germany). Dịch lỏng sẽ được ủ ở 3 trong số 24 giếng của đĩa nuôi cấy ( Corning Inc., NY, USA ), chứa 1 lớp NSK( dòng tế bào thận heo sơ sinh), tăng trưởng trong môi trường EMEM ( Eagle minimal essential medium ). Sau 2h ủ ở 22°C , mỗi giếng được thêm vào 1 ml EMEM được làm giàu với 5% huyết thanh thai bò (BioWhittaker Inc., MD, USA). 6  Môi trường nuôi cấy NSK được kiểm tra âm tính thường xuyên với PCV1, PCV2, virus pseudorabies, và virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp. Đối chứng dương được chuẩn bị từ môi trường tế bào NSK bị nhiễm virus dòng PCV2, phân lập từ đàn heo Italy. Môi trường tế bào NSK không có PCV1 và PCV2 được sử dụng làm đối chứng âm. Tất cả các đĩa nuôi cấy được ủ trong 10 ngày ở 37°C trong 10% CO2 . Thực hiện 3 lần cấy chuyển, sau khi ủ, dịch nổi được dùng để xác định sự có mặt của DNA PCV2 bằng real- time PCR, theo protocol của Olvera et al. (2004) II.2 Hóa mô miễn dịch ( Immunohistochemistry ) Nguyên tắc: Hóa mô miễn dịch là kết hợp phản ứng miễn dịch và hoá chất để làm hiện rõ các kháng nguyên (KN) hiện diện trong mô (bào tương, màng tế bào, nhân). Vì kháng nguyên không thể quan sát hình thái được nên người ta phải xác định vị trí của nó trên tế bào bằng các phản ứng miễn dịch và hóa học. Có hai kỹ thuật: miễn dịch huỳnh quang và miễn dịch men. Nguyên tắc: Cho kháng thể (KT) đặc hiệu lên mô, nếu trong mô có kháng nguyên sẽ có phản ứng kết hợp KN - KT. Có 2 cách để quan sát được phức hợp này: Miễn dịch huỳnh quang: cho gắn với một chất phát huỳnh quang và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Miễn dịch men: Cho gắn với một loại men (peroxidase hoặc alkaline phosphatase) và gắn với chất màu (chromogen), có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học. 2.2 Cách thực hiện 7  - Hóa mô miễn dịch được tiến hành trên mô, ngay cả khi mẫu bị đông lạnh ở −20°C. Mẫu mô được thu nhận từ những con heo có những dấu hiệu lâm sàng của pmws như giảm cân liên tục, bệnh đường hô hấp, vàng da, sưng hạch lympho. - Mẫu mô dày khoảng 4-μm được nhuộm hematoxylin và eosin (HE) và với thuốc nhuộm hóa mô miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng chống PVC2. - Sau khi làm khô và loại bỏ chất nhờn ở mẫu, peroxidase nội sinh sẽ ức chế với peroxide hydrogen 0.3% trong methanol 30 phút, sự phục hồi kháng thể nhờ protease XIV (0.05%) ở 37°C. - Kháng huyết thanh thỏ đa dòng được đưa vào mẫu mô ở mức pha loãng 1:2000 trong PBS (phosphate –buffered saline) (pH 7.2) trong 1h ở 37°C - Sau đó rửa mẫu trong PBS, 5 phút, thêm vào biotinylated anti-rabbit IgG trong 30 phút, 37°C. - Sau đó, lại rửa bằng PBS, và streptavidin-biotin-peroxidase được đưa vào để phát hiện sự có mặt của PCV trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. - Sau 5 phút rửa trong PBS, mẫu được ủ trong enzyme diaminobenzidine. tetrahydrochloride (DAB) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng ( DAB được sử dụng như chất tạo màu), rửa và nhuộm với haematoxylin 1 phút ở nhiệt độ phòng. - Mẫu được làm sạch nhờ cồn và xylene, đặt dưới lamen làm tiêu bản. - Mẫu mô được nhuộm tương phản papanicoleu hematoxyline, làm khô nước và cố định với dibutyl phthalate xylene. Mô lympho của heo con nhiễm PMWS ngẫu nhiên , sự hiện diện của PCV2 được xác định nhờ PCR và lai in situ, được sử dụng như là đối chứng dương. Đối chứng âm là kháng thể có cùng isotype (IgG1) với kháng thể sơ cấp nhưng có đặc hiệu không phù hợp. Kết quả Hầu hết động vật được kiểm tra cho thấy điều kiện cơ thể kém, với mức độ teo cơ bên ngoài biến đổi. Những bệnh tích ở mức độ lớn được quan sát chủ yếu ở 8  thùy đỉnh của phổi, viêm phổi, với đốm xuất huyết và ở hạch lympho của phế quản, bị sưng và tái (bảng 1) Mô học cho thấy sự hiện diện của những tổn thương trong phổi, hạch, và mô lympho ( những tế bào đa nhân lớn, sợi phế quản, viêm u hạt , hoại tử đông tụ, và xuất huyết ). Không có bằng chứng mô học nào về sự nhiễm vi khuẩn, PCR từ những cơ quan bệnh đồng nhất cho thấy có DNA PCV2 ở 7 trong số 16 con heo đực. Về phân lập virus, không có tác động gây bệnh tế bào nào được quan sát trong môi trường nuôi cấy NSK. Tuy nhiên, sự có mặt của DNA PCV2 được chứng minh từ tất cả 16 con heo hoang dã bằng Real Time PCR của gen Cap (Capsip protein gene) được thực hiện trên dịch nổi của môi trường nuôi cấy NSK. Kết quả này được xác nhận bằng kính hiển vi điện tử cho thấy sự có mặt của những tụ porcine circovirus như những phân tử, với hình tròn và đường kính khoảng 17 nm trong bất cứ môi trường tế bào nào ( hình 1) 9  Fig. 1 Electron microphotograph of small circovirus particles from supernatant of newborn swine kidney cell culture on pooled organs (bronchial lymph nodes, lungs, tonsils) from wild boars with PCV2 infection. Negative staining. Bar 50 nm 10  Không có virus khác giống những phân tử được quan sát trong môi trường không nhiễm và đối chứng. Chỉ có 1 mẫu cho kết quả dương tính với nhuộm kháng nguyên IHC trong tế bào chất và nhân tế bào của những nang trong hạch lympho phổi (hình 2) 11  II.3 Lai tại chỗ (In situ hybridization) 3.1 Nguyên tắc: Lai tại chỗ là kiểu lai phân tử trong đó trình tự đích cần tìm nằm ngay trong tế bào, trong mô. Quá trình lai với mẫu dò đánh dấu và phát hiện phân tử lai được thực hiện ngay trên lát cắt mô. 3.2 Cách thực hiện Mẫu mô được thu nhận từ những con heo có những dấu hiệu lâm sàng của PMWS như giảm cân liên tục, bệnh đường hô hấp, vàng da, sưng hạch lympho. Mẫu mô heo bệnh được cố định ở 10% formalin trung tính và gắn tiêu bản trên paraffin nhờ sử dụng những kỹ thuật tiêu chuẩn. 5 µm mẫu mô từ heo bị PMWS và heo đối chứng được cắt vào những slide, xử lý với 3-amino-propyltriethoxysilane (APES) Ủ ở 600 C trong 30 phút, loại bỏ chất nhờn trong xylene và làm khô bằng cồn. peroxidase nội sinh bị ức chế Probe chuyên biệt cho PCV2 được tạo ra với 1 bộ kit có sẵn trên thị trường. Probe được đưa vào cùng với 20-30 ml hỗn hợp lai gồm 50% formamide, 10% dextran sulphate, 2 x dung dịch đệm muối natri citrate ( ssc), 2 x dung dịch Denhardt, 200 mg/ml DNA tinh trùng và 0.05% probe cho PCV. Mẫu mô lặp lại được loại bỏ paraffin nhờ 3 thay đổi xylene và 2 thay đổi cồn tuyệt đối, làm khô trong PBS có 70-95% ethanol. Giữa mỗi bước, mô được rửa 2 lần trong 5 mM PBS mỗi 10 phút. Hoạt động của enzyme nội sinh peroxidase bị ức chế khi ủ 20 phút trong 0.5% H2O2 methanol. Những mẫu cắt và môi trường tế bào cố định formalin được ủ ở 0.5% protease XIV trong 0.05 M tris- HCL trong 15 phút, 37°C, rửa qua với nước cất và rửa lại 2 lần trong 5 mM PBS (để tối ưu cho thí nghiệm ISH và IHC, mẫu này được đưa vào 12  enzyme tiêu hóa protein sử dụng protease XIV hoặc proteinase K ở nồng độ là 0.5 mg/ml cho 10, 20, 30 hoặc 40 phút ở 37°C.) 50 µl hỗn hợp lai được đưa vào và đặt dưới lamen. DNA mục tiêu trong mô và mẫu dò PCV2 trong hỗn hợp lai sẽ bị biến tính khi ủ ở 90°C, 10 phút ngay sau khi làm lạnh ở túi đá. Sự lai được thể hiện trong khoảng 18-22h, ở 37°C trong môi trường ẩm. Sau khi lai, slide kính được rửa 2 lần trong muối natri citrate. Slide được rửa lại lần nữa trong PBS sau khi ủ trong buffer maleic acid 20 phút, 37°C. Những mẫu cắt sau đó được chuyển vào buffer maleic acid, chứa 1% tác nhân ức chế, sau khi ủ trong kháng thể anti-digoxygenin POD, pha loãng 1:200 trong 1% chất ức chế/ buffer maleic acid. Mẫu được rửa đầu tiên trong buffer maleic acid rồi đến 5mM PBS. Cuối cùng, đưa DAB vào ( 3,3 diaminobenzidine). Slide sẽ được nhuộm tương phản nhẹ với Harris hematoxylin, làm khô bằng cồn và cố định làm tiêu bản để quan sát bằng kính hiển vi quang học. 3.3 Kết quả: Hình thái học tế bào bị khử ở cả những mô cố định formalin và ethanol khi so sánh với những mẫu cắt nhuộm hematoxylin và eosin (HE) của cùng mẫu mô và phương pháp cố định formalin. Mô cố định ethanol có sự giảm rõ ràng về hình thái học khi ISH được so sánh với HE hoặc ISH trên những mô cố định formalin. Cả hai phương pháp cố định ethanol và formalin đều tạo ra cùng dạng nhuộm trên mô dương tính PCV2. Khi cố định ethanol, mẫu tuyến ức và hạch lympho âm tính PCV2 không chứa tế bào dương tính ISH. Mẫu nhiễm PCV2 chứa mô heo bị PMWS được bảo quản formalin và ethanol. Mẫu cắt tuyến ức bị PMWS được cố định ethanol cho thấy có sự phân hủy sản phẩm phản ứng DAB tạo thành những 13  thể vùi riêng biệt hoặc sự tích đọng tế bào chất đến sự hòa nhập chất nhuộm ở tế bào chất cho thấy sự có mặt của DNA virus trong tế bào chất của đại thực bào. Thỉnh thoảng nhân mô bào là dương tính trong khi hiếm khi tế bào có nhân thoái hóa cho thấy nhân nhuộm ISH. Hạch lympho bị PMWS cố định ethanol cho thấy sự nhuộm tế bào chất của DNA virus trong đại thực bào như những thể vùi riêng biệt hoặc sự kết tụ tế bào chất của virus. Tế bào dương tính thỉnh thoảng phân bố trong tủy ức, mô vỏ. Hạch lympho bị PMWS cố định formalin cho thấy vật chất trong tế bào chất dương tính mạnh trong tế bào chất của mô bào và những tế bào thực bào hoạt hóa. Không có sự khác biệt nào về dạng tế bào nhuộm hoặc sự nhuộm nội bào giữa hai phương pháp cố định trên. Ở hạch lympho, nhiều đại thực bào là dương tính ISH, so sánh với vài tế bào rải rác ở mô vỏ. 14  15  Hạn chế và ưu điểm của phương pháp IHC Chậm Đặc hiệu, nhạy Đơn giản, dễ thực hiện, giá thành thấp Thuận lợi trong việc bảo quản mẫu bệnh phẩm Hạn chế và ưu điểm của phương pháp lai tại chỗ Đặc hiệu cao Độ nhạy cao, không ổn định Phức tạp, giá thành cao Phân lập virus Để phân lập virus, khoảng 15% dịch nổi của mẫu mô được thu nhận từ MEM- SA (Môi trường thiết yếu tối thiểu chứa muối earle và peniciline và streptomycin) 16  bằng cách nghiền mẫu với cối, chày vô trùng và thêm vào ít cát vô trùng. Sau đó hòa tan với MEM-SA rồi ly tâm ở 3,000 x g trong 30 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi. trước khi ủ với môi trường tế bào, 100 µl chloroform được thêm vào đến 2ml dịch nổi và trộn lẫn liên tục khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp được chuyển vào ống ly tâm và ly tâm ở 3000 x g trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi. Dịch nổi này được sử dụng như nguyên liệu cấy cho nghiên cứu phân lập virus. Tất cả nghiên cứu phân lập virus được thực hiện trên môi trường tế bào PK15, không nhiễm PCV, pestivirus, adenovirus heo, parvovirus heo. Tế bào PK15 được lấy ra khỏi môi trường sử dụng trypsin versene và hòa tan lại trong MEM-SA chứa 15% huyết thanh bò không có pestivirus ( MEM-G) ở nồng độ 4 x 105 tế bào/ml. 10ml mẫu đại diện của dịch tế bào này được trộn lẫn với 2ml mẫu đại diện của nguyên liệu cấy ở trên, hỗn hợp thu được sẽ phân chia vào 2 bình nuôi cấy mô khoảng 25ml. Những môi trường này được ủ ở 370C trong 18h ở 10% CO2. Sau đó, lớp tế bào 1 lớp sẽ được xử lý với 300 mM D-glucosamine và ủ ở 370C trong 48-72h. Sau đó, 1 bình nuôi cấy của mỗi nguyên liệu cấy được được đông lạnh và rã đông 3 lần. Bình còn lại của mỗi nguyên liệu cấy được cấy chuyển bằng cách tách tế bào PK15 sử dụng trypsin versene, tái hòa tan những tế bào tách này trong 20 ml MEM-G, đưa chúng vào bình nuôi cấy 75 ml sạch ở nồng độ 4 x 105 tế bào/ ml. Bình nuôi cấy này sau đó được “siêu gây nhiễm” bằng cách thêm 5 ml tế bào ly giải thích hợp sau khi đông lạnh/rã đông 3 lần. 5 ml dịch siêu gây nhiễm được lấy ra và đưa vào đĩa petri ( đường kính 55mm) có lamen khử mỡ vô trùng. Bình nuôi cấy và lamen được ủ ở 370C và xử lý với glucosamine như trên. Sau khi xử lý glucosamine 24-48h, Lamen được lấy ra và cố định acetone trong 10 phút ở nhiệt độ phòng hoặc trong 10% buffer formalin trung tính trong 4h. Sau khi cố định, tất cả lamen được dự trữ ở -700C trên gel silica trước khi sử dụng cho hóa miễn dịch và ISH 17  II.4 Các phương pháp khác Ngoài sử dụng phương pháp hóa mô miễn dịch và lai in situ, 1 số phương pháp khác cũng được sử dụng để chẩn đoán PMWS virus như phương pháp PCR, phương pháp ELISA, miễn dịch huỳnh quang gián tiếp… 4.1 Phương pháp PCR: PCR được thực hiện để xác định sự hiện diện của PCV2 DNA trong phổi, hạch bạch huyết và hạch amidan. DNA virus được ly trích với bộ kit QIAmp DNA mini, thu thập từ động vật và đồng nhất trong dung dịch PBS ( phosphate buffer solution) tỉ lệ 1:5. Phản ứng PCR được thực hiện trong máy chu trình nhiệt mastercyler gradient (eppendorf, Hamburg, Germany). 2 µl DNA trích được sử dụng cho khuếch đại trình tự CAP (capsid protein gene). Sự khuếch đại được thực hiện trong 25 µl hỗn hợp phản ứng với thành phần sau: MgCl2 (1 mM), Buffer GoTaq® 1X (Promega, Madison, WI, USA), dNTPs (0.2 mM), primers 150 (5′- ACTGTCAAGGCTACCACAGTCA-3′) và PMWS-1443 (5′- CGGATATTGTAGTCCTGGTCG-3′; 1 μM), GoTaq® (1.25 U), and 2.5 μL of DNA. Điều kiện phản ứng là : biến tính ở 94°C trong 1 phút, 35 chu kỳ ở 94°C trong 1 phút, 55°C trong 1 phút, 72°C trong 1 phút , kéo dài ở 72°C trong 10 phút . sản phẩm PCR (481) chạy điện di ở gel 2% agarose và được quan sát nhờ cơ chế geldoc2000 (Bio-Rad Laboratories Inc., France). Đối chứng dương được chuẩn bị từ 100 μL môi trường tế bào thận heo sơ sinh (NSK) nhiễm virus dòng PCV2 phân lập từ đàn heo Italy. Với cùng lượng môi trường tế bào NSK, không có virus PCV dạng 1 và 2 được sử dụng như là đối chứng âm. 4.2.Phương pháp huyết thanh học Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp: huyết thanh heo được kiểm tra nhờ IIF. Huyết thanh heo được pha loãng 1:50 và 1:250 trong PBS ( phosphate buffered 18  saline) và cung cấp dòng tế bào PK15 nhiễm PCV2 được cố định aceton. Huyết thanh heo âm và dương tính và đối chứng không có huyết thanh được sử dụng trong IIF. Sau khi ủ ở 370C trong 1h, lamen được rửa trong PBS, và fluoroscein- isothiocyanate phức với rabbit anti swine IgD được đưa vào trong 1h ở 370C. Dung dịch chuẩn bị được rửa trong PBS và làm tiêu bản trong buffer muối glycerol trước khi quan sát dưới tia UV. Huyết thanh được coi là dương tính khi tế bào nhuộm cho tín hiệu huỳnh quang mạnh quan sát được ELISA cạnh tranh: c- ELISA được thực hiện trong đĩa vi chuẩn, có 4 bước ủ trước khi phản ứng với chất nền enzyme. Ngoại trừ bước thứ 2, 4 chu kỳ rửa được thực hiện bằng tay sau mỗi bước, sử dụng PBS có 0.05% tween 20f. đĩa nuôi cấy được phủ qua đêm ở 4 độ C với 100ml kháng nguyên PCV2 ở 0.85 mg/ml pha loãng trong 0.05M dung dịch đệm carbonate- bicarbonate pH 9.6. Huyết thanh heo được pha loãng ở 1:125 trong PBST và 50ml được thêm vào để nhân đôi giếng mẫu huyết thanh và nhân đôi giếng đối chứng huyết thanh, ủ ở 370C trong 45 phút. Dung dịch đệm phosphate saline chứa tween 20 được thêm vào đến 4 giếng tiếp hợp mẫu và 4 giếng tiếp hợp đối chứng riêng. Không loại bỏ huyết thanh, giếng mẫu nhận được 50ml kháng thể đơn dòng chuyên biệt cho PCV2, 12B6, pha loãng đến 42 mg/ml trong PBS-T, trong khi giếng chuẩn chỉ nhận được PBS-T, sau đó ủ trong 30 phút ở 370C. Kết hợp với HRP-GAM, pha loãng 1:8000 trong PBS-T chứa 5% huyết thanh dê, thêm vào 100ml vào tất cả các giếng, ủ ở 1h ở 370C. Ezyme 3,3-5,5-tetramethylbenzidine được thêm vào ở nhiệt độ phòng và phản ứng dừng sau 10 phút với 1 M H2SO4 . Độ hấp thu được đọc ở bước song 450nm. Kết quả mật độ quang OD được giải thích bằng việc tính toán PI sử dụng công thức sau: PI = 100 - [(serum OD/control OD) X 100] 19  Huyết thanh OD( cho mỗi huyết thanh) = huyết thanh trung bình giếng mẫu – huyết thanh trung bình chuẩn và OD đối chứng= trung bình giếng mẫu tiếp hợp - trung bình giếng chuẩn tiếp hợp (0% ức chế) Kết quả giữa dãy âm và dương tính được tính toán từ trung bình phần trăm ức chế của dãy âm IIF cộng 2 hoặc 3 độ lệch chuẩn của giá trị trung bình. Sự tính toán này có độ tin cậy 95% hoặc 96% mà tất cả giá trị âm tính sẽ rơi vào trong phạm vi giới hạn. Độ nhạy và tính chuyên biệt của ELISA được tính toán bằng công thức sau: Độ nhạy = dương tính thật x 100/ dương tính thật + dương tính giả Độ chuyên biệt = âm tính thật x 100/ âm tính thật + âm tính giả Sự thay đổi trong những thử nghiệm liên tiếp c-ELISA được đánh giá bằng tái kiểm tra 3 lần 24 dãy, với PIs giữa 24% và 100%. KẾT LUẬN Sự hiểu biết về những nhân tố ảnh hưởng đến sự phổ biến và nghiêm trọng của PMWS vẫn chưa được hiểu hết, tuy nhiên rõ ràng là nó có liên quan đến lượng cao PCV2 trong mô. Vì vậy sự biến đổi và điều hòa PCV2 trong mô là cần thiết cho sự biểu hiện bệnh. Sự hiểu biết của chúng ta về dịch tễ học và những nhân tố khởi động tiềm ẩn đang được nâng cao, đặc biệt về vai trò của tá dược, vaccin và đồng gây nhiễm. Cho đến khi vaccin được sử dụng rộng rãi ở Canada, điều quan trọng để điều khiển PMWS là ngăn chặn sự khuếch đại của dòng virus. Trong khi dòng PCV2 mới xuất hiện đã nhận được sự chú ý ở Đông Canada, nền công nghiệp nên nhận thức rằng những dòng virus trội hơn vẫn chưa được chứng minh. Sau những phát hiện PCV2, những nghiên cứu huyết thanh học chứng minh rằng sự nhiễm PCV2 phổ biến ở heo nuôi và heo hoang dã. Đến nay, nhiều nghiên cứu cho thấy sự kết hợp của PCV2 với bệnh tích trên nhiều mô ở heo nuôi như là những dấu hiệu lâm sàng của PCVD, PMWS, PDNS và rối loạn sinh sản. PCV2 20  gây u hạt tế bào lympho ở kẽ phổi, u hạch lympho, ít phổ biến hơn, tế bào lympho u hạt viêm gan,bệnh viêm thận. Những kết quả trên đây có thể dẫn đến kết luận rằng PCV2 đại diện cho 1 tác nhân gây bệnh ở heo hoang dã, nơi mà dễ dàng gây ra những bệnh tích trực tiếp và tạo ra những ảnh hưởng bệnh học tương tự như trên heo nuôi, gây ra ức chế miễn dịch và kích thích sự xuất hiện của sự lây nhiễm thứ hai. Những nghiên cứu xa hơn cần được thực hiện để hiểu rõ hơn vai trò dịch tễ học của heo hoang dã trong việc dẫn truyền sự nhiễm PCV2, đặc biệt như là 1 nơi chứa tiềm tàng của những heo nuôi sống ở cùng khu vực địa lý Trong chẩn đoán xác định nguyên nhân gây PMWS cần phải sử dụng các kỹ thuật liên quan trực tiếp giữa virus và bệnh tích mô, vì vậy kỹ thuật hóa mô miễn dịch và lai tại chỗ được khuyến khích sử dụng và đáng tin cậy hơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Ngọc Hải, 2007. Công nghệ sinh học trong thú y. F. McNeilly et al,1999. Journal of virological methods 80, p 123-128 Alexander Hamberg, Susan Ringler, Steven Krakowka, 2007. Method for detection of porcine circovirus type 2, p 135-141 G. M Alan et al, 1998. PCV-like viruses in diseased pigs, p 3-10 S. Petrini et al, 2009. Detection of PCV2 from wild boars in central Italy, p 465- 469 21  MỤC LỤC MỞ ĐẦU……………………………………………………………….3 TỔNG QUAN…………………………………………………………..4 Giới thiệu ………………………………………………………...4 Phương pháp chẩn đoán…………………………………………..6 II.1 Phát hiện DNA PCV2 trong nuôi cấy tế bào………………..6 II.2 Kỹ thuật hóa mô miễn dịch…………………………………..7 II.2.1 Nguyên lý……………………………………………...7 II.2.2 Cách tiến hành…………………………………………7 II.2.3 Kết quả………………………………………………...8 II.3 Kỹ thuật lai tại chỗ…………………………………………..11 II.3.1 Nguyên lý……………………………………………...11 II.3.2 Cách tiến hành…………………………………………11 II.3.3 Kết quả………………………………………………...13 II.4 Các phương pháp khác………………………………………18 II.4.1 Phương pháp PCR……………………………………..18 II.4.2 Phương pháp huyết thanh học………………………...18 KẾT LUẬN…………………………………………………………….20 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………..21