Đề tài Khảo sát một số đặc điểm của loài Cordyceps sp. được tìm thấy tại Đà Lạt

vô số bào tử vô tính. Tiếp sau đó ở những vùng nhất định của hệ sợi, trong điều kiện thuận lợi của môi trường hình thành nên cơ quan sinh sản cái (ascogon) và cơ quan sinh sản đực (antheredium) chúng thường hình thành từng cặp và sát nhau. Khi tiếp xúc với nhau thì diễn ra sự giao phối sinh chất. Sau đó ascogon hình thành các mấu lồi, từng cặp nhân và sinh chất đi vào các mấu lồi và hình thành nên sợi sinh túi. Cuối cùng ở đầu tận cùng của sợi sinh túi diễn ra quá trình hình thành túi có chứa các bào tử. Ngay từ khi có sự giao phối, cặp cơ quan sinh sản đã được các sợi nấm đơn bội bao quanh chúng phát triển lên cùng với các sợi sinh túi hình thành nên các sợi ngang xen giữa các túi trong lớp sinh sản cũng như bện chặt phía ngoài tạo nên thể sinh bào tử (ascocarpe). Khi nấm Cordyceps tấn công vật chủ, các hệ sợi nấm xâm chiếm và cuối cùng thay thế các mô của vật chủ, trong khi thể quả thuôn dài (chất nền bao gồm nhiều sợi nấm sinh sản vô tính) có thể có dạng hình trụ, phân nhánh hoặc hình dạng phức tạp. Chất nền mang nhiều thể quả túi nhỏ hình bình thót cổ, trong có chứa nhiều nang. Các nang nấm này chứa các bào tử nang dạng sợi chỉ, thông thường vỡ ra thành các mảnh và có lẽ là các thể lây nhiễm. Một vài loài Cordyceps có khả năng tác động tới hành vi của côn trùng vật chủ. Chẳng hạn, Cordyceps unilateralis làm cho kiến phải leo lên cây và gắn mình vào đó trước khi chết, đảm bảo sự phân phối tối đa các bào tử từ thể quả mọc ra từ cơ thể côn trùng đã chết. [15] Các loài thuộc chi này sinh sống chủ yếu tại châu Á (đáng chú ý là Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên và Thái Lan). Chúng sinh sôi nảy nở tốt trong các khu rừng ôn đới và nhiệt đới ẩm ướt [17]. Chúng có nhiều trạng thái sinh sản vô tính, trong đó Beauveria (có lẽ gộp cả Beauveria bassiana, Metarhizium và Isaria) là được biết đến nhiều nhất, do các dạng này từng được sử dụng trong kiểm soát sinh học đối với dịch hại do côn trùng. Theo công bố mới nhất của các nhà nấm học Thái Lan, chi nấm Cordyceps có tới khoảng 450 loài khác nhau. Chỉ riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 60 loài. Tuy nhiên, cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu được nhiều nhất hai loài: Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. và Cordyceps militaris ( Lex Fr.) Link. Loài thứ nhất gọi là đông trùng hạ thảo, loài thứ hai gọi là nhộng trùng hạ thảo. Đông trùng hạ thảo là một dạng cộng sinh giữa một loài nấm túi có tên khoa học là Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. với sâu non (ấu trùng) của một loài côn trùng thuộc chi  Hepialus. Thường gặp nhất là sâu non của loài Hepialus armoricanus. Ngoài ra còn 40 loài khác thuộc chi Hepialus cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh. Vào mùa đông nấm bắt đầu ký sinh vào sâu non và làm chết sâu non vì ăn hết chất dinh dưỡng của chúng. Mùa hè ấm áp nấm bắt đầu mọc ra khỏi sâu như một ngọn cỏ và vươn lên khỏi mặt đất. Đông trùng hạ thảo khi còn sống, người ta có thể trông rõ hình con sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá. Khi sấy khô, nó có mùi tanh như cá, đốt lên có mùi thơm. Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 - 11cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành. Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3-5 cm, đường kính khoảng 0,3 - 0,8 cm. Bên ngoài có màu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn. Phần đầu có màu nâu đỏ, đuôi giống như đuôi con tằm, có tất cả 8 cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất. Chất đệm nấm hình que cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút. Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng; chất đệm nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà. [17] Đông trùng hạ thảo chủ yếu tìm thấy vùng núi cao trên 4.000m ở cao nguyên Thanh-Tạng (Thanh Hải-Tây Tạng) và Tứ Xuyên (Trung Quốc). Cordyceps sinensis là một loại thuốc quý. Các nghiên cứu cổ truyền cũng như các thực nghiệm hiện đại đều xác định đông trùng hạ thảo hầu như không có tác dụng phụ đối với người và động vật. [17] Một vài loài trong chi Cordyceps là các nguồn hóa chất sinh học với các tính chất sinh học và dược học quý, như cordycepin; dạng sinh sản vô tính của Cordyceps subsessilis (Tolypocladium inflatum) là nguồn của cyclosporin — một loại dược chất hữu ích trong cấy ghép các bộ phận của cơ thể người, do nó kìm hãm hệ miễn dịch (thuốc ngăn chặn miễn dịch) [12]. Theo đánh giá của y học cổ truyền Trung Quốc cũng như các nghiên cứu gần đây cho thấy có tới hơn 20 tác dụng hữu ích của nhóm nấm này đối với con người như: - Chống lại tác dụng xấu của các tân dược đối với thận, thí dụ đối với độc tính của Cephalosporin . - Bảo vệ thận trong trường hợp gặp tổn thương do thiếu máu. - Chống lại sự suy thoái của thận, xúc tiến việc tái sinh và phục hồi các tế bào tiểu quản ở thận. - Làm hạ huyết áp ở người cao huyết áp. - Chống lại hiện tượng thiếu máu ở cơ tim. - Giữ ổn định nhịp đập của tim. -Tăng cường tính miễn dịch không đặc hiệu. - Điều tiết tính miễn dịch đặc hiệu. -Tăng cường năng lực thực bào của các tế bào miễn dịch. -Tăng cường tác dụng của nội tiết tố tuyến thượng thận và làm trương nở các nhánh khí quản. -Tăng cường dịch tiết trong khí quản và trừ đờm. - Làm chậm quá trình lão hoá của cơ thể. - Hạn chế bệnh tật của tuổi già. - Nâng cao năng lực chống ung thư của cơ thể. - Chống lại tình trạng thiếu oxygen của cơ thể. - Tăng cường tác dụng lưu thông máu trong cơ thể. - Hạn chế tác hại của tia gamma đối với cơ thể. - Tăng cường tác dụng an thần, trấn tĩnh thần kinh. - Tăng cường việc điều tiết nồng độ đường trong máu. - Làm giảm cholesterol trong máu và chống xơ vữa động mạch. - Xúc tiến tác dụng của các nội tiết tố (hormone). - Tăng cường chức năng tiêu hoá và hấp thu các chất dinh dưỡng - Ức chế vi sinh vật có hại, kể cả vi khuẩn lao. - Kháng viêm và tiêu viêm. - Có tác dụng phòng chống các rối loạn tình dục cho cả 2 giới. 1.2. Ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng Cacbonhydrat, đạm lên sự phát triển của nấm. 1.2.1. Nguồn Cacbonhydrat Nấm sử dụng nguồn Hydrat Cacbon để tổng hợp nên các thành phần cấu trúc tế bào, trao đổi chất và năng lượng trong tế bào và cơ thể. Đối với từng loại nấm khác nhau thì yêu cầu về nguồn Cacbon khác nhau cho quá trình sống của chúng vì chúng có đặc điểm về hình thái, cấu tạo khác nhau do đó sử dụng nguồn Cacbon rất đa dạng mà chủ yếu là những polyme của các loại đường phức tạp, chỉ có một số rất ít các hợp chất Cacbon mà nấm không sử dụng được như parafin, dầu mỏ [7] do vậy nấm có sự phân biệt rất lớn về khả năng sử dụng các nguồn Cacbon, một nửa trọng lượng khô của quả thể nấm được tạo từ Cacbon, có thể nấm đòi hỏi một lượng Cacbon lớn hơn bất kỳ một nguyên tố khác. Nấm cần nguồn Cacbon như một yếu tố bắt buộc [6]. Có ý kiến cho rằng glucose là loại đường đơn sử dụng tốt nhất cho các loại nấm ăn. Tuy nhiên, nhiều loại nấm cũng mọc tốt trên các loại đường đơn khác như D-fructoza, D-manoza và D-galactoza trừ những ngoại lệ tìm thấy ở Chytridales, Blastocladiales và Saproleguiales. Các loại polysaccarit như cenlulose, tinh bột, glycogen đều được nấm sử dụng và thường thì nó thuỷ phân thành oligosaccharide như mantose, saccharose, lactose, cellobiose nhưng cũng có một số loài có khả năng sử dụng trực tiếp, điều này tuỳ thuộc vào sự có mặt của các enzyme cần thiết. [6] Theo kết quả nghiên cứu của Yu-Xiang Gu và cộng sự (2007) đã chỉ rằng khi sử dụng 4% đường thì sinh khối của nấm Cordyceps militaris tăng mạnh và nó sẽ giảm khi nguồn đường bị cạn kiệt. Nguồn Cacbon là nguồn hỗ trợ cho sự sinh trưởng của tế bào tốt hơn so với nước chiết khoai tây (từ 20,4 ± 1,3g đến 29,6 ± 1,4g vào ngày thứ 5. Sự sinh trưởng của tế bào đạt cực đại khi sử dụng 20 % nước chiết khoai tây có bổ sung 2 % đường sucrose. Khi sử dụng PG (20 % nước chiết khoai tây có bổ sung 2 % đường glucose) thì cho sinh khối thấp hơn so với khi sử dung PS nhưng nó là nguồn Cacbon thích hợp cho sự tích luỹ nucleoside và bazơ. Các tác giả cũng nhận thấy rằng khi nồng độ glucose tăng từ 0,5 – 6 % thì sinh khối tăng từ 20,2 ± 1,5g đến 31,2 ± 1,4g. Tuy nhiên sự tăng nucleoside và bazơ không theo khuynh hướng đó mà số lượng tối đa của adenosine, guanosine, cytidine, adenosine, uracid đạt được khi sử dụng 2 % glucose. 1.2.2. Nguồn Nitơ Nấm sử dụng Nitơ để cấu tạo nên màng sợi nấm dưới dạng các hợp chất kitin, ngoài ra Nitơ còn tham gia vào thành phần cấu trúc của tế bào, cơ thể dưới dạng protein, enzyme, coenzyme... do đó Nitơ là nguồn dinh dưỡng không thể thiếu được ở nấm. Nấm có thể sử dụng các nguồn Nitơ khác nhau như: nitơ không khí, nitrat, amon và Nitơ hữu cơ [6]. Nhưng không phải các nguồn Nitơ đều thích hợp như nhau cho tất cả loài nấm, nấm có thể đặc trưng về nguồn Nitơ mà chúng sử dụng và một số tác giả khác đã phân loại nấm dựa theo khả năng sử dụng nguồn Nitơ. Do vậy, việc chọn nguồn Nitơ thích hợp là rất quan trọng để đạt chất lượng sinh trưởng cao của hệ sợi và sự hình thành quả thể. Theo kết quả nghiên cứu của Yu-Xiang Gu và cộng sự (2007) đã chỉ ra rằng: Sự ảnh hưởng của pepton, cao nấm men (yeast extra) và sự kết hợp của cả hai tại các nồng độ khác nhau lên sự sinh trưởng của nấm Cordyceps militaris là không lớn lắm. Tuy nhiên các nguồn Nitơ khác nhau ảnh hưởng khác nhau lên sự hình thành nucleosid và bazơ. Mặc dù sự khác nhau này là không dễ nhận thấy trong hầu hết các trường hợp. Sự kết hợp của 0,3% cao nấm men (yeast extract) và 0,3% pepton là sự lựa chọn tốt nhất cho nấm Cordyceps militaris về nguồn Cacbon. Nếu nguồn Nitơ được sử dụng riêng lẻ thì có thể xác định gần đúng nồng độ tối ưu của mỗi nguồn Nitơ cho sự phát triển của nấm. Khi dùng những muối amon của các acid mạnh, nồng độ tối ưu thường thấp vì nồng độ cao muối amon sẽ dẫn đến tình trạng ngộ độc bởi sự giảm pH trong dung dịch (6). Thông thường sợi nấm tập trung nguồn nitơ hữu cơ cao hơn so với nguồn Nitơ vô cơ. Nguồn Nitơ hữu cơ thích hợp là amino acid (arginin, acid glutamic, glycerin...), peptid, protein, ure, pepton là hỗn hợp phức tạp của peptid và protein. Pepton chứa phần lớn các vitamin tan trong nước và là nguồn Nitơ hữu ích đươc sử dụng trong nuôi trồng một số loại nấm đặc trưng [7]. Các amino acid không có giá trị như nhau đối với sự dinh dưỡng nấm. Ảnh hưởng một amino acid lên quá trình sử dụng những loài nấm khác nhau thì thay thế theo những amino acid liên quan và loại nấm đặc trưng, thường thì asparamin cho sự sinh trưởng tốt nhất rồi đến glycine, acid asparamic, acid lactic. Sự thay đổi nồng độ Nitơ trong môi trường dinh dưỡng đưa đến sự thay đổi về sản lượng và thành phần sinh hoá của hệ sợi nấm. Do đó nhiều tác giả đã nghiên cứu việc bổ sung đạm vào môi trường nuôi trồng nấm và đã rút ra kết luận sau: Amonium phosphat, amonium sulfat, amonium clorua...tốt với nấm Pleurotus ostreatus; postassium nitrat đối với Pleurotus sajor-caju, ure với Pleurotus florida... 1.3. Các nhân tố sinh thái ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm. 1.3.1. Nhiệt độ Nhìn chung nấm đòi hỏi nhiệt độ tương tự nhau, nhiệt độ tối ưu khoảng 25ºC, nhiệt độ tối thiểu từ 0 – 5ºC. Trên 30ºC hầu hết các loài nấm ăn ưa nhiệt trung bình bị thiệt hại, ngoại trừ Coprinus fimentanus và Volvariella volvacea thích nghi với điều kiện nhiệt đới. Đối với nấm Cordyceps sinensis (Paecilomyces hepialis) Cs-4 phát triển tốt ở nhiệt độ 23ºC. Sự sinh trưởng của hệ sợi và hình thành quả thể nấm ăn diễn ra trong giới hạn dao động nhiệt khá rộng. Nhiệt độ cực thuận cho sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và sự hình thành quả thể khác nhau. Nhiệt độ để hình thành quả thể thường thấp hơn nhiệt độ sinh trưởng của sợi nấm. Cuối giai đoạn nuôi hệ sợi, sự thay đổi đột ngột nhiệt độ sẽ thúc đẩy ra nhiều quả thể. Độ pH Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng độ pH thích ứng ở các nhóm nấm khác nhau thì khác nhau, nhìn chung giá trị pH 7. Theo kết quả nghiên cứu của M. Petre, M. X. Pen và L. X. Mao. Khi nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis (Paecilomyces hepiali) Cs-4 thì các tác giả nhận thấy ở pH bằng 5,5 thì nấm phát triển tốt nhất. Sự thay đổi pH có thể ảnh hưởng đến giá trị của nguồn dinh dưỡng và sự có mặt hay vắng mặt vi sinh vật cạnh tranh. 1.3.3. Sự thông khí Nấm là cơ thể sống, cho nên trong hoạt động của chúng sự hô hấp đóng vai trò rất quan trọng, do vậy hầu hết các loài nấm đều cần nhiều O2 cho hoạt động hô hấp. Ví dụ: nấm bào ngư giai đoạn nảy mầm của bào tử và sinh trưởng của hệ sợi có liên quan đến nồng độ CO2 cao, 22%. Dựa vào đặc điểm này, khi ủ hệ sợi nấm bào ngư có thể đậy kín để duy trì nồng độ CO2 cao, vừa ức chế vi sinh vật cạnh tranh vừa giúp hệ sợi mọc nhan; nhưng ở giai đoạn ra quả thể nấm bào ngư cần thông thoáng hơn các nấm khác, nếu không mũ nấm sẽ dẹp, chân dài, dẫn đến quả thể nấm bị dị dạng. 1.3.4. Độ ẩm Độ ẩm là yếu tố rất quan trọng, có liên quan mật thiết đối với nhiệt độ. Độ ẩm quá cao hay quá thấp đều gây trở ngại cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm. Độ ẩm phân biệt thành hai loại: + Độ ẩm của không khí: Hầu hết các loại nấm trồng đều ưa độ ẩm không khí cao; tức là lượng hơi nước trong không khí nhiều. Nơi nào càng ẩm nơi đó càng nhiều nấm xuất hiện. Độ ẩm thích hợp là 70 – 90% đối với nấm trồng. + Độ ẩm cơ chất: Là độ ẩm của nguyên liệu nuôi trồng sau khi tưới. Độ ẩm cơ chất khoảng từ 70 – 80% và 80 – 95% là thích hợp cho sự sinh trưởng của hệ sợi và hình thành quả thể nấm. Độ ẩm của nguyên liệu quá cao sẽ làm cho tế bào nấm bị trương nước và tan rã. Ngược lại, khi có quả thể nếu thiếu độ ẩm trong nguyên liệu, tai nấm sẽ bị teo [7]. Đặc biệt hầu hết các trường hợp trồng nấm, người ta đều tránh không bị úng nước, vì độ ẩm quá cao mầm bệnh dễ phát sinh. Vì vậy, việc điều chỉnh độ ẩm cần hết sức thận trọng, phải tuỳ từng loài nấm, tuỳ từng giai đoạn phát triển của nấm. PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu chúng tôi nghiên cứu được thu thập tại vùng núi Langbiang - Lâm Đồng. Mẫu được thu thập ngoài tự nhiên theo những thời gian nhất địmh và được ghi chép các đặc điểm dễ mất như màu sắc, mùi vị... được chụp hình theo các góc độ khác nhau. Mẫu này hiện đang được lưu trữ tại phòng công nghệ vi sinh, Viện sinh học Tây Nguyên. 2.2. Phương pháp thu mẫu và bảo quản 2.2.1. Dụng cụ thu mẫu tươi Dao nhọn, túi nilon, hộp nhựa, máy ảnh, kính lúp 2.2.2. Phương pháp thu mẫu Đa số các loài thuộc chi này thường mọc trên xác của côn trùng nằm trên lá, dưới đất hoặc trong các hốc cây gỗ mục... vì vậy khi thu hái chúng tôi dùng dao để tách chúng cùng với xác côn trùng mà chúng mọc trên đó. 2.2.3. Xử lý mẫu Với mẫu tươi sau khi quan sát, mô tả, chụp hình, ...chúng tôi tiến hành tách giống tại chỗ hoặc đem về phòng thí nghiệm tách giống sớm. 2.3. Phương pháp phân tích mẫu 2.3.1. Dụng cụ dùng trong nghiên cứu 2.3.1.1. Dụng cụ dùng trong phân tích các dẫn liệu hình thái Lame, lamelles, kính lúp, kính hiển vi, dầu kính và các vật liệu cần thiết khác. 2.3.1.2. Dụng cụ dung để tách và phân lập giống Cồn 90ºC, ống nghiệm các loại, bình tam giác, bếp gas, nồi hấp tiệt trùng, dụng cụ phân lập, các vật liệu cần thiết để pha chế môi trường PGA, các vật liệu khác... 2.3.2. Phương pháp phân tích mẫu vật 2.3.2.1. Phương pháp phân tích các dẫn liệu hình thái Quan sát bằng mắt thường, với sự hỗ trợ của kính lúp có độ phóng đại 20 lần, kính hiển vi chúng tôi lần lượt xem xét và mô tả những đặc điểm về hình thái, màu sắc,... theo trình tự sau: - Quả thể: Màu sắc, hình dạng, kích thước - Cuống nấm: Hình dạng thẳng hay cong queo; kích thước: chiều dài, đường kính; bề mặt cuống nhẵn hay không nhẵn; có lông hay không; có vảy hay không có vảy - Thịt nấm: Kích thước dày mỏng, màu sắc, dòn hay dai - Thể dùi trống: hình dạng, màu sắc 2.3.2.2. Phương pháp phân tích các dẫn liệu hiển vi - Thể chén: hình dạng; kích thước: dài, đường kính; màu sắc - Thể túi: Vị trí, kích thước, hình dạng - Bào tử túi: Vị trí, kích thước, hình dạng 2.3.2.3. Phương pháp tách và phân lập giống Chuẩn bị môi trường PGA theo công thức sau: Agar: 15g. Glucose: 20g. Nước chiết 200g khoai tây. Nước vừa đủ 1 lit. Phân lập giống: Quả thể nấm tươi, rửa bằng nước cất vô trùng, sau đó khử trùng mặt ngoài bằng cồn 90ºC. Dùng dao mổ đã được thấm cồn và hơ qua ngọn lửa đèn cồn, tách lấy mô thịt bên trong ở những vị trí kín đáo ít tiếp xúc với nguồn bệnh, sau đó cấy vào môi trường thạch. 2.4. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Cacbon và Nitơ lên sự phát triển của nấm Cordyceps sp. 2.4.1. Dụng cụ: Bình tam giác, đĩa pettri, ống nghiệm, ống đong 500ml và 1000ml, cốc rót 250ml và 1000ml, bông không thấm nước, que cấy, đèn cồn, tủ cấy, thước đo, kính hiển vi, nhiệt kế, giấy quỳ... Nguyên liệu: Agar, khoai tây, các loại đường glucose (C̉6H12O6), saccharose (C6H22O11),mantose, arabinose. Các loại đạm: pepton, cao thịt, NH4NO3, NH2SO4 Nước. Giống nấm Cordyceps sp. Giống nấm sử dụng để nuôi cấy- trên môi trường đặc được giữ trên môi trường PGA (Potato – Glucose – Agar) trong ống thạch nghiêng ở nhiệt độ 25ºC ± 1; pH 6,5. 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu 2.4.3.1. Thí nghiệm khảo sát tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. trên các nguồn Cacbon khác nhau Tiến hành các bước sau: Pha môi trường: + Môi trường 1: Agar: 15g Saccharose: 20g Nước: 1 lit + Môi trường 2: Agar: 15g Glucose: 20g Nước: 1 lit + Môi trường 3: Agar: 15g Mantose: 20g Nước: 1 lit + Môi trường 4: Agar: 15g Arabinose: 20g Nước: 1 lit Đối với mỗi loại môi trường ta tiến hành đun sôi nhỏ lửa, cho đến khi tan hết agar, sau đó bổ sung đường vào khuấy đều cho tan hết đường rồi rót vào bình tam giác Hấp khử trùng: 121 ºC; 1,2atm, 45 phút. - Đổ môi trường: Lấy môi trường vừa được hấp khử trùng (còn lỏng) đem vào phòng cấy đổ vào đĩa petri và lắc ngang nhè nhẹ. Mỗi loại môi trường 7 đĩa. Môi trường cần được giữ ở nhiệt độ thường 30 ± 2 ºC từ 12 – 24 giờ để kiểm tra nhiễm đồng thời cũng để cho bay bớt hơi nước trên nắp đĩa. - Cấy giống Cordyceps sp. từ ống thạch nghiêng vào đĩa petri và đem nuôi. - Quan sát và so sánh tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm qua các loại môi trường khác nhau và rút ra kết luận. 2.4.3.2. Thí nghiệm khảo sát tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. trên các nguồn Nitơ khác nhau: NH4NO3, (NH4)2SO4, pepton, cao thịt. - Pha chế môi trường: Môi trường 1: NH4NO3 : 5g Agar: 15g Nước: 1 lit Môi trường 2: (NH4)2SO4: 5g Agar: 15g Nước: 1 lit Môi trường 3: Cao thịt : 5g Agar: 15g Nước: 1 lit Môi trường 4: Pepton : 5g Agar: 15g Nước: 1 lit Đối với mỗi loại môi trường tiến hành đun sôi nhỏ lửa cho đến khi tan hết agar sau đó bổ sung đạm vào rồi rót vào bình tam giác. - Khử trùng 121ºC ; 1,2atm; 45 phút. Đổ môi trường vào đĩa petri, mỗi loại 7 đĩa. Giữ môi trường ở nhiệt độ thường từ 12 – 24 giờ. Cấy giống Cordyceps sp. từ thạch nghiêng vào đĩa petri sau đó đem nuôi. Quan sát, đo đạc, so sánh, rút ra kết luận sự phát triển của hệ sợi. Sau khi khảo sát trên các loại đường đạm khác nhau. Tìm ra nguồn đạm, đường thích hợp cho sự phát triển của hệ sợi nấm ta tiến hành khảo sát trên các loại nồng độ khác nhau, để tìm ra nồng độ tối ưu cho sự phát triển của hệ sợi nấm. 2.4.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Nitơ lên khả năng sinh bào tử của nấm Cordyceps sp. Để biết được sự ảnh hưởng của nguồn Nitơ lên khả năng sinh bào tử của nấm Cordyceps sp. ta tiến hành đếm bào tử bằng phương pháp đếm hồng cầu. Cách tiến hành: Sau 8 ngày nuôi nấm Cordyceps sp. trên các loại đạm khác nhau: NH4NO3, (NH4)2SO4, pepton, cao thịt. Đối với mỗi loại ta lấy 1cm2 mẫu hoà vào 1ml nước lắc đều cho đến khi các bào tử dính trên thạch được hoà hết vào nước sau đó tiến hành đếm bằng phòng đếm hồng cầu. Cách đếm như sau: - Đậy lá kính lên lưới đếm. - Lắc đều ống nghiệm chứa bào tử. Hút bằng ống hút vô trùng, sau đó cho đầu ống hút tựa vào mép lá kính để dịch bào tử luồng vào giữa hai lớp kính. - Để yên 3-5 phút. - Chỉnh kính hiển vi với vật kính 40×, tìm lưới đếm trên phòng đếm hồng cầu. Chỉnh thị trường sao cho chứa trọn một ô lớn trong đó có 4 × 4 bằng 16 ô nhỏ. - Đếm số bào tử hiện diện trong ô lớn. Chỉnh thị trường tìm một ô lớn khác. Tiến hành đếm số bào tử của 5 ô lớn. 2.4.3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ đạm lên sự phát triển của hệ sợi nấm Cordyceps sp. - Chuẩn bị: 5 bình tam giác. 10 đĩa petri. Pepton ở các nồng độ: 5; 10; 15; 20; 30g/lit. - Pha môi trường: Agar: 15g/lit. Pepton: 5; 10; 15; 20; 30g/lit. Nước vừa đủ 1lit. - Đem hấp khử trùng: 121ºC ; 1 atm; 45 phút. - Đổ môi trường vào đĩa petri. - Sau khi hấp khử trùng đem phân phối môi trường vào các đĩa petri đã chuẩn bị sẵn, ứng với mỗi nồng độ đổ 3 đĩa. Để môi trường ổn định. - Cấy giống vào đĩa: 1 – 2 ngày sau khi đổ đĩa, cấy giống vào; sau đó đem nuôi. 2.4.3.5. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ đường lên sự phát triển của sợi nấm Cách làm tương tự như khi khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ nấm lên sự phát triển của hệ sợi nấm, chỉ khác là sử dụng đường thích hợp ở các mức nồng độ 5; 10; 15; 20; 30; 40; 50g/lit. Để xác định tốc độ sinh trưởng của hệ sợi trên môi trường dinh dưỡng đặc, ta tiến hành đo đường kính colonie sau 4 ngày và 8 ngày của quá trình nuôi cấy và tính tốc độ sinh trưởng trung bình của hệ sợi trong một ngày (đơn vị tính: µm/ngày). 2.4.4. Nuôi cấy sinh khối hệ sợi nấm - Chuẩn bị: 14 bình cầu 500ml cho 1,4 lit môi trường dinh dưỡng. Thành phần môi trường gồm : Pepton: 15g/lit Đường saccharose: 30g/lit Khoai tây: 200g/lit Nước vừa đủ 1,4 lit - Pha môi trường: Khoai tây cắt lát mỏng đem nấu lấy nước chiết. Sau đó bổ sung đường và pepton vào. Chỉnh cho tới vừa đủ 1,4lit. Khuấy đều cho đến khi tan hết đường và pepton là được - Hấp khử trùng ở 121ºC trong 45 phút, 1 atm. - Cấy giống: Cấy giống từ ống thạch nghiêng qua bình tam giác đã được chuẩn bị ở trên. Các thao tác được thực hiện trong phòng cấy vô trùng. - Đem nuôi: + 7 bình nuôi trong tủ ấm 25ºC ± 1. + 7 bình nuôi trong điều kiện được lắc liên tục trên máy lắc có tần số lắc 80 vòng/phút và biên độ 1cm, ở 25ºC trong 4 ngày - Các thí nghiệm tiến hành trong môi trường lỏng tĩnh, môi trường lỏng động,. Sau 8 ngày nuôi cấy sẽ thu được sinh khối, sấy khô và đem phân tích thành phần sinh khối. 2.4.5. Phân tích cấu trúc DNA ( Deoxyribonucleic Axit) Hiện nay người ta có xu hướng sử dụng kỹ thuật DNA để định loại nấm. Kỹ thuật này cùng với mô tả hình thái giải phẫu góp phần tăng tính thuyết phục trong việc định loại nấm. Người ta thường chọn phân tích vùng gen ITS của rDNA trong nghiên cứu định loại nấm. Đây là vùng có nhiều biến đổi giữa các loài khác nhau nhưng ít biến đổi trong loài. Chúng tôi tiến hành phân tích DNA của nấm Cordyceps sp. Các kỹ thuật cơ bản theo các quy trình chuẩn quốc tế. 2.4.5.1. Hoá chất và thiết bị dùng trong phân tích DNA a. Nguyên liệu Hệ sợi nấm được nuôi trong môi trường PDA.Trong 15 ngày ở nhiệt độ 25ºC để làm nguyên liệu dùng cho phân tích DNA b. Đệm phá tế bào. Pha đệm phá tế bào cho Eukaryota: Thành phần Hàm lượng Triston-X100 2% (v/v) SDS 1% NaCL 100mM Tris 10mM.pH 8 EDTA 1mM.pH 8 Glassbead, PCI (Phenol-Chlorofom-isoamylalcohol) 25:24:1, ĐệmTE, Proteinaza, ARNaza, Isopropanol, Ethanol, Binding bufer PBI, Bufer PE, EtBr (Ethylen bromide), Agaroza 1%, bộ Kit QIA gen (Đức), nước cất... c. Các thiết bị dùng trong phân tích DNA Autoclave; ependorf; Máy lắc ổn nhiệt (Nhật); máy lắc Gerhadt (Đức); tủ cấy vô trùng; máy ly tâm; máy nhân gen Geneamp PCR System; máy đọc trình tự ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer; máy ly tâm lạnh (Sigma, Đức); máy soi gel Bio rad; máy đo quang phổ UV 3000; máy điện di Bio rad; máy vortex; máy cô mẫu (Themosavant); tủ lạnh sâu, pipet Pasteur; dụng cụ nghiền... 2.4.5.2. Tách DNA cho phản ứng PCR - Tế bào nấm được nưôi cấy trên môi trường PGA trong ngày duy trì ở nhiệt độ 25 ºC. - Cho 400 µl đệm phá tế bào vào ống ependorf vô trùng 1,5ml. Lấy 2 vòng que cấy mẫu, nghiền bằng dụng cụ chuyên nghiệp. Thêm 0,3 glassbead trộn đều bằng vortex, thêm 400 µl PCI, trộn bằng vortex trong 2-3 phút. Ly tâm 15000 vòng/ phút. Lấy phần dịch nổi. - Thêm 200 µl TE, trộn nhanh, thêm 300 µl proteinaza (3mg/ml), đảo đều. Ủ 56ºC, trong 15 - 30 phút. Thêm 50 µl ARNaza (1mg/ml) đảo đều ủ 37 ºC trong 30 phút. - Thêm PCI với thể tích bằng thể tích mẫu và trộn đều, ly tâm 15000 vòng/phút, sau đó lấy phần nổi phía trên. Làm lại như vậy thêm 2 lần nữa. - Thêm 2 lần thể tích mẫu bằng 2- propanol để lạnh. Lấy phần kết tủa. - Rửa sạch phần kết tủa bằng ethanol 70% - Làm khô bằng không khí trong 5-10 phút. - Hòa tan tủa trong nước. - Giữ ở -20 ºC trước khi sử dụng. 2.4.5.3. Phản ứng PCR (theo Sugita và Nakase) Phản ứng PCR được tiến hành nhằm khuếch đại vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) của rDNA 26S với các thành phần và tỉ lệ sau: Hỗn hợp phản ứng: Thành phần Hàm lượng 10X Buffer 10 µl dNTP mixture 16 µl Mi ITS1 2 µl Mi NL4 2 µl TaqTm 1.2 µl MuADN10-100 ng 2 µl Nước cất Đến 100 µl Mồi xuôi ITS1: 5,-GTGGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG-3, Mồi ngượcNL4:5,-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3, - Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Bước tiến hành Nhiệt độ ºC Thời gian 1 94 1 phút 2 Lặp lại 35 lần chu kì sau 94 45 giây 53 45 giây 72 45 giây 3 72 7 phút 4 4 Hỗn hợp trên được tiến hành phản ứng nhờ máy PCR theo chu trình nhiệt thích hợp. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di và nhuộm bằng dung dịch Ethidium Bromit loãng và soi bằng máy soi gel. - Kiểm tra các sản phẩm PCR bằng điện di Đun tan 1% agroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất 98ml, agaroza:1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt trên tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 µl dung dịch 6X loading buffer với 5 µl mẫu trộn đều nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, dòng điện 80A trong 30 phút, ngâm bản gen trong dung dịch EtBr nồng độ 0,5 µl/ml 20 phút vớt ra. Quan sát vạch DNA trên máy soi gel. 2.4.5.4. Tinh sạch DNA sau khi thực hiện phản ứng PCR a. Xác định hàm lượng axit nucleic Trong thực tế, axit nucleic được sử dụng với lượng rất nhỏ khi tiến hành các thí nghiệm về DNA. Do đó lượng axit nucleic có thể được đo trực tiếp nên người ta thường đo nồng độ axit này tại bước sóng 260 nm (A260) bằng máy đo quang phổ kế. Một đơn vị (1,0) giá trị hấp thụ bước sóng 260 nm tương đương với nồng độ 50 µg/ml của DNA sợi kép, hoặc tương đương với nồng độ 40 µg/ml của DNA hoặc ARN mạch đơn. Tỉ số A260/A280 là chỉ số cho thấy độ nhiễm các chất như phenol hoặc protein. Tỉ số A260/A280 là 1,8 đối với mẫu DNA sạch. Sử dụng bộ kit QIA gen thực hiện theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. + Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo tỉ lệ 5:1. Trộn đều. + Cho mẫu vào cột, ly tâm 10000 x g trong 30 giây. + Đổ bỏ dịch phía dưới cột. + Bổ sung 500 đệm PE lên cột. Ly tâm 10000 x g trong 30-60 giây. + Đổ bỏ dịch phía dưới cột. + Ly tâm tiếp 10000 x g trong 1 phút . + Chuyển cột sang ống eppendoff mới. + Thêm 30 µl nước. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút. + Ly tâm 10000 xg trong 1 phút. + Lấy dịch phía dưới. b. Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ khả kiến ở các bước sóng 260nm và 280nm. Tỉ lệ sạch: OD 260/OD 280 > 1,7. 2.4.5.5. Phản ứng khuyếch đại DNA cho sequencing Các sản phẩm PCR tinh sạch được khuyếch đại với bộ kit ABI PRISM Cycle sequencing và đệm sequence ( Perkin- Elmer Applied Biosystem ) với hỗn hợp phản ứng như sau: Terminator ready reaction mix 8µl Mẫu DNA sau PCR 200ng/ml Mồi 1 µl Nước cất Đủ đến 20 µl ITS1: 5,- GTGGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG-3, NL1: 5,- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAG-3, ITS4: 5,- TCCTCCGCTTATTGAATTGC-3, NL4: 5,- GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3, -Chu trình khuyếch đại DNA cho sequencing Bước tiến hành Nhiệt độ Thời gian 1 96 1 phút 2 Lặp lại 25 lần chu kì sau 96 10 giây 50 5 giây 60 4 phút 3 4 - Sản phẩm lúc này là các đoạn DNA đơn được duỗi ra. 2.4.5.6. Tinh sạch sản phẩm cho sequencing Mẫu được chuyển sang ống eppendoft 1,5 ml. Thêm 5 µl EDTA 1,25M, thêm 60 µl ethanol 100 %. Trộn thật nhẹ nhàng giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Đổ bỏ dịch phía trên. Rửa bằng 100 µl ethanol 70 %. Ly tâm 15000 vòng/phút trong 10 phút. Làm khô mẫu bằng máy cô quay chân không trong 3-5 phút. Đọc trình tự DNA Trình tự của ITS rDNA 26S của chủng nấm được đọc trực tiếp trên máy đọc tự động 3100 Avant. Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự của các loài đã được xác định trong ngân hàng gen. 2.5. Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phương pháp thống kê sinh học để tính sai số có thể ở mỗi loại nồng độ của từng môi trường. Sai số m được tính theo công thức: * Công thức tính trung bình mẫu : Với X : trung bình mẫu. n : tổng số mẫu, xi : mẫu đo được. * Công thức tính độ lệch chuẩn : Cách tính mật độ bào tử như sau: a x 4000 x 103 x 10n X (bào tử/ ml) = b a: Số bào tử trong 5 ô lớn b: Số ô con trong 5 ô lớn là 80 103: Số chuyển mm3 thành cm3 hay ml 10n: Độ pha loãng. PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Xác định loài 3.1.1. Mô tả đặc điểm hình thái của loài Cordyceps sp. Quả thể túi phát triển trên một cách tự do trên thân sâu róm, rời gốc. Màu nâu quế, đồng nhất. Chất nền của quả thể túi màu trắng, hơi giòn. Quả thể trưởng thành chia làm hai phần rõ rệt, phần cuống có đường kính 0,5 – 1mm, dài 6 – 8 mm. Bề mặt cuống nhẵn. Phần sinh sản hơi phình to lên ở giữa và thót dần lại về phía ngọn, kích thước 1 – 1,8 mm × 5 – 11 mm, chứa các thể chén, dạng cánh sen, nhô cao, gắn chặt vào xung quanh cuống. Kích thước: đường kính nơi lớn nhất từ 0.12 – 0.18 mm, dài từ 0.18 – 0.27 mm. Thể túi chứa bên trong chén có dạng sợi, kích thước: 4,0 – 4,5 × 400 - 450 µm. Bào tử túi dạng trứng kích thước 2 – 2,5 × 3 – 5 µm. Bên cạnh sự tồn tại của các quả thể túi còn có các cấu trúc dạng dùi trống dài 3-6 mm, không mang cấu trúc túi mà trên bề mặt chứa nhiều bào tử vô tính có màu trắng. Hình 1: Nấm Cordyceps sp. được thu thập từ tự nhiên Cuống nấm 5 mm Thể dùi trống Phần sinh sản 1 mm Hình 2: Cấu tạo của thể chén trên bề mặt của thể túi Hình 3: Lát cắt ngang của thể chén ở vật kính 10× 0,1 mm Hình 4: Các thể chứa bào tử túi 0,5 mm Hình 5: Các bào tử túi chụp ở vật kính 40× 10 µm Bào tử thường nảy mầm về cả 2 phía. Hệ sợi phát triển khá nhanh và sớm hình thành cơ quan sinh sản hữu tính là các thể bình. Các bào tử vô tính sau khi hình thành dính với nhau thành một chuỗi dài, rất dễ bị nhầm lẫn với dạng bào tử đốt. Hệ sợi ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang vàng nhạt, phát triển theo chu kỳ tạo nên các vòng đồng tâm. Trên bề mặt hệ sợi là một lớp bào tử vô tính, màu trắng, dày đặc. Trên môi trường nhân tạo, mầm quả thể túi được hình thành tương đối nhiều và dễ dàng, tuy nhiên chúng thường không phát triển tới giai đoạn trưởng thành. Hình 6. Sự nảy mầm của bào tử túi. Thể bình Hình 7: Các bào tử vô tính Thể bình Bào tử vô tính Hình 8. Sự phát triển của hệ sợi theo chu kỳ tạo nên những vòng đồng tâm. Hình 9: Các mầm của quả thể khi nuôi trong môi trường dinh dưỡng Dựa trên những đặc điểm về hình thái giải phẫu chúng tôi nhận định đây có thể là loài Cordyceps romosostipitata Kob. et. Shim. 3.1.2. Giải trình tự ITS rDNA Hình 10. Kết quả giải trình tự ITS rDNA (mồi xuôi) Hình 11. Kết quả giải trình tự ITS rDNA (mồi ngược) Sau khi có kết quả trình tự nucleotide ở vùng ITS, tiến hành so sánh với các chuỗi trên ITS của rDNA đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế ( ) bằng chương trình BLAST. Bảng 1. Kết quả so sánh trình tự ITS rDNA của Cordyceps sp. với dữ liệu đã công bố trên Genbank Sau khi so sánh trình tự ITS rDNA của Cordyceps sp. với dữ liệu đã công bố trên Genbank cho thấy mẫu vật thu được tại Langbiang - Đà Lạt có thể là một loài mới tuy nhiên chúng tôi vẫn chưa có đủ thông tin để đi đến kết luận này. Vì sự tương đồng của các trình tự mà chúng tôi so sánh trên ngân hàng dữ liệu chỉ có mức độ tương đồng đến 89 % so với mẫu của Đà Lạt. Theo bảng so sánh trên ta nhận thấy hầu hết các loài mà nó có độ tương đồng cao đều nằm trong chi Cordyceps. Ví dụ: So với Paecilomyces sp. thì mẫu thu được tại Đà Lạt có độ tương đồng cao tới 89% mà Paecilomyces là một thể vô tính của Cordyceps. Vì vậy, có thể xác định mẫu này thuộc chi Cordyceps. 3.2. Ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng Cacbon khác nhau lên tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. Để xác định được nguồn Cacbon thích hợp giúp cho sự sinh trưởng nhanh của hệ sợi loài Cordyceps sp. ta tiến hành nuôi cấy chúng trên các môi trường chứa các loại đường khác nhau: Glucose, arabinose, mantose, saccharose . Đường kính colonie Nguồn Cacbon sử dụng 4 ngày (mm) 8 ngày (mm) Tốc độ mọc (µm/ngày) Arabinose 1,33 ± 0,06 2,03 ± 0,08 175 ± 5,60 Glucose 1,64 ± 0,02 2,36 ± 0,07 180 ± 8,10 Mantose 1,51 ± 0,03 2,2 ± 0,06 172 ± 7,30 Saccharose 1,56 ± 0,03 2,36 ± 0,06 200 ± 6,70 Bảng 2: Ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng Cacbon khác nhau lên tốc độ sinh trưởng của loài Cordyceps sp. Đồ thị 1: Tốc độ sinh trưởng của nấm Cordyceps sp. trên các nguồn Cacbon khác nhau Từ bảng 2 và đồ thị 1 ta nhận thấy rằng trên các loại đường khác nhau thì tốc độ sinh trưởng khác nhau. Sau 8 ngày nuôi cấy sợi loài Cordyceps sp. ta thấy trong môi trường có đường saccharose hệ sợi phát triển tốt hơn cả. Trên môi trường có đường mantose và arabinose hệ sợi phát triển kém hơn so với đường glucose và saccharose, tuy nhiên có một điều nhận thấy là khi sử dụng đường là nguồn dinh dưỡng chính thì hệ sợi thưa hơn so với khi sử dụng đạm. Vì đây là nấm kí sinh trên côn trùng, trong cơ thể côn trùng giàu đạm vì vậy nguồn dinh dưỡng chính mà nó sử dụng là đạm chứ không phải là đường. Hình 12: Sợi nấm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi trường có chứa arabinose Hình 13: Sợi nấm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi trường có chứa glucose Hình 14: Sợi nấm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi trường có chứa saccharose Hình 15: Sợi nấm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi trường có chứa mantose 3.3. Ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng Nitơ khác nhau lên tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. Đường kính colonie Nguồn Cacbon sử dụng 4 ngày (mm) 8 ngày (mm) Tốc độ mọc (µm/ngày) Pepton 1,03 ± 0,02 2,06 ± 0,05 343 ± 3,80 Cao thịt 1,10 ± 0,01 2,11 ±0,01 336 ± 3,00 (NH4)2SO4 0,90 ± 0,02 1,67 ± 0,03 257 ± 7,60 NH4NO3 0,93 ± 0,03 1,73 ± 0,01 267 ± 1,90 Bảng 3 : Ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng Nitơ khác nhau lên tốc độ sinh trưởng của loài Cordyceps sp. Đồ thị 2: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. trên các nguồn dinh dưỡng Nitơ khác nhau. Từ bảng 3 và đồ thị 2 ta nhận thấy rằng trên các loại đạm khác nhau thì tốc độ sinh trưởng khác nhau. Đặc biệt ta thấy có sự khác nhau rõ rệt giữa nguồn đạm hữu cơ (pepton, cao thịt ) và đạm vô cơ (NH4NO3 và (NH4)2SO4). Sau 8 ngày nuôi cấy sợi nấm loài Cordyceps sp. phát triển tốt nhất trong môi trường chứa nguồn nitơ là pepton, tiếp theo là cao thịt. So với môi trường chứa nguồn nitơ vô cơ thì môi trường chứa nguồn Nitơ hữu cơ hệ sợi phát triển tốt hơn, phân nhánh nhiều hơn, độ dày colonie dày hơn. Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi trên môi trường chứa nguồn Nitơ là pepton là 343 µm/ngày còn trên (NH4)2SO4 chỉ có 257µm/ngày. Từ dẫn liệu và đồ thị có thể thấy hệ sợi loài Cordyceps sp. mọc tốt trên môi trường chứa nguồn Nitơ hữu cơ. Điều này cũng dễ hiểu vì Nitơ hữu cơ dễ phân hủy hơn so với Nitơ vô cơ. Hơn nữa trong bản thân con côn trùng giàu đạm, đây là nguồn dinh dưỡng chính mà nấm thuộc chi Cordyceps sử dụng. Vì vậy, nên sử dụng môi trường chứa pepton cho quá trình nghiên cứu tiếp theo. Ngoài ra có thể sử dụng cao thịt vì trong môi trường chứa cao thịt sợi nấm cũng phát triển tốt, chỉ kém một ít so với khi sử dụng pepton. Hình 16: Sợi nấm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi trường có chứa (NH4)2SO4 Hình 17: Sợi nấm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi trường có chứa pepton Hình 18: Sợi nấm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi trường có chứa cao thịt Hình 19: Sợi nấm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi trường có chứa NH4NO3 3.4. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ lên khả năng sinh bào tử của nấm Cordyceps sp. Để biết được sự ảnh hưởng của nguồn Nitơ lên khả năng sinh bào tử của nấm Cordyceps sp. ta tiến hành đếm bào tử được kết quả như sau: Nguồn Nitơ sử dụng Số tế bào trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ) Mật độ bào tử (Số bào tử/ ml) Pepton 420 210.105 Cao thịt 274 137.105 NH4NO3 99 49.105 (NH4)2SO4 52 26.105 Bảng 4: Khả năng sinh bào tử của nấm Cordyceps sp. trên các nguồn dinh dưỡng Nitơ khác nhau Đồ thị 3: Đồ thị biểu diễn khả năng sinh bào tử của nấm Cordyceps sp. trên các nguồn dinh dưỡng Nitơ khác nhau Từ bảng 4 và đồ thị 3 ta nhận thấy rằng trên các loại đạm khả năng sinh bào tử của nấm Cordyceps sp. có sự khác nhau rõ rệt. Sau 8 ngày nuôi cấy khả năng sinh bào tử của nấm Cordyceps sp. trong môi trường chứa nguồn nitơ là pepton là cao nhất, tiếp theo là cao thịt. So với môi trường chứa nguồn nitơ vô cơ thì trong môi trường chứa nguồn nitơ hữu cơ nấm Cordyceps sp. có khả năng sinh bào tử mạnh hơn. Số bào tử trên môi trường chứa nguồn Nitơ là pepton là 210.105 /ml còn trên (NH4)2SO4 chỉ có 26.105/ml Vì vậy, pepton là nguồn dinh dưỡng thích hợp cho khả năng sinh bào tử của nấm Cordyceps sp. 3.5. Ảnh hưởng nồng độ của nguồn Cacbon lên tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. Sau khi tìm được nguồn Cacbon thích hợp ta tiến hành khảo sát trên các mức nồng độ khác nhau để tìm ra nồng độ thích hợp cho sự phát triển của sợi nấm Cordyceps sp. Đường kính colonie Nồng độ saccharose (g/lit) 4 ngày (mm) 8 ngày (mm) Tốc độ mọc (µm/ngày) 5 1,07 ± 0,02 2,03 ± 0,01 240 ± 3,00 10 0,93 ± 0,01 1,93 ± 0,03 250 ± 1,90 20 1,05 ± 0,04 2,1 ± 0,06 262 ± 1,30 30 1,13 ± 0,05 2,2 ± 0,04 267 ± 1,70 40 1,1 ± 0,07 2,1 ± 0,01 250 ± 2,80 50 1,2 ± 0,06 2,17 ± 0,05 242 ± 6,50 Bảng 5: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. trên các nồng độ saccharose khác nhau. Đồ thị 4: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. trên các nồng độ saccharose khác nhau. Từ bảng 5 và đồ thị 4 chỉ ra rằng tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. không những phụ thuộc vào nguồn Cacbon mà còn phụ thuộc vào nồng độ của chúng trong môi trường. Khi nồng độ saccharose trong môi trường dinh dưỡng tăng từ 5-30g/l thì tốc độ sinh trưởng hệ sợi Cordyceps sp. tăng từ 240-267 µm/ngày, nhưng khi nồng độ của nó tiếp tục tăng từ 30-50g/l thì tốc độ sinh trưởng lại giảm dần từ 267-250 µm/ngày. Khi nồng độ saccharose trong môi trường dinh dưỡng là 30g/l thì tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. đạt cực đại là 267 µm/ngày. Vì vậy, khi ta bổ sung saccharose vào môi trường nuôi cấy ở nồng độ 30g/l thì hệ sợi nấm sinh trưởng tốt nhất. 3.6. Ảnh hưởng nồng độ của nguồn Nitơ lên tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. Sau khi tìm được nguồn Nitơ thích hợp ta tiến hành khảo sát trên các mức nồng độ khác nhau để tìm ra nồng độ thích hợp cho sự phát triển của sợi nấm Cordyceps sp. Đường kính colonie Nồng độ Pepton (g/lit) 4 ngày (mm) 8 ngày (mm) Tốc độ mọc (µm/ngày) 5 1 ± 0,020 1.9 ± 0,150 225 ± 0,900 10 0.77 ± 0,001 1.83 ± 0,020 265 ± 2,600 15 0.87 ± 0,030 2 ± 0,011 282 ± 2,200 20 0.43 ± 0,014 1.23 ± 0,030 217 ± 2,800 30 0.2 ± 0,022 0.67 ± 0,004 117 ± 0,090 Bảng 6: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. trên các nồng độ đạm khác nhau. Đồ thị 5: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. trên các nồng độ pepton khác nhau. Từ bảng 6 và đồ thị 5 chỉ ra rằng tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. không những phụ thuộc vào nguồn Nitơ mà còn phụ thuộc vào nồng độ của chúng trong môi trường. Khi nồng độ pepton trong môi trường dinh dưỡng tăng từ 5-15g/l thì tốc độ sinh trưởng hệ sợi tăng từ 225-282 µm/ngày, nhưng khi nồng độ của nó tiếp tục tăng từ 15-30g/l thì tốc độ sinh trưởng lại giảm dần từ 282-167 µm/ngày. Khi nồng độ pepton trong môi trường dinh dưỡng là 15g/l thì tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. đạt cực đại là 282 µm/ngày. Vì vậy, khi ta bổ sung pepton vào môi trường nuôi cấy ở nồng độ 15g/l thì hệ sợi nấm sinh trưởng tốt nhất, nhưng khi tiếp tục tăng nồng độ pepton thì lúc này vượt quá ngưỡng cần thiết của nấm Cordyceps sp. nó trở nên ức chế. Cụ thể là ở 20g/l thì sau 4 ngày đầu sợi nấm chỉ mới xù ra rất nhỏ, sau 8 ngày chỉ đạt 1,23mm, tốc độ mọc là 217 µm/ngày. 3.7. Khả năng tích luỹ sinh khối của hệ sợi nấm Cordyceps sp ở các trạng thái khác nhau của môi trường dinh dưỡng. Trạng thái môi trường Sinh khối (g/l) Lỏng-tĩnh Lỏng- động 12.25 ± 0,17 6.20 ± 0,24 Bảng 7: Sinh khối của hệ sợi nấm Cordyceps sp. ở các trạng thái khác nhau của môi trường dinh dưỡng. Từ kết quả nghiên cứu ở bảng 7 ta thấy khả năng tích luỹ sinh khối Cordyceps sp. phụ thuộc vào trạng thái môi trường dinh dưỡng ̣(lỏng tĩnh, lỏng động), mà sự khác nhau giữa các trạng thái môi trường chủ yếu là độ thông thoáng. Cordyceps sp. là loài nấm kí sinh trên côn trùng nằm ở trên lá hoặc trong các hốc cây, thích môi trường thiếu không khí. Ở môi trường lỏng - động, thì khả năng tích luỹ sinh khối thấp hơn so với khi ở trong môi trường lỏng động, chỉ bằng khoảng một nửa so với khi nuôi trong môi trường lỏng tĩnh. Vì ở môi trường lỏng tĩnh hệ sợi phát triển bề mặt cơ chất và chìm trong dung dịch, 75% hệ sợi chìm trong dung dịch trong điều kiện thiếu không khí, phù hợp với đặc điểm sinh lý của loài nên khả năng tích luỹ sinh khối là cao nhất. Hình 20 : Sợi nấm Cordyceps sp. nuôi trên môi trường lỏng tĩnh. Hình 21: Sợi nấm Cordyceps sp. nuôi trên môi trường lỏng động̣. Hình 22 : Sinh khối khô của hệ sợi nấm Cordyceps sp. sau 10 ngày nuôi cấy trong điều kiện lỏng tĩnh. Hình 23: Sinh khối khô của hệ sợi nấm Cordyceps sp. sau 10 ngày nuôi cấy trong điều kiện lỏng động. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I. KẾT LUẬN: Từ kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đưa ra một số kết luận sau: 1. Chưa đủ thông tin để xác định chính xác tên khoa học của loài Cordyceps sp. phát hiện tại Langbiang Đà Lạt. 2. Nguồn Cacbon thích hợp cho sự phát triển của hệ sợi nấm Cordyceps sp. là đường saccharose với nồng độ tối ưu là 30g/l. 3. Nguồn Nitơ thích hợp cho sự phát triển của hệ sợi nấm Cordyceps sp. là pepton với nồng độ tối ưu là 15g/l. 4. Khả năng tích luỹ sinh khối hệ sợi nấm trong cùng một loại môi trường ở các trạng thái nuôi cấy khác nhau thì khác nhau. Khi nuôi cấy ở trạng thái lỏng tĩnh khả năng tích luỹ sinh khối cao hơn so với khi nuôi cấy ở trạng thái lỏng động. II. KIẾN NGHỊ: 1. Tiếp tục nghiên cứu nhằm xác định chính xác tên khoa học của loài Cordyceps sp. khẳng định đây có phải là một loài mới hay không. 2. Tiếp tục khảo sát các nguồn Cacbon và nguồn Nitơ khác nhau lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps sp. Khảo sát ảnh hưởng của vitamin, chất kích tố sinh học, ảnh hưởng của nhiệt độ, pH lên quá trình phát triển hệ sợi nhằm xác định nguồn cơ chất tối ưu để nuôi trồng thu sinh khối loài nấm này. 3. Tiến hành nghiên cứu nuôi trồng thu quả thể, tìm hiểu các điều kiện môi trường, cơ chất thích hợp cho sự hình thành quả thể. 4. Phân tích thành phần của một số hợp chất có hoạt tính sinh học có tiềm năng ứng dụng trong y dược. 5. Khảo sát khả năng diệt trừ một số loài sâu của loài Cordyceps sp. Đà Lạt. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Nam Lê Bá Dũng (1991). Ảnh hưởng của một số nguồn dinh dưỡng̣̣ (Cacbon, Nitơ và vitamin) lên sự sinh trưởng của micelium của hai loài nấm kinh tế: Pleurotus cornucorpae và Pleurotus eryngii. Thông báo khoa học. Đại học Đà Lạt. Nguyễn Lân Dũng (2005). Công nghệ nuôi trồng nấm. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. Trương Thị Hồng (2008). Nghiên cứu sự phân hoá sinh địa học của nấm hương Shitakee Lentinula spp.. Luận văn thạc sĩ sinh học. Trịnh Tam Kiệt (1981). Vị trí của nấm trong sinh giới. Tạp chí sinh học số hai. Nguyễn Văn Lan; Đỗ Tất Lợi; Nguyễn Văn Thạch (1965). Kĩ thuật nuôi trồng và chế biến dược liệu. Nhà xuất bản y học Bắc Kinh. Lê Đình Lương, Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng (1982). Vi nấm. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Nguyễn Thúc Duy Phượng (1997). Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số nguồn dinh dưỡng̣̣ và một vài Phytohormon lên sự sinh trưởng của của hệ sợi nấm Poria coccus Wolf. Luận án thạc sĩ sinh học. Hoàng Thị Sản (2007). Phân loại học thực vật . Nhà xuất bản giáo dục. Lê Xuân Thám (2000). Nấm Hương Cao Bằng – Taxon đặc biệt trong chi Lentinula Earle. Tạp chí dược học số 3: 6-9. Tài liệu tham khảo tiếng nước ngoài Chang Shu-Ting; Jonh A. Buswell and Siu-Wai Chiu (1993). Mushroom Biology and Mushroom Products. The Chinese university Press, Hong Kong. Gu Yu-Xiang; Wang Zun-Sheng; Wang Su-Xia; Yuan Qin-Sheng (2007). Effect of multiple factors on accumulation of nucleosides and bases in Cordyceps militaris. Food Chemistry 102: 1304-1309. Holliday, John; Cleaver Phillip; Lomis-Powers Megan; Patel Dinesh (2004). Analysis of Quality and Techniques for Hybridization of Medicinal Fungus Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. (Ascomycetes). International Journal of Medicinal Mushrooms (New York: Begell House) 6 (2): 152.  Kobayasi, Y. (1982). The genus genera Cordyceps and Torrubiella. Transactions of the Mycological Society Japan 23: 329-364. Petch, T. (1926). Note on entomogenous fungi. Transactions of the British Mycological Society 15: 209-245. Sung, Gi-Ho; Nigel L. Hywel-Jones; Jae-Mo Sung; J. Jennifer Luangsa-ard; Bhushan Shrestha; Joseph W. Spatafora (2007). Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi. Studies in Mycology 57 (1): 5–59.  Wang, Z. S.; Gu, Y. X.; Yuan, Q. S. (2006). Effect of nutrition factors on the synthesis of superoxide dismutase, catalase, and membrane lipid peroxide levels in Cordyceps militaris mycelium. Current Microbiology 52: 74-79. Winkler, D. (2008). Yartsa Gunbu (Cordyceps sinensis) and the Fungal Commodification of the Rural Economy in Tibet AR. Economic Botany 63 (2): 291-306.