Đề tài Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính Nitrogenaza và sinh tổng hợp IAA từ đất thôn Bình Kỳ - Hòa Quý - Ngũ Hành Sơn - TP Đà Nẵng

Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 300 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN AZOTOBACTER CÓ HOẠT TÍNH NITROGENAZA VÀ SINH TỔNG HỢP IAA (INDOL AXETIC AXIT) TỪ ĐẤT THÔN BÌNH KỲ- HÒA QUÝ- NGŨ HÀNH SƠN- TP. ĐÀ NẴNG TO ISOLATE AND TO SELECT NITROGENASES ACTIVE BACTERIAL GENERA AZOTOBACTER AND SYNTHESIZE AIA FROM HAMLET BINH KY- HOA QUY- NGU HANH SON LAND SVTH: NGUYỄN KIM ANH, lớp 04SM PHẠM THỊ NGỌC ANH, lớp 05CSM1 LÊ THỊ THÚY HOA lớp 05CSM1 NGUYỄN THỊ QUỲNH NHƯ, lớp 05CSM1 ĐẬU THỊ TỈNH, lớp 04SM GVHD:TS. ĐỖ THU HÀ Khoa: Sinh- Môi trường, Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng. TÓM TẮT Từ 30 mẫu đất trồng lúa, trồng rau và đất bỏ hoang… tại thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành Sơn- TP.Đà Nẵng, đã phân lập và tuyển chọn được 08 chủng vi khuẩn Azotobacter có khả năng cố định đạm, trong đó có 02 chủng có khả năng sinh tổng hợp IAA. Tuyển chọn được 2 chủng có hoạt tính mạnh nhất: Chủng BK- 6 cố định đạm mạnh nhất, chủng BK- 5 sinh tổng hợp IAA mạnh nhất. Có thể ứng dụng 2 chủng này làm phân bón vi sinh để kích thích sự sinh trưởng của thực vật hoặc bổ sung vào các vùng đất bạc màu, nghèo dinh dưỡng để nâng cao nguồn đạm trong đất, cải thiện sinh thái đất SUMMARY Laterfrom 30 soil sample is different: abandonned land rice cultivar, vegetable-raising,.at Binh Ky hamlet, us have already been isolated and selections to 8 genera have Azotobacter bacteria capable of nitrogen fixation, among them there iss 2 genera be capable to synthesize AIA. can apply those active banian make cropped's growth excitation microbiological fertilizer or additives 2 bacterial genera to ash level of nitrogen exacerbation degraded earth regions 1. Mở đầu 1.1. Đặt vấn đề Phân bón vi sinh (PBVS) có nhiều ưu điểm nổi trội so với phân bón hóa học, ngoài tác dụng nâng cao năng xuất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản xuất thì PBVS còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên tình hình sản xuất PBVS ở nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp do quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định. Do dó, nghiên cứu để hoàn thiện và nâng cao chất lượng PBVS là việc làm hết sức cần thiết. Trong đó, việc tuyển chọn, đánh giá hoạt tính của các chủng VSV là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm. Azotobacter là một loại vi khuẩn (VK) hiếu khí, sống tự do trong đất, chúng có khả năng cố định đạm cao và không phụ thuộc vào cây chủ. Ngoài đặc điểm trên thì một số chủng thuộc chi này còn có khả năng sinh tổng hợp nên IAA (chất kích thích sinh trưởng ở thực vật). Chính nhờ đặc điểm quan trọng đó VK Azotobacter được ứng dụng rộng rãi trong các chế phẩm PBVS làm tăng năng suất cây trồng. Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 301 Xuất phát từ lý do trên chúng tôi chọn đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng VK Azotobacter có hoạt tính Nitrogenaza và sinh tổng hợp IAA từ đất thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành Sơn- TP. Đà Nẵng” nhằm tìm ra các chủng VK Azobacter đa hoạt tính để ứng dụng cho nền nông nghiệp tại đia phương. 1.2. Mục đích của đề tài Phân lập và tuyển chọn một số chủng VK Azotobacter có hoạt tính Nitrogenaza và sinh tổng hợp IAA từ đất thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành Sơn- TP. Đà Nẵng. 1.3. Nội dung của đề tài - Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenaza và sinh tổng hợp IAA (Indol Axetic Axit) từ đất thôn Bình Kỳ- Hoà Quý- Ngũ Hành Sơn- TP Đà Nẵng. - Nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến sự sinh trưởng, khả năng cố định nitơ và sinh tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. - Thăm dò ảnh hưởng của dịch nuôi cấy các chủng VK tuyển chọn đến sự nảy mầm của hạt đậu đen. 1.4 Những đóng góp mới của đề tài Đề tài đã đi sâu vào nghiên cứu các chủng VK Azotobacter có khả năng cố định đạm và sinh tổng hợp IAA, có thể ứng dụng trong nông nghiệp làm phân bón vi sinh kích thích sinh trưởng của thực vật hoặc bổ sung vào các vùng đất bạc màu để nâng cao nguồn đạm trong đất, cải thiện hệ sinh thái đất. 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng - Các chủng VK Azotobacter được phân lâp từ một số mẫu đất thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành Sơn- TP. Đà Nẵng. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp thu mẫu, theo Erogov (1983). - Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng VK Azotobacter , Erogov,(1983). - Phương pháp đếm số lượng tế bào CFU/ml, theo Nguyễn Lân Dũng (1982). - Phương pháp xác định khả năng cố định đạm của VK Azotobacter: - Phương pháp so màu với thuốc thử Nessler, theo Lê Văn Khoa (1996). - Phương pháp xác định hàm lượng IAA theo Miska và Skovski,1983. - Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái của các chủng VK tuyển chọn, theo Nguyễn Lân Dũng (1988). - Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm dịch nuôi cấy các chủng VK tuyển chọn, Mai Thị Hằng, (2000). - Khóa phân loại của Bergey (1989), Gauzse và cộng sự (1983). 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng VK cố định nitơ và sinh tổng hợp IAA 3.1.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng VK Azotobacter cố định nitơ Từ 30 mẫu đất khác nhau (trồng lúa, trồng màu, đất bỏ hoang) tại thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành Sơn- TP.Đà Nẵng. Chúng tôi phân lập được 08 chủng VK có khả năng cố định nitơ, trên MT AT. Qua nghiên cứu chúng tôi nhận thấy cả 08 chủng VK phân lập được đều thuộc chi Azotobacter. Bảng 3.1. Hàm lượng NH4 + trong dịch nuôi cấy của các chủng VK Azotobacter tuyển chọn Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 302 Hình 3.1: Hình ảnh ống giống và phản ứng màu của 08 chủng VK tuyển chọn với thuốc thử Nessler 3.1.2. Tuyển chọn các chủng VK cố định nitơ mạnh Sau khi sơ tuyển được 08 chủng VK Azotobacter cố định nitơ, chúng tôi tiếp tục tuyển chọn các chủng có khả năng cố định nitơ mạnh dựa vào phản ứng màu với thuốc thử Nessler. Kết quả có 3 chủng mạnh, 2 chủng trung bình và 3 chủng yếu. Trong đó chủng BK- 6 có khả năng cố định đạm mạnh nhất (3,28mg/ml), chúng tôi chọn chủng này làm đối tượng cho các nghiên cứu sau. Hình 3.2: Hình ảnh ống giống và phản ứng màu của chủng BK- 6 với thuốc thử Nessler 3.1.3. Tuyển chọn các chủng VK Azotobacter sinh tổng hợp IAA Từ 8 chủng VK phân lập được, chúng tôi tiếp tục tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp IAA, dựa vào phản ứng màu với thuốc thử Salkowski. Kết quả, xác định được 2 chủng có khả năng sinh tổng hợp IAA. Trong đó chủng BK- 5 có khả năng sinh tổng hợp IAA mạnh (4,313 μg/ml). Chúng tôi chọn chủng này làm đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo. STT Chủng VK Hàm lượng NH4 + (mg/ml) Mức độ cố đinh nitơ 1 BK-1 3,10 Mạnh 2 BK-2 2,76 Trung bình 3 BK-3 2,98 Trung bình 4 BK- 4 3,14 Mạnh 5 BK-5 1,34 Yếu 6 BK-6 3,28 Mạnh 7 BK-7 1,65 Yếu 8 BK-8 1,74 Yếu Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 303 Hình 3.3: Hình dạng ống giống và phản ứng màu của chủng BK- 5 với thuốc thử Salkowski 3.2. Đặc điểm sinh học của các chủng VK tuyển chọn 3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy và hình thái của các chủng VK tuyển chọn Bảng 3.3: Đặc điểm nuôi cấy và hình thái của chủng VK tuyển chọn. Chủng VK Đặc điểm nuôi cấy và hình thái Ngày xuất hiện KL Màu sắc KL Hình dạng KL Nhuộm Gram Hình dạng tế bào. BK- 5 2 - Non: Trắng trong - Già: Trắng đục - Bề mặt nhẵn nhầy nhớt, khi già thì nhăn nheo, tròn đều. - Gram âm - Hình cầu BK- 6 5 - Non màu trắng đục, khi già chuyển màu vàng. - KL lồi, bề mặt nhẵn, nhầy nhớt - Gram âm - Hình que ngắn Hình 3.4: Hình ảnh khuẩn lạc và hình dạng tế bào của chủng BK- 5 và BK- 6 Trên MT lỏng, dịch nuôi cấy của cả 2 chủng đều có màu trắng đục đều đặn, có cặn. Khi già chuyển sang màu nâu đen, độ sánh cao. 3.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố MT tới sự sinh trưởng và hoạt tính của các chủng VK tuyển chọn - Chủng BK- 6 có khả năng sinh trưởng và cố định nitơ mạnh (4,52mg NH4 + /ml) trên MT AT sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ từ 28-300C. - Chủng BK- 5 có khả năng sinh tổng hợp IAA cao( 6,24µg/ml) trên MT nước mắm- pepton có bổ sung 0,1% tryptophan sau 5 ngày nuôi cấy lắc ở nhiệt độ 300C. 3.4. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng VK BK-5 tới sự nảy mầm của hạt đậu đen Sau 24 h, hạt đậu đen được xử lý bằng dịch nuôi cấy của chủng BK- 5 ở nồng độ pha loãng 10 -2 và 10 -3. Sau 72h, tỷ lệ nảy mầm ở nồng độ pha loãng 10-2 vượt 23% so với đối chứng. Như vậy dịch nuôi cấy của chủng BK- 5 đã kích thích và rút ngắn thời gian nảy mầm của hạt giống. Vì vậy, có thể ứng dụng chủng này để xử lý hạt giống trước khi gieo. Tuyển tập Báo cáo “Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học” lần thứ 6 Đại học Đà Nẵng - 2008 304 Hình 3.5: Hình ảnh hạt đậu đen nảy mầm trong đĩa petri sau 72h 3. Kết luận: + Từ 30 mẫu đất tại thôn Bình Kỳ- Hòa Quý- Ngũ Hành Sơn- TP Đà Nẵng, chúng tôi phân lập và tuyển chọn được 08 chủng VK thuộc chi Azotobacter có khả năng cố định đạm, trong đó chủng BK- 6 có khả năng cố định đạm mạnh nhất (4,52mg NH4 +). Chủng BK- 5 và BK- 6 vừa có khả năng cố định đạm, vừa có khả năng sinh tổng hợp IAA, trong đó chủng BK- 5 sinh tổng hợp IAA mạnh hơn (4,313µg/ml). + Từ 08 chủng VK Azotobacter trên, chúng tôi chọn được 02 chủng đầu dòng: - Chủng BK- 6 có khả năng sinh trưởng và cố định nitơ mạnh (4,52mg NH4 + /ml) trên MT AT sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ từ 28-300C. KL non màu trắng đục, nhày nhớt, khi già chuyển màu vàng nâu, TB hình que ngắn, bắt màu Gram âm. - Chủng BK- 5 có khả năng sinh tổng hợp IAA cao( 6,24µg/ml) trên MT 5 sau 5 ngày nuôi cấy lắc ở nhiệt độ 300C. KL màu trắng đục, nhày nhớt, TB hình cầu, bắt màu Gram âm. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Muộn, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập 1. NXB KH-KT Hà Nội. [2] Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng (2000), Sinh học vi sinh vật. NXB GD, Hà Nội. [3] Egorov N.X. (1983) , Thực hành VSV ( Nguyễn Lân Dũng dịch). NXB MirMatcơva, NXB KH-KT Hà Nội. [4] Bergey’s Manual systermatic Baderiology, vol.4(1989). [5] G.F. Gause T.P Preobrazenskai, M.A.Srensnicora, P.P. Terekhova, T. S. Macsimova “ Opredelitels actinomycetes”, Nauka, M.1983. Đối chứng Xử lý bằng dịch ở nồng độ 10-2