Hoàn thiện kỹ thuật trung hoà vi lượng (microneutralization) trong nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm h5n1

ung cấp bởi Tiến sĩ Levandowski – Viện nghiên cứu sức khỏe Quốc gia Hoa Kỳ (NIH). LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 32 2.2. Vật liệu 2.2.1. Dòng tế bào Dòng tế bào thận chó Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) do tiến sĩ Jean- Michel Garcia, Trung tâm nghiên cứu Pasteur – Trường Đại học tổng hợp Hồng Kông cung cấp. 2.2.2. Chủng virus Chủng virus vaccine A/Vietnam/1194/2004/H5N1 do TS Đinh Duy Kháng, Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học Việt Nam cung cấp. 2.2.3. Kháng nguyên và kháng thể - Kháng nguyên virus cúm gia cầm (A/Vietnam/Ck/6/03 H5N1) được bất hoạt bằng β-propiolactone do Tiến sĩ Nguyễn Tiến Dũng (Viện Thú y) cung cấp; - KT chuột kháng protein NP virus cúm A (Anti-NP mouse monoclonal antibody) được cung cấp bởi tiến sĩ John Meijer, Viện Nghiên cứu Quốc gia về sức khoẻ cộng đồng và môi trường, Hà Lan; - KT dê kháng chuột cộng hợp với peroxidase 1mg/ml (Goat anti-mouse IgG- peroxidase conjugated) (Công ty KPL, Mỹ). 2.2.4. Môi trường và hoá chất ¾ Môi trường nuôi cấy và rửa tế bào MDCK Môi trường Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) không đầy đủ: - DMEM (Gibco, Cat. # 12100-046): một gói được hòa tan trong 970 ml nước cất 3 lần; - NaHCO3: 3,7g; - Sử dụng HCl để chỉnh pH đạt 7,2; - Kháng sinh 100x (Gibco 15240-062): 10 ml; - HEPES 1M: 20 ml; LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 33 Môi trường DMEM đầy đủ: DMEM không đầy đủ + 10% FBS (Gibco) Môi trường xét nghiệm (Assay medium): DMEM không đầy đủ + 1% BSA (BSA fraction, Sigma); ¾ Dung dịch PBS 1x: NaCl(8g/l); KCl(0,2g/l); Na2HPO4.12H2O(3,58g/l); KH2PO4(0,24g/l), pH 7,2; ¾ Trypsin 0,2% pha từ bột trypsin (1:250) trong PBS 1x, pH 7,2, EDTA 0,001M (Gibco 27250-018) dùng cho tách tế bào; ¾ Trypsin-TPCK (2 mg/ml) (Sigma Cat. # T-8642) dùng cho gây nhiễm virus; ¾ Dung dịch cố định virus: 80% Acetone trong 20% PBS pH 7,2 được pha mới trong ngày; ¾ Đệm rửa: PBS + Tween-20 (0,05%); ¾ Đệm blocking: PBS + BSA (1%) + Tween-20 (0,1%); ¾ Dung dịch cơ chất: o-phenylenediamine-dihydrochloride (OPD) + đệm citrate pH 5,5 (58.8 g acid citric trisodium + 2L H2O, chỉnh pH tới 5.0 bằng HCl) + H2O2 30%. Các thành phần nêu trên được pha với tỉ lệ: OPD 0,05% (10 mg) + đệm xitrat (20ml) + H2O2 0,015% (10µl), pha trước khi cho vào phản ứng; ¾ Dung dịch dừng phản ứng H2SO4 1N. 2.2.5. Trang thiết bị - Tủ ấm nuôi cấy 370C, CO2 5%: Forma Series II, water Jacketed CO2, Hepa Class 100, Thermo Electron Corporation; - Tủ hút an toàn sinh học cấp 2: CSC và FluFrance Advangarde 100; - Kính hiển đảo soi ngược: Olympus CKX41, Nhật Bản (kèm máy ảnh); - Tủ lạnh (40C): Facis S.A., Pháp; - Tủ lạnh sâu: (-200C) Darling, HNA-270; (-800C) Sanyo, Nhật Bản; - Máy ly tâm: CR 412 Jouan; - Nồi khử trùng (Nhật Bản); LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 34 - Cân phân tích 10-4 g (Mettler Toledo); - Máy khuấy từ (RotoLab, OSI); - Máy đo pH: Corning Pinnacle, 530 pH meter; - Máy khuấy trộn Vortex: VF2, Janke & Kunkel; - PipetteMan các loại (Nichipet 7000 và Biohit), pipet đa kênh (8 & 12 kênh); - Chai nuôi cấy tế bào (25; 75; 175 và 225 cm2): Nunc hoặc Costar; - Tấm 96 giếng đáy bằng: Costar; - Falcon (15; 50ml) tiệt trùng: Nunc hoặc Costar; 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Thu nhận, xử lý và bảo quản mẫu huyết thanh Mẫu máu của 20 cán bộ và sinh viên khoẻ mạnh không có tiền sử tiếp xúc với virus cúm gia cầm thực tập tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Mẫu máu người tiếp xúc với bệnh nhân và người tiếp xúc với gia cầm (3-5ml) thu nhận ngoài thực địa được bảo quản lạnh 40C và được đưa về phòng thí nghiệm. Tiến hành ly tâm 1600 vòng/phút trong 30 phút để tách huyết thanh cùng ngày thu nhận mẫu trong tủ hút và chia nhỏ thành các phần. Mẫu huyết thanh được làm bất hoạt ở 560C trong 30 phút và được giữ trong điều kiện nhiệt độ -200C và được làm tan băng trước khi sử dụng. 2.4.2. Chuẩn độ kháng thể - Xác định nồng độ protein của KN virus cúm gia cầm do Tiến sĩ Nguyễn Tiến Dũng (Viện Thú y) bằng bộ kit chuẩn nồng độ protein (Biorad, Mỹ). Kết quả thu được trong mục 3.1; - Tiến hành pha loãng với tỉ lệ thích hợp để được nồng độ KN 10 μg/ml và 20μg/ml. Phủ KN với hai nồng độ nêu trên lên tấm 96 giếng dùng cho phản ứng ELISA, 40C, 18 tiếng; LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 35 - Pha loãng KT đơn dòng kháng NP giữa các cột của tấm theo tỉ lệ lần lượt là 1:1000; 1:2000; 1:4000; 1:8000; 1:12000; 1:16000. Cho vào mỗi giếng 100 µl và ủ trong 1 tiếng, ở nhiệt độ phòng; - Pha loãng KT dê kháng chuột cộng hợp với peroxidase giữa các hàng của tấm theo tỉ lệ lần lượt là 1:1000; 1:2000; 1:4000; 1:8000; 1:12000; 1:16000. Cho vào mỗi giếng 100 µl và ủ trong 1 tiếng, ở nhiệt độ phòng; - Cho vào mỗi giếng 100µl cơ chất OPD mới chuẩn bị; - Để khoảng 5 phút, tới khi các giếng chuyển màu thì thêm 100µl dung dịch; - H2SO4 1N vào mỗi giếng để làm dừng phản ứng; - Đọc kết quả ở bước sóng 490/620nm. 2.4.3. Chuẩn bị tế bào MDCK Tế bào MDCK (P6) cất giữ trong Nitơ lỏng với số lần cấy truyền thấp được lấy ra khỏi nitơ lỏng, nuôi giữ trong chai nuôi cấy với môi trường DMEM 10% FBS. Qua ít nhất là 3 lần cấy chuyển (tỉ lệ pha loãng tế bào mỗi lần cấy chuyển là 1:10), khi tế bào phát triển ổn định, chúng sẽ được sử dụng cho phản ứng MN. Số lần cấy chuyển tối đa cho mỗi dòng tế bào là 25-30 lần và mỗi chai nuôi cấy 75cm2 đủ dùng cho 4-6 tấm 96 giếng. Các bước chuẩn bị tế bào được tiến hành như sau: - Bỏ môi trường nuôi cấy trong chai; - Rửa tế bào 2 lần với PBS để loại bỏ hết FBS, hút sạch lượng PBS còn lại trong chai nuôi cấy; - Cho một lượng vừa đủ trypsin-EDTA để phủ toàn bộ bề mặt chai nuôi cấy; - Ủ ở 370C trong 5-10 phút, cho tới khi toàn bộ lớp tế bào tách ra khỏi bề mặt chai nuôi cấy; - Cho khoảng 5 ml DMEM 10% FBS vào trong bình, dùng pipet đánh tan các cụm tế bào sau đó chuyển toàn bộ lượng tế bào thu được vào ống ly tâm 50ml, bổ sung thêm môi trường xét nghiệm; - Ly tâm 1200 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng để rửa tế bào; LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 36 - Loại bỏ dịch nước nổi, thu cặn tế bào lắng dưới đáy ống, hoà tan và pha loãng các tế bào này trong môi trường xét nghiệm tới mật độ tế bào đủ để phủ kín bề mặt giếng (kết quả ở mục 3.3). 2.4.4. Chuẩn bị virus dùng cho phản ứng Virus vaccine được nuôi cấy trên phôi gà (tại viện Công nghệ Sinh học). Dịch khoang niệu được thu thập, chuyển tới viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, tại đây virus được cấy truyền 2 lần để tạo một được virus ổn định cho toàn bộ phản ứng MN. Lần cấy truyền thứ nhất (P1) nhân tạo chủng để cấy truyền lần 2 (P2). Quy trình gây nhiễm virus được tiến hành như sau: - Chuẩn bị tế bào MDCK tạo thành một lớp trong chai nuôi cấy với độ bao phủ khoảng 90%; - Loại bỏ môi trường trong chai nuôi cấy và rửa lần 1 bằng cách tráng tế bào với DMEM không có FBS. Lần thứ 2, để dung dịch rửa từ 1-2 tiếng, ở 370C, sau đó loại bỏ toàn bộ môi trường DMEM trước khi nhiễm virus; - Chuẩn bị môi trường nhiễm virus chứa trypsin-TPCK với nồng độ thích hợp (kết quả ở mục 3.2.1) và pha loãng virus P1 trong DMEM đã chuẩn bị một lượng vừa đủ để láng hết toàn bộ bề mặt tế bào (1ml cho chai 75cm2 và 4ml cho chai 175cm2); - Cho virus đã pha loãng vào trong chai nuôi cấy có chứa lớp tế bào MDCK nêu trên và lắc đều để virus tiếp xúc với toàn bộ bề mặt chai; - Ủ từ 1-2 tiếng ở 370C, cứ 15 phút lại nhẹ nhàng lắc chai nuôi cấy 1 lần nhằm trải đều virus trên bề mặt chai; - Bổ sung thêm môi trường DMEM có chứa trypsin-TPCK vào và để trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Sau 36-48 tiếng, quan sát hiệu ứng huỷ hoại tế bào do virus gây ra và thu hoạch virus khi hiệu ứng huỷ hoại tế bào đạt 90-95%; - Tiến hành ly tâm thu dịch nổi có chứa virus, chia virus ra các ống nhỏ và giữ trong điều kiện -800C, mỗi lần thực hiện phản ứng MN sử dụng một ống. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 37 2.4.5. Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy (TCID50) - Làm tan băng virus, pha loãng virus trên tấm 96 giếng theo ½ log10 (mỗi giếng có 100μl môi trường) theo sơ đồ hình 2.1: Hình 2.1: Sơ đồ thực hiện pha loãng virus theo ½ log10 - Bổ sung 100μl tế bào đã chuẩn bị với mật độ thích hợp ở mục 2.3.3 vào mỗi giếng, trộn đều và ủ trong tủ ấm 370C, 5% CO2 từ 18 đến 22 tiếng; - Sau thời gian ủ, hút bỏ toàn bộ môi trường có trong các giếng, rửa các giếng bằng PBS 1x (200µl); - Cho vào mỗi giếng 100μl dung dịch cố định virus, để 10 phút, sau đó loại bỏ hết dung dịch và để bay hơi hết dung dịch trong các giếng, giữ phiến tế bào ở -800C nếu không dùng ngay; - Thực hiện phản ứng ELISA mục 2.3.7 và tính giá trị trung bình (AvgCC) và độ lệch chuẩn (SD) của các giếng tế bào đối chứng; - Giếng được xác định là dương tính khi có giá trị OD lớn hơn AvgCC + 3 SD (ngưỡng dương tính); Thêm 146µl virus pha loãng ban đầu (1/100) Chỉ có môi trường (không có virus) Bỏ đi 46µl LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 38 - TCID50/100µl được tính bằng nồng độ pha loãng virus mà 50% số giếng có giá trị OD dương tính. TCID50 được tính theo phương pháp Reed-Muench: Bảng 2.1: Tính TCID50 theo phương pháp Reed-Muench Giá trị thu được (OD) Giá trị cộng dồn Pha loãng (1) dương tính (2) âm tính (3) dương tính (4) âm tính (5) Tỉ lệ (6) % dương tính 104 4 0 11 0 11/11 100 104,5 4 0 7 0 7/7 100 105 3 1 3 1 3/4 75 105,5 0 4 0 5 0/5 0 - Các bước tính TCID50 theo phương pháp Reed-Muench: xác định số giếng dương tính (1) và âm tính (2) ở mỗi độ pha loãng; tính giá trị cộng dồn từ dưới lên các của giếng dương tính (3) và giá trị cộng dồn từ trên xuống của các giếng âm tính (4); tính tỉ lệ phần trăm các giếng dương tính (5); tính khoảng cách số hạng của tỉ lệ thức giữa độ pha loãng có số giếng dương tính lớn hơn 50% và độ pha loãng có số giếng dương tính nhỏ hơn 50% (6); TCID50 được tính bằng cách cộng khoảng cách tính được nêu trên với độ pha loãng có số giếng dương tính lớn hơn 50%; mỗi giếng được ủ với 0,1ml virus được pha loãng, nên TCID50 tính được là TCID50/0,1 ml; chuyển về 100TCID50 bằng 10-3.15/0,1 ml, hoặc 10-2.8/50 μl. - Nồng độ virus được điều chỉnh để có 100 TCID50/50µl, kết quả sẽ được sử dụng cho phản ứng trung hoà. 2.4.6. Phản ứng trung hoà virus - Cho 50μl môi trường xét nghiệm vào các hàng BÆH; 90 μl môi trường xét nghiệm vào các giếng A1ÆA10; cho vào giếng tế bào đối chứng (CC) 50μl môi trường xét nghiệm; cho vào giếng virus đối chứng (CC) 50μl virus được pha loãng; - Mẫu huyết thanh đã bất hoạt ở 560C được cho vào các giếng A1ÆA10 (mỗi giếng 10μl), mỗi mẫu thực hiện hai lần, do vậy mỗi tấm 96 giếng sẽ kiểm tra được 5 mẫu; như vậy, độ pha loãng huyết thanh bắt đầu từ 1:10; LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 39 - Tiến hành pha loãng huyết thanh bậc 2 như hình 2.2; - Virus pha loãng tới nồng độ thích hợp được cho vào các giếng (50μl/giếng), trừ giếng tế bào đối chứng và chuẩn độ lại virus (như trong hình 3.2); Hình 2.2: Sơ đồ thực hiện pha loãng mẫu huyết thanh - Tiến hành chuẩn độ lại virus, đối chứng âm, đối chứng dương trên một tấm 96 giếng riêng (như trong hình 3.3), trong đó các bước chuẩn độ lại virus được tiến hành như sau: thêm 50µl môi trường xét nghiệm vào mỗi giếng B5ÆH5, thêm 100µl virus cần chuẩn độ (100TCID50) vào giếng A5, pha loãng virus theo tỉ lệ 1:2 bằng cách chuyển 50µl từ giếng A5 lần lượt qua các giếng B5ÆH5 và bỏ 50µl ở giếng cuối cùng, thêm 50µl môi trường xét nghiệm vào mỗi giếng, bổ sung 100µl tế bào với nồng độ thích hợp đã chuẩn bị vào tất cả các giếng; kết quả của phản ứng MN chỉ được chấp nhận khi kết quả chuẩn độ lại cho giá trị dương tính ở độ pha loãng từ 3Æ5, nếu kết quả dương tính ở độ pha loãng nhỏ hơn 3 tức là virus quá loãng và ngược lại nếu kết quả dương tính ở độ pha loãng lớn hơn 5 tức là virus quá đặc, do vậy phải tiến hành lại bước xác định TCID50; - Ủ trong tủ ấm 370C, 5% CO2 với thời gian 2 tiếng; Virus đối chứng (VC) Tế bào đối chứng (CC) Mẫu huyết thanh Pha loãng Bỏ 50 μl Bắt đầu 1/10 10µl mẫu + 90µl DMEM + 1% BSA Số mẫu LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 40 - Thêm 100μl tế bào đã chuẩn bị với mật độ thích hợp (xem kết quả ở phần 3.2) vào mỗi giếng, lắc nhẹ để trộn đều hỗn hợp, ủ 18-22 tiếng trong tủ ấm 370C, 5% CO2; - Lấy tấm 96 giếng ra, hút bỏ toàn bộ môi trường có trong các giếng, rửa các giếng bằng PBS (200 μl); - Cho vào mỗi giếng 100μl dung dịch cố định virus, để 10 phút, sau đó loại bỏ hết dung dịch và để bay hơi hết dung dịch trong các giếng; - Thực hiện phản ứng ELISA; - Hình 2.3: Sơ đồ thực hiện pha loãng huyết thanh với các mẫu đối chứng (1): Mẫu huyết thanh (3&4): Đối chứng dương (huyết thanh gà và huyết thanh cừu trên nền người âm tính) (2): Đối chứng âm (5): Chuẩn độ lại virus 2.4.7. Phản ứng ELISA - Rửa tấm 96 giếng đã có tế bào được cố định trong đó 3 lần bằng đệm rửa; - Pha loãng KT thứ nhất (KT đơn dòng chuột kháng protein NP của virus cúm A với nồng độ thích hợp) trong đệm blocking (mục 2.2.4), cho vào mỗi giếng 100µl và ủ 1 tiếng ở nhiệt độ phòng; Virus đối chứng (VC) Tế bào đối chứng (CC) Huyết thanh Pha loãng Bỏ 50 μl Thêm 100µl Bỏ 50 μl LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 41 - Rửa tấm 96 giếng 5 lần bằng đệm rửa; - Pha loãng KT thứ hai (KT dê kháng chuột, cộng hợp HRP với nồng độ thích hợp) trong đệm blocking (mục 2.2.4), cho vào mỗi giếng 100µl và ủ 1 tiếng ở nhiệt độ phòng; - Rửa tấm 96 giếng 6 lần bằng đệm rửa; - Cho vào mỗi giếng 100µl cơ chất OPD (0,05%), H2O2 (0,015%) trong đệm citrate pH 5,2) mới chuẩn bị; - Để khoảng 5 phút, tới khi các giếng chuyển màu trong khi giếng tế bào đối chứng vẫn không chuyển màu thì thêm 100µl dung dịch H2SO4 1N vào mỗi giếng để làm dừng phản ứng; - Đọc kết quả ở bước sóng 490nm/620nm. 2.4. Xử lý số liệu 2.4.1. Kết quả phản ứng trung hòa virus Hoạt tính trung hòa virus của từng mẫu huyết thanh được tính theo công thức sau: )( 2 )()( AvgCCAvgCCAvgVCX +−= Trong đó: - X là hoạt tính trung hòa virus của huyết thanh - AvgVC là giá trị trung bình hấp thụ bước sóng của các giếng virus đối chứng - AvgCC là giá trị trung bình hấp thụ bước sóng của các giếng tế bào đối chứng 2.4.2. Đọc kết quả Giếng có OD ≤ X được coi là dương tính, hiệu giá KT trung hoà là độ pha loãng huyết thanh ở 2 giếng cùng dương tính. Nếu có một giếng âm tính và một giếng dương tính thì hiệu giá sẽ là trung bình nhân của hai độ pha loãng. Huyết thanh được pha loãng với tỉ lệ 1:10, ngưỡng dương tính ≥ 20. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 42 2.4.3. Xử lý thông tin về người tiếp xúc Thông tin về tuổi, giới tính, nghề nghiệp, nơi ở, lịch sử tiếp xúc của người được thu nhận mẫu huyết thanh được thu thập bằng phiếu điều tra qua việc phỏng vấn cùng với quá trình thu nhận mẫu. Thông tin được nhập vào máy tính bằng chương trình Epi Info 6.0 và được xử lý bằng chương trình thống kê SPSS 15.0. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 43 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả chuẩn độ kháng thể dùng cho phản ứng ELISA 3.1.1. Nồng độ protein của virus cúm gia cầm Nồng độ protein của virus cúm gia cầm được xác định dựa trên đường chuẩn độ protein chuẩn (hình 3.1). y = 0.0005x + 0.302 R2 = 0.9878 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 200 400 600 800 1000 Nồng độ (µg/ml) O D 5 95 Nồng độ protein Linear (Nồng độ protein) Hình 3.1: Đường chuẩn độ protein chuẩn và protein cần xác định nồng độ Chúng tôi đã xác định được nồng độ protein của virus cúm gia cầm được sử dụng là 1.07 µg/ml. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 44 3.1.2. Chuẩn độ kháng thể dùng cho phản ứng ELISA Việc chuẩn độ được thực hiện theo các bước đã nêu trong mục 2.3.2. Chúng tôi tiến hành chuẩn độ KT với hai độ pha loãng KN là 10µg/ml và 20µg/ml. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2 và 3.3 dưới đây: LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 45 Bảng 3.1: Kết quả chuẩn độ KT ở nồng độ KN 10µg/ml Kháng NP Kháng chuột 1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:12000 1:16000 1:1000 1.892 1.623 1.763 1.733 1.566 1.649 1.497 1.501 1.452 1.356 1.229 1.197 1:2000 1.646 1.509 1.085 1.422 1.324 1.372 1.338 1.244 0.989 1.175 1.109 1.039 1:4000 1.441 1.378 1.23 1.242 1.154 1.135 1.094 1.023 0.88 0.929 0.294 0.852 1:8000 1.026 1.015 0.938 0.951 0.862 0.851 0.767 0.809 0.669 0.679 0.641 0.660 1:12000 0.857 0.935 0.869 0.943 0.667 0.72 0.646 0.684 0.663 0.585 0.541 0.643 1:16000 0.755 0.747 0.681 0.707 0.625 0.617 0.556 0.581 0.537 0.521 0.445 0.522 1:1000 (kháng NP-) 0.049 0.032 0.031 0.025 0.029 0.03 0.036 0.028 0.032 0.023 -0.02 -0.06 1:1000 (kháng NP-) 0.006 0.016 0.018 0.008 0.008 0.007 0.011 0.015 0.015 0.014 0.013 -0.38 Bảng 3.2: Kết quả chuẩn độ KT ở nồng độ KN 20µg/ml Kháng NP Kháng chuột HRP 1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:12000 1:16000 1:1000 2.593 2.041 1.961 1.933 1.688 1.739 1.606 1.577 1.386 1.473 1.422 1.661 1:2000 1.673 1.717 1.681 1.538 1.535 1.519 1.612 1.401 1.241 1.22 1.202 1.305 1:4000 1.317 1.458 1.454 1.34 1.264 1.28 1.172 1.19 1.049 1.077 1.074 1.048 1:8000 1.066 1.096 1.088 1.043 0.966 0.972 0.727 0.868 0.822 0.742 0.743 0.673 1:12000 0.822 0.868 0.844 0.831 0.797 0.773 0.703 0.681 0.609 0.612 0.599 0.567 1:16000 0.686 0.844 0.763 0.721 0.689 0.653 0.599 0.622 0.57 0.552 0.528 0.502 1:1000 Kháng NP 0.059 0.032 0.03 0.027 0.03 0.037 0.034 0.032 0.044 0.034 0.04 0.04 1:2000 Kháng NP 0.016 0.012 0.012 0.016 0.011 0.012 0.011 0.016 0.019 0.011 0.013 0.02 LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 46 Chúng tôi đã xác định được tỉ lệ pha loãng KT thích hợp dùng cho phản ứng ELISA, cụ thể là KT chuột kháng protein NP virus cúm A có độ pha loãng từ 1:4000 tới 1:8000 và KT dê kháng chuột cộng hợp với peroxidase pha loãng từ 1:2000 tới 1:4000. 3.2. Chuẩn bị virus dùng cho phản ứng MN 3.2.1. Xác định nồng độ trypsin sử dụng trong gây nhiễm virus Trypsin có vai trò giúp cho quá trình xâm nhiễm của virus vào trong tế bào dễ dàng hơn. Trypsin được xử lý với L-(tosylamido-2-phenyl)-etyl clorometyl keton (trypsin-TPCK) có tác dụng phân cắt một số liên kết peptit nội chuỗi xác định, cụ thể là liên kết peptit giữa đầu cuối C với lysin và arginin. Chúng tôi đã tiến hành gây nhiễm virus H5N1 lên tế bào MDCK với sự có mặt của trypsin-TPCK ở các nồng độ khác nhau: 1μg/ml; 2μg/ml; 5μg/ml. Kết quả là hiệu ứng huỷ hoại tế bào (CPE) quan sát được sau khi gây nhiễm 22 tiếng ở các nồng độ lần lượt là 30%, 60% và 90% (Hình 3.1). Bên cạnh đó, kết quả của phản ứng được thể hiện trong bảng 3.3. Bảng 3.3: Kết quả HA ở các nồng độ trypsin và độ pha loãng virus Nồng độ trypsin Hiệu giá HA Pha loãng virus 10-3 Pha loãng virus 10-4 1μg/ml 20-40 < 10 2μg/ml 20 40 5μg/ml 160 - 320 10 - 320 (Pha loãng 10-3 tương đương với MOI : từ 2x10-3 tới 4x10-3) LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 47 Như vậy, trypsin-TPCK ở nồng độ 5μg/ml cho hiệu quả virus cao nhất khi gây nhiễm virus vaccine H5N1 vào tế bào nồng độ trypsin-TPCK 5μg/ml sẽ được chúng tôi sử dụng trong các lần gây nhiễm tiếp theo. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 48 F: TB không nhiễm virus; độ khuếch đại 20xE: Tế bào sau 24h nhiễm virus; độ khuếch đại 20x A: CPE 30%; độ khuếch đại 10x B: CPE 60%; độ khuếch đại 10x D: TB không nhiễm virus; độ khuếch đại 10xC: CPE 90%; độ khuếch đại 10x Hình 3.2: Hiệu ứng huỷ hoại tế bào của virus (ở 2 độ phóng đại 10x và 20x) LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 49 Hình 3.3: Hiệu giá virus (HA) trên hồng cầu gà 0,5% (-): Đối chứng âm (tế bào hồng cầu gà) (+): Đối chứng dương (KN 6/03 H5N1 pha loãng 1:8) 1: Trypsin ở nồng độ 5μg/ml, pha loãng virus 1:103, HA = 320 2: Trypsin ở nồng độ 2μg/ml, pha loãng virus 1:104, HA = 160 3.2.2. Xác định MOI của virus sử dụng trong gây nhiễm Chủng virus gốc chúng tôi nhận được có 106 liều gây nhiễm 50% trứng (EID50) được nhân lên lần thứ nhất trong chai nuôi cấy tế bào MDCK thu được một lượng nhỏ virus (P1), lượng virus này tiếp tục được sử dụng để lây nhiễm lần thứ hai trên tế bào MDCK để tạo một lượng lớn virus sử dụng cho phản ứng MN (P2). Virus gốc được pha loãng với các tỉ lệ khác nhau (10-2; 10-3; 10-4) được sử dụng để gây nhiễm trên tế bào MDCK trong các chai nuôi cấy với sự có mặt của trypsin- TPCK 5μg/ml. Hiệu giá HA ở độ pha loãng virus 10-2 là 160-320; ở độ pha loãng 2 1 (+) (-) LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 50 virus 10-3 là 320 (hình 3.2) và ở độ pha loãng virus 10-4 là 160 (Hình 3.2). Cả hai độ pha loãng virus 10-2, 10-3 đều có hiệu giá HA đạt 320, độ pha loãng virus 10-3 cũng giúp tiết kiệm lượng virus sử dụng hơn so với độ pha loãng virus bằng 10-2. Chúng tôi lựa chọn độ pha loãng virus bằng 10-3 cho các lần thí nghiệm sau. Từ kết quả này, chúng tôi tính được MOI của virus P2 sử dụng cho phản ứng MN là từ 2x10-3 tới 4x10-3. 3.2.3. Xác định TCID50 của virus P2 dùng cho phản ứng MN Việc xác định TCID50 giúp tính toán được lượng virus phù hợp đưa vào mỗi giếng thí nghiệm trong phản ứng MN. TCID50 là độ pha loãng virus để có thể nhiễm và làm huỷ hoại 50% tế bào nuôi cấy, TCID50 được xác định dựa trên sự có mặt và lây nhiễm của virus trên tế bào. Virus thu được sau khi gây nhiễm lần hai (P2) được pha loãng theo ½log10 với độ pha loãng 10-2, 10-2,5, 10-3 …10-6,5, các bước tiến hành đã được mô tả trong chương II, TCID50 được tính theo phương pháp Reed-Muench[37]. Chúng tôi đã xác định được TCID50 của chủng virus sử dụng cho phản ứng MN là 10-5,75. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 51 Hình 3.4: TCID50 được xác định trên tấm 96 giếng 3.3. Chuẩn bị tế bào MDCK, thời gian và điều kiện gây nhiễm Các điều kiện khác đã được thực hiện trên kĩ thuật chuẩn độ virus từ trước, sau đó điều kiện tốt nhất sẽ được áp dụng cho phản ứng MN. 3.3.1. Xác định mật độ tế bào MDCK thích hợp Tế bào MDCK có vai trò quan trọng đối với sự thành công của phản ứng MN. Dòng tế bào thí nghiệm phải phát triển ổn định qua một số lần cấy chuyển, các tế bào được quan sát dưới kính hiển virus có hình thái đồng đều, đặc biệt, chúng phải có phản ứng giống nhau đối với virus. Lượng tế bào cho vào mỗi giếng thí nghiệm cũng là một trong những yếu tố quyết định của phản ứng MN, lượng tế bào này cần được xác định chính xác và để sau một khoảng thời gian xác định, tế bào sẽ 10-2 10-2,5 10-3,5 10-4 10-4,5 10-5 10-5,5 10-6 10-6,5 10-3 Đối chứng LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 52 bao phủ đều trên toàn bộ bề mặt đáy giếng. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với tế bào MDCK ở các mật độ khác nhau: 1,5 x 105 tế bào/ml; 2,0 x 105 tế bào/ml; 2,5 x 105 tế bào/ml. Kết quả thu được, như được thể hiện trên hình 3.5 tế bào MDCK ở mật độ 2,0.105 tế bào/ml cho kết quả tốt nhất, tế bào bao phủ 100% bề mặt đáy giếng thí nghiệm, lớp tế bào phát triển, phân bố đồng đều (hình B) và TCID50 thu được là 10-5,75. Trong khi đó, tế bào ở các giếng có mật độ 1,5.105 tế bào/ml không phủ kín bề mặt giếng, có nhiều vị trí tế bào phân bố thưa (hình A), TCID50 là 10-5,25. Ngược lại, các giếng có mật độ tế bào 2,5.105 tế bào/ml có quá nhiều và TCID50 là 10-5,22. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 53 Hình 3.5: Tế bào ở các mật độ khác nhau trong TCID50 Như vậy, mật độ tế bào 2,0.105 tế bào/ml thích hợp nhất và mật độ này được chúng tôi sử dụng ở phần còn lại của nghiên cứu. A: Mật độ 1,5x105 tế bào/ml C: Mật độ 2,0x105 tế bào/ml B: Mật độ 2,5x105 tế bào/ml LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 54 3.3.2. Xác định thời gian gây nhiễm virus vào tế bào Thời gian gây nhiễm virus trên tế bào cần được xác định phù hợp để lượng virus xâm nhiễm vào tế bào là lớn nhất, virus cần được bất hoạt và cố định tại thời điểm thích hợp, tại đó lớp tế bào vẫn bám chặt trên bề mặt đáy giếng nuôi cấy và hiệu giá thu được ổn định qua các lần lặp lại. Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với các khoảng thời gian khác nhau: 18 tiếng; 20 tiếng và 22 tiếng. Kết quả thu được, thời gian gây nhiễm 22 tiếng cho kết quả tốt nhất với hiệu giá đạt được cao và ổn định hơn so với các khoảng thời gian gây nhiễm 18 và 20 tiếng. Ngoài ra, chúng tôi cũng đã xác định được thời gian gây nhiễm thích hợp nhất trong điều kiện có mặt của trypsin-TPCK ở các nồng độ khác nhau: 0,5 µg/ml; 1,0 µg/ml; 2,5 µg/ml. Chúng tôi nhận thấy sự gây nhiễm đạt kết quả tốt nhất trong điều kiện có mặt của trypsin-TPCK nồng độ 0,5 µg/ml và thời gian gây nhiễm là 18 tiếng. Trong khi đó, nồng độ trypsin-TPCK được khuyến cáo bởi protocol của CDC là 2 µg/ml. Khi nồng độ trypsin tăng lên (1,0 µg/ml; 2,5 µg/ml) hoặc thời gian gây nhiễm lớn hơn 18 tiếng (20 tiếng; 22 tiếng) tế bào trên bề mặt giếng thí nghiệm bị bong ra thành từng mảng lớn. Như vậy, ở điều kiện không có mặt của trypsin, thời gian gây nhiễm virus vào tế bào thích hợp nhất là 22 tiếng, trong khi đó, với sự có mặt của trypsin (0,5 µg/ml) thì thời gian gây nhiễm tốt nhất là 18 tiếng. Chúng tôi sẽ dùng hai điều kiện này cho phản ứng trung hoà virus lượng. 3.4. Đánh giá kết quả thu được của phản ứng MN 3.4.1. So sánh kết quả phản ứng MN ở điều kiện có và không có mặt của trypsin-TPCK Chúng tôi đã tiến hành phản ứng MN trong hai điều kiện, virus được gây nhiễm vào tế bào không có sự tham gia của trypsin-TPCK và được cố định lên bề mặt giếng thí nghiệm sau 22 tiếng gây nhiễm. Điều kiện thứ hai là quá trình gây nhiễm virus vào tế bào với sự có mặt của trypsin-TPCK (0,5 µg/ml), sau đó virus LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 55 được bất hoạt và cố định sau 18 tiếng gây nhiễm. Kết quả thu được được thể hiện trong bảng 3.4: Bảng 3.4: So sánh hiệu giá trong phản ứng MN có và không có mặt của trypsin Stt Mã huyết thanh Hiệu giá HI Hiệu giá MN không có trypsin Hiệu giá MN có trypsin 1. Mẫu 1 <10 14* 80 2. Mẫu 2 <10 10 80 3. Mẫu 3 10 10 40 4. Mẫu 4 20 20 160 5. Mẫu 5 20 160 320 6. Mẫu 6 20 20 80 7. Mẫu 7 20 <10 40 8. Mẫu 8 20 28* 40 9. Mẫu 9 28* <10 40 10. Mẫu 10 28* <10 80 11. Mẫu 11 28* <10 80 12. HT người (-) <10 <10 Không ổn định** 13. HT gà (+) 640 1280 1280 14. HT cừu (+) 640 2560 2560 Chú thích: (*): Trung bình nhân của hai lần thí nghiệm (**): Kết quả thu được không ổn định (80) ở các lần khác nhau LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 56 Kết quả trên cho thấy, khi sử dụng trypsin-TPCK trong gây nhiễm virus H5N1 vào tế bào, hiệu giá xác định được rất cao. Cụ thể là với mẫu số 2 được xác định là âm tính với hiệu giá trong phản ứng HI và MN không có mặt của trypsin lần lượt là 5 và 10 thì hiệu giá ở phản ứng MN có mặt của trypsin lên tới 80. Một ví dụ khác, mẫu số 4 có hiệu giá ở cả hai phản ứng HI và MN không có trypsin là 20 thì trong phản ứng MN có mặt của trypsin hiệu giá xác định được là 160 (bảng 3.1 và hình 3.4). Hơn nữa, với các mẫu huyết thanh đối chứng, hiệu giá xác định được của phản ứng MN có trypsin rất không ổn định trong các lần thí nghiệm. Như vậy, kết quả của phản ứng MN với sự tham gia của trypsin cho kết quả không chính xác, các kết quả tiếp theo sử dụng điều kiện phản ứng MN không có trypsin-TPCK. 3.4.2. Đánh giá độ ổn định của phản ứng MN Độ ổn định của phản ứng có ý nghĩa quan trọng, quyết định sự đồng đều của kết quả thu được qua các lần thực hiện khác nhau. Để đánh giá độ ổn định của phản ứng MN, chúng tôi tiến hành xác định độ lệch chuẩn log10 của kết quả phản ứng MN với cùng một mẫu qua các lần khác nhau, cụ thể là mẫu huyết thanh đối chứng dương của gà và huyết thanh đối chứng dương của cừu trên nền huyết thanh người. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.5: LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 57 Bảng 3.5: Kết quả phản ứng MN với mẫu huyết thanh đối chứng âm của người, huyết thanh đối chứng dương của gà và của cừu trên nền huyết thanh người. Stt Lần TN HT Gà (+) HT Cừu (+) HT Người (-) Hiệu giá Log(hiệu giá) Hiệu giá Log(hiệu giá) Hiệu giá 1 I 640 2.806 1280 3.107 < 10 2 II 640 2.806 640/1280 2.957 < 10 3 III 640/1280 2.957 1280/256 0 3.258 < 10 4 IV 1280 3.107 2560 3.408 < 10 5 V 1280 3.107 2560 3.408 < 10 6 VI 1280 3.107 2560 3.408 < 10 Trung bình nhân hiệu giá 952 1660 <10 Độ lệch chuẩn log(hiệu giá) trong phản ứng MN với các mẫu huyết thanh dương tính của gà và cừu tính được lần lượt là 0,147 và 0,190. Các giá trị độ lệch chuẩn trên xấp xỉ bằng 5% giá trị trung bình kết quả các lần thí nghiệm, phản ứng MN có độ ổn định cao. Kết quả trong bảng 3.2 và độ lệch chuẩn tính được cũng cho thấy huyết thanh dương tính của gà có trung bình nhân hiệu giá bằng 952, thấp hơn so với huyết thanh dương tính của cừu có trung bình nhân bằng 1660. Hơn nữa, tất cả các phản ứng với huyết thanh đối chứng âm của người đều cho kết quả âm tính, kết quả này một lần nữa khẳng định cho độ ổn định của phản ứng. Như vậy, phản ứng MN đã thiết lập được có độ ổn định nằm trong giới hạn cho phép. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 58 3.4.3. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng MN Tính đặc hiệu của phản ứng MN quyết định khả năng phân biệt KN của virus H5N1 với các KN khác. Trong 214 mẫu huyết thanh không có hiệu giá HI (HI<10) thì cả 214 mẫu đều có hiệu giá MN nhỏ hơn 20 (ngưỡng dương tính) (bảng 3.6) điều này chứng tỏ rằng KT đặc hiệu với các virus khác, cụ thể là virus cúm thông thường trong huyết thanh người không bắt cặp chéo với KN của virus H5N1 sử dụng trong phản ứng. Điều này chứng tỏ rằng phản ứng MN thiết lập được có độ đặc hiệu cao, có thể tin cậy để sử dụng trong nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1. 3.4.4. Đánh giá độ nhạy của phản ứng MN (so sánh với phản ứng HI) Kĩ thuật HI được coi là kĩ thuật “chuẩn vàng” trong phát hiện và định type virus cúm ở người, tuy nhiên kĩ thuật này được xác định là có độ nhạy không cao trong xác định KT kháng virus cúm gia cầm ở động vật[67, 68]. Khi chẩn đoán huyết thanh học nhiễm virus H5N1 ở cậu bé 3 tuổi, kết quả của phản ứng HI và MN đã được so sánh với nhau, trong đó KT kháng H5 đã được phát hiện bằng kĩ thuật MN ở những người có tiền sử tiếp xúc với gia cầm và với bệnh nhân nhiễm virus H5N1, trong khi kĩ thuật HI không phát hiện được các trường hợp nêu trên, kết quả này có thể gợi ý rằng kĩ thuật MN có độ nhạy cao hơn so với kĩ thuật HI trong phát hiện KT virus cúm trong huyết thanh người[69]. Tuy nhiên, Rowe (1999) cũng đã phát hiện thấy rằng một số virus H5N1 có hiệu giá HI nhưng không có hiệu giá MN[60]. Chúng tôi tiến hành so sánh kết quả phát hiện KT kháng H5 trong huyết thanh người bằng kĩ thuật MN và kĩ thuật HI, kết quả cụ thể được thể hiện trong bảng 3.6 dưới đây: LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 59 Bảng 3.6: So sánh kết quả phát hiện KT kháng H5N1 trong huyết thanh người bằng kĩ thuật MN và HI Hiệu giá HI Hiệu giá MN Số mẫu Âm tính (<20) Dương tính (≥20) <40 295 287 8 ≥40 16 8 8 Tổng số 311 295 16 Bảng 3.6 trên cho thấy trong tổng số 311 mẫu huyết thanh được sử dụng, cả kĩ thuật HI và kĩ thuật MN đều xác định được 16 mẫu dương tính (có hiệu giá lớn hơn hoặc bằng 40 đối với HI và lớn hơn hoặc bằng 20 đối với MN) chiếm 5,14% và 295 mẫu âm tính (có hiệu giá nhỏ hơn 40 đối với HI và lớn hơn 20 đối với MN) chiếm 94,86%. Bên cạnh đó, kết quả của kĩ thuật HI và kĩ thuật MN cũng rất tương đồng với nhau, cụ thể là với giá trị giới hạn dương tính của phản ứng MN là 20 thì có tới 303 mẫu huyết thanh chiếm 97,42% được xác định cho kết quả tương đồng với kết quả của kĩ thuật HI (giới hạn dương tính là 40). Tuy nhiên, kết quả thu được từ hai kĩ thuật trên vẫn có những khác biệt. Cụ thể là, trong 295 mẫu được xác định là âm tính bằng kĩ thuật HI có 8 mẫu cho kết quả dương tính khi kiểm tra bằng kĩ thuật MN chiếm 2,57%, trong đó có mẫu số 16 với hiệu giá HI là 20 (âm tính) lại có hiệu giá MN là 160 (dương tính). Ngược lại, kĩ thuật HI xác định được 8 mẫu dương tính (chiếm 2,57%) nhưng lại âm tính với kĩ thuật MN. Kết quả trên cho thấy phản ứng MN sử dụng virus vaccine được thiết lập có độ nhạy không cao hơn so với phản ứng HI trong điều tra huyết thanh học ở người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1. Điều này có thể được giải thích là do chủng virus sử dụng trong phản ứng là chủng virus vaccine từ năm 2004, chủng virus này được tạo ra nhờ việc tổ hợp lại các gen HA và NA của virus cúm gia cầm H5N1 đã LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 60 được cắt bỏ phần liên kết (đoạn AA base) giữa gen HA và NA với 6 gen còn lại của chủng virus A/Puerto Rico 8/34 (H1N1) trong tế bào động vật để thu nhận virus vaccine. Trước khi tiến hành, vị trí phân cắt protein của HA sẽ được loại bỏ giúp làm giảm độc lực của virus. Tuy nhiên, việc loại bỏ này có thể cũng làm mất đi những đoạn gen mã hóa cho một số quyết định KN của virus (epitop), do vậy KT đặc hiệu có trong huyết thanh không thể phát hiện và gắn đặc hiệu được với virus H5N1 chủng vaccine. Một lý do khác nữa là các mẫu huyết thanh sử dụng trong phản ứng được thu nhận từ những người tiếp xúc với virus cúm H5N1 từ năm 2004 tới năm 2007, do đó lượng KT kháng virus H5N1 năm 2004 trong huyết thanh đã giảm xuống, trong khi đó KT kháng virus H5N1 gây bùng phát dịch trong năm 2007 có thể không được phát hiện. Bên cạnh đó, những người chăn nuôi gia cầm có thể chỉ tiếp xúc với các chủng virus có khả năng nhân lên hạn chế do vậy hiệu giá KT kháng virus thấp. Cần có thêm những nghiên cứu virus học trên gia cầm của những gia đình này để khẳng định. Ngoài ra, một số mẫu huyết thanh được sử dụng là của những người có độ tuổi lớn hơn 60, do vậy, kết quả cả hai hiệu giá KT thu được từ cả hai kĩ thuật MN và HI có thể không chính xác[60]. Nếu loại bỏ 34 mẫu huyết thanh của những người trên 60 tuổi thì tỉ lệ tương đồng của hai phản ứng HI và MN đạt 98%. 3.5. Ứng dụng kĩ thuật MN trong điều tra huyết thanh học Kĩ thuật MN đã thiết lập được sử dụng trong điều tra huyết thanh học ở những người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1, cụ thể là ở người tiếp xúc với bệnh nhân và người chăn nuôi gia cầm, kết quả thu được thể hiện trên bảng 3.7: LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 61 Bảng 3.7A: Các mẫu huyết thanh dương tính trong phản ứng MN Stt Mã huyết thanh Tuổi Giới tính Nghề nghiệp Tiếp xúc Địa phương Hiệu giá MN* Hiệu giá HI** 1. Mẫu 1 55 Nữ Bác sĩ Bệnh nhân Thái Bình 28 20 2. Mẫu 2 46 Nữ Bác sĩ Bệnh nhân Thái Bình 28 40 3. Mẫu 3 17 Nữ Người nhà bệnh nhân Bệnh nhân Thái Bình 56 113 4. Mẫu 4 48 Nữ Nuôi gia cầm Gia cầm Hải Dương 20 20 5. Mẫu 5 41 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hà Tây 20 20 6. Mẫu 6 38 Nữ Nuôi gia cầm Gia cầm Hải Dương 20 20 7. Mẫu 7 40 Nữ Nuôi gia cầm Gia cầm Thái Bình 20 28 8. Mẫu 8 41 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hà Tây 20 40 9. Mẫu 9 56 Nữ Nuôi gia cầm Gia cầm Hải Dương 20 40 10. Mẫu 10 37 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hà Tây 20 40 11. Mẫu 11 32 Nữ Nuôi gia cầm Gia cầm Thái Bình 20 40 12. Mẫu 12 70 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hải Dương 28 10 13. Mẫu 13 70 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hà Tây 28 10 14. Mẫu 14 41 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hải Dương 56 40 15. Mẫu 15 66 Nam Tiêu hủy Gia cầm Hải Dương 160 20 16. Mẫu 16 76 Nam Tiêu hủy Không nuôi gia cầm Hải Dương 80 80 (*): Ngưỡng dương tính của KT MN = 20 (**): Ngưỡng dương tính của KT HI = 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 62 Tiến hành phản ứng MN với 311 mẫu huyết thanh đã phát hiện được 16 mẫu dương tính (Bảng 3.7A). Trong đó, 3 mẫu huyết thanh là của người tiếp xúc với bệnh nhân nhiễm virus H5N1. Đáng chú ý, mẫu số 3 của một người nhà bệnh nhân có hiệu giá cao ở cả hai kĩ thuật HI và MN lần lượt là 113 và 56, hai trường hợp còn lại là của nhân viên y tế tham gia chăm sóc bệnh nhân. Cả ba trường hợp này cần tiếp tục được kiểm tra để khẳng định đó là do sự lây truyền từ người sang người hay từ một nguồn khác. Phần lớn các mẫu huyết thanh dương tính xác định được là của người tiếp xúc với gia cầm (13 mẫu), tập trung chủ yếu ở nhóm những người chăn nuôi gia cầm (bao gồm gà, vịt, ngan, ngỗng và chim cút), tuy nhiên hiệu giá MN của nhóm những người này không cao với 8/13 mẫu có hiệu giá MN bằng 20 (vừa đạt ngưỡng dương tính). Điều này có thể được giải thích là do những người chăn nuôi gia cầm đã tiếp xúc với chủng virus có khả năng nhân lên thấp ví dụ như LPAI, cần có thêm những nghiên cứu về virus để khẳng định. Mẫu số 16 có hiệu giá HI và MN đều bằng 80 là của người tham gia tiêu hủy gia cầm, tuy nhiên người đàn ông này có tuổi 76. Kết quả thu được của phản ứng MN ở người này có thể không chính xác do phản ứng đạt được độ nhạy và đặc hiệu cao nhất với những mẫu huyết thanh của người trong độ tuổi từ 18 đến 59. Điều này đã được ghi nhận trong nghiên cứu của Rowe và các cộng sự năm 1999[60]. Bảng 3.7B dưới đây cũng khẳng định cho nhận định trên: LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 63 Bảng 3.7B: Thông tin về người có mẫu huyết thanh MN âm tính nhưng dương tính với HI Stt Mã huyết thanh Tuổi Giới tính Nghề nghiệp Tiếp xúc Địa phương Hiệu giá MN Hiệu giá HI 17. Mẫu 17 63 Nuôi gia cầm Bệnh nhân Hải Dương 5 40 18. Mẫu 18 53 Nam Nuôi gia cầm Bệnh nhân Thái Bình 5 40 19. Mẫu 19 64 Nữ Nuôi gia cầm Bệnh nhân Hải Dương 5 40 20. Mẫu 20 70 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hải Dương 5 57 21. Mẫu 21 49 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hà Tây 5 57 22. Mẫu 22 55 Nam Tiêu hủy Gia cầm Hải Dương 5 160 23. Mẫu 23 85 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hải Dương 5 80 24. Mẫu 24 28 Nam Nuôi gia cầm Gia cầm Hà Tây 5 80 Trong 8 mẫu huyết thanh dương tính với HI có 4 mẫu là của người trên 60 tuổi, do vậy, kết quả MN và HI của các mẫu này có thể không chính xác và cần được xác định bằng các kĩ thuật khác để khẳng định. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 64 KẾT LUẬN A. Hoàn thiện kĩ thuật MN 1. Xác định được nồng độ trypsin-TPCK thích hợp sử dụng trong gây nhiễm virus vaccine H5N1 vào tế bào MDCK là 5μg/ml. 2. Xác định được MOI trong gây nhiễm virus vaccine H5N1 vào tế bào là từ 2x10-3 tới 4x10-3. 3. Sản xuất được virus H5N1 vaccine với TCID50 là 106,75/ml để sử dụng cho phản ứng MN, virus có MOI nằm trong khoảng từ 2,23x10-3 tới 4,57x10-3. 4. Xác định được mật độ tế bào thích hợp cho phản ứng MN là 2,0x105 tế bào/ml. 5. Xác định được thời gian gây nhiễm virus vào tế bào, cụ thể là ở điều kiện không có mặt của trypsin, thời gian gây nhiễm virus vào tế bào thích hợp nhất là 22 tiếng, trong khi đó, với sự có mặt của trypsin (0,5 µg/ml) thì thời gian gây nhiễm tốt nhất là 18 tiếng. 6. Thiết lập và hoàn thiện kĩ thuật MN với độ ổn định và độ đặc hiệu cao được sử dụng trong nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1. 7. Với giá trị ngưỡng dương tính của phản ứng MN là 20 thì có 98% số mẫu (đã loại bỏ những người trên 60 tuổi) được xác định cho kết quả tương đồng với kết quả của kĩ thuật HI (giới hạn dương tính là 40). B. Bước đầu ứng dụng kĩ thuật MN trong điều tra huyết thanh học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1 8. Có 16 mẫu dương tính trên tổng số 311 mẫu xét nghiệm, chiếm 5,14%. Trong đó có 3 trường hợp tiếp xúc với bệnh nhân, 14 người tiếp xúc với gia cầm. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 65 Phần lớn các trường hợp có hiệu giá KT trung hòa thấp (20-80), có thể do tiếp xúc với virus LPAI. Một số trường hợp mẫu huyết thanh của người trên 60 tuổi có thể đã làm cho kết quả MN và HI khác nhau. Nếu loại bỏ các trường hợp này thì tỉ lệ tương đồng giữa hai kĩ thuật này là tương đối cao (98%). LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 66 KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu, xác định các điều kiện thực hiện tốt nhất nhằm làm tăng độ nhạy, giúp hoàn thiện hơn nữa phản ứng MN. 2. Tiến hành phản ứng MN với các chủng virus cúm khác như H1N1, H3N2, chủng H5N1 có độc lực. 3. Thực hiện phản ứng trên một số lượng mẫu lớn hơn để khẳng định chắc chắn hơn nữa hiệu quả và độ tin cậy của phản ứng trung hoà vi lượng. 4. Xác định các dòng tế bào khác có khả năng thay thế cho tế bào MDCK sử dụng trong phản ứng MN. 5. Tiến hành phản ứng MN với toàn bộ số mẫu thu được và phân tích hiệu giá MN trên người tiếp xúc với gia cầm và người tiếp xúc với bệnh nhân, điều này có ý nghĩa quan trọng trong điều tra huyết thanh dịch tễ học. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Phạm Văn Ty (2004), Virut học, NXB Giáo dục, Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh 2. Ann H. R., et al. (2000), “Characterization of the 1918 "Spanish" influenza virus neuraminidase gene”, Microbiology, 97, p. 6785-6790. 3. Babakir-Mina M., et al. (2007), “Influenza virus A (H5N1): a pandemic risk?”, New Microbiol, 30(2), p. 65-78. 4. Barry J.M. (2004), “The great influenza: the epic story of the deadliest plague in history”, New York, 2004. 5. Beigel J.H., Farrar J., Han A.M., et al. (2005), “Avian Influenza A (H5N1) Infection in Humans”, The new England Journal of Medicine, 353(13), 1374-85. 6. Brankston G., et al. (2007), “Transmission of influenza A in human beings”, Lancet Infect Dis, 7, p. 257–65. 7. Bui B.B. (2005), “Measures to control Avian Influenza and Pandemic Preparedness in Vietnam”, Meeting on avian influenza & human pandemic influenza. Geneva. 8. Chan P.K. (1997), “Outbreak of avian influenza A(H5N1) virus infection in Hong Kong in 1997”, Clin Infect Dis, 34, p. 58–S64. 9. Chen H., et al. (2005), “Avian flu: H5N1 virus outbreak in migratory waterfowl”, Nature, 436, p. 191–192. 10. Chotpitayasunondh T., Ungchusak K., et al. (2005), “Human disease from influenza A (H5N1), Thailand, 2004”, Emerg Infect Dis, 11, p. 201-209. 11. Coiras M.T., et al. (2003), “Simultaneous detection of influenza A, B, and C viruses, respiratory syncytial virus, and adenoviruses in clinical samples by multiplex reverse transcription nested-PCR assay”, J Med Virol., 69(1), p. 132-44. 12. Deregt D., et al. (2000), “Antigenic and molecular characterization of a herpesvirus isolated from a North American elk”, Am J Vet Res, 61(12), p. 1614-8. 13. Dwyer D.E., et al. (2006), “Laboratory diagnosis of human seasonal and pandemic influenza virut infection”, MJA, 185, p. 48-53. 14. Frank A.L., et al. (1980), “Microneutralization test for influenza A and B and parainfluenza 1 and 2 viruses that uses continuous cell lines and fresh serum enhancement”, J Clin Microbiol, 12(3): p. 426-32. 15. Gibson U.E. and Heid C.A. (1996), “A novel method for real time quantitative RT-PCR”, Genome Res, 6(10), p. 995-1001. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 68 16. Govorkova E. A., Murti G. and Meignier B. (1996), “Afican Green Monkey Kidney (Vero) Cells Provide an alternative host cells system for Influenza A and B viruses”, Journal of Virology, 70(8), p. 5519-5524. 17. 18. 19. Hulse-Post D.J., et al. (2007), “Molecular changes in the polymerase Genes (PA and PB1) Associated with High Pathogenicity of H5N1 Influenza virut in Mallard Ducks”, Journal of Virology, 81(16): p. 8515-8524. 20. International Committee on Taxonomay of Viruses (2007), “Orthomyxoviridae”. 21. Katz J.M. and Lim W. (1999), “Antibody response in individuals infected with avian influenza A (H5N1) viruses and detection of anti-H5 antibody among household and social contacts”, J Infect Dis, 180, p. 1763-1770. 22. Kawaoka Y. (1988), “Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells” Proc. Nati. Acad. Sci, 85, p. 324-328. 23. Kuiken T. (2004), “Avian H5N1 influenza in cats”, Science. 306.(5694), p.241. 24. Lazarowitz G.S. (1975), “Enhancement of the infectivity of influenza A and B viruses by proteolytic cleavage of the hemagglutinin polypeptide”, Virology, 68(2) p. 440-454. 25. Menno D., de Jong and Tran T.H. (2006), “Review Avian influenza A (H5N1)”, Journal of Clinical Virology, 35(1), p. 02-13. 26. Mounts A.W. and Kwong H. (1997), “Case-control study of risk factors for avian influenza A (H5N1) disease, Hong Kong”, J Infect Dis, 180, p. 505-8. 27. Nguyen, T.L. (2005), “Lack of H5N1 avian influenza transmission to hospital employees, Hanoi, 2004”, Emerg Infect Dis, 11, p. 210-5. 28. Nicholson K.G. et al. (2003), “Influenza”, Lancet, 362, p. 1733-1745. 29. Noppenberger J.K., et al. (2007), “Avian influenza: A review”, Am J Health- Syst Pharm, 64, p. 149-165. 30. Olsen B., et al. (2006), “Global patterns of influenza a virus in wild birds” Science, 2006. 312(5772) p. 384-388. 31. Osterhaus J.C., Rimmelzwaan G. F., Claas E.C.J. (2002), “H5N1 influenza in Hong Kong: virut charaterization”, Vaccine, 20(2), p82-83. 32. Oxford J.S. (2000), “Infuenza A pandemics of the 20th century with special reference to 1918: virology, pathology and epidemiology”, Med. Virol, 10, p. 119±133. 33. Peiris J. S., Menno D. J., and Guan Y. (2007), “Avian Influenza Virus (H5N1): a Threat to Human Health”, Clinical Microbiology Reviews, 20(2), p. 243-267. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 69 34. Profeta M.L. and Palladino G. (1986), “Serological evidence of human infections with avian influenza viruses”, Arch. Virol., 90, p. 355-360. 35. Rajagopal S. and Treanor J. (2007), “Pandemic (avian) influenza”, Semin Respir Crit Care Med, 28(2) p. 159-70. 36. Robert A.L. and Krug R.M. (2001), “Orthomyxoviridae: the viruses and their replication”, Fields Virology, Philadelphia Press, pp 1487-1531. 37. Robert G.W., (2002), “WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance”, World Health Organization. 38. Robert G.W., et al. (2005), “The spread of the H5N1 bird flu epidemic in Asia in 2004”, Arch Virol, 19, p. 117-129. 39. Robert G.W., et al. (1992), “Microbiology Evolution and Ecology of Influenza A Viruses”, Microbiological Reviews, 56, p. 152-179. 40. Rodney M.R., et al. (2005), “Molecular Diagnosis of Medical Viruses”, Curr. Issues Mol. Biol., 9, p. 87-102. 41. Rowe T., et al. (1999), “Detection of Antibody to Avian Influenza A (H5N1) Virus in Human Serum by Using a Combination of Serologic Assays”, Journal of Clinical Microbiology, 37(4), p. 937-943. 42. Rowe T., et al. (1999), “Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays”, J Clin Microbiol, 37(4), p. 937-43. 43. Russell R.J., et al. (2006), “The structure of H5N1 avian influenza neuraminidase suggests new opportunities for drug design”, Nature, 443(7107), p. 45-9. 44. Sara E.M., (1997), “Use of electron microscopy to diagnose viral illnesses”, Ann Saudi Med, 17, p. 66-76. 45. Scholtissek C., (1998), “Influenza in pigs and their role as the intermediate host”, Blackwell Science. 46. Scholtissek C., et al. (1978), “On the origin of the human influenza virus subtypes H2N2 and H3N2”, Virology, 87, p. 13-20. 47. Shin-ichi T. (2005), “Mechanisms of Broad Cross-protection Provided by Influenza Virus Infection and their Application to Vaccinces”, Jpn. J. Infect. Dis., 58, p. 195-207. 48. Smith G.J., Nguyen T.D., et al. (2006), “Evolution and adaptation of H5N1 influenza virus in avian and human hosts in Indonesia and Vietnam”, Virology, 350(2), p. 258-68. 49. Songsermn T., Amonsin A., et al. (2006), “Avian influenza H5N1 in naturally infected domestic cat”, Emerg Infect Dis, 12(4), 681-3. 50. Stephenson I., et al. (2004), “Confronting the avian influenza threat: vaccine development for a potential pandemic”, Lancet Infect Dis, 4, p. 499-509. 51. Stockton J. et al. (1998), “Multiplex PCR for typing and subtyping influenza and respiratory syncytial viruses”, J Clin Microbiol., 36, p. 2990-5. LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguyễn Hòa Bình 70 52. Subbarao K., et al. (1998), “Characterization of an avian influenza (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness”, Science, 279, p. 393-396. 53. Suzuki Y., “Sialobiology of Influenza Molecular Mechanism of Host Range Variation of Influenza Viruses”, Biol. Pharm., 28(3), p. 399-408. 54. Taisuke H. and Kawaoka Y. (2007), “Strategies for developing vaccines against H5N1 influenza A viruses”, Trends in Molecular Medicine, 12(11), pp. 506-514. 55. Taubenberger J.K., Lourens R.M. et al. (2005), “Characterization of the 1918 influenza virus polymerase genes”, Nature, 437, p. 889-893. 56. Thanawongnuwech R., Rachod Tantilertcharoen and Yong P. (2005) “Probable Tiger-to-Tiger Transmission of Avian Influenza H5N1”, Emerging Infectious Diseases, 11(5), 699-701. 57. The NSW Public Health Bulletin (2006), Factsheet: pandemic influenza, 17(9- 10): p. 152-3. 58. Tran T. H., et al. (2004), “Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam”, N Engl J Med, 350, p. 1179-1188. 59. Ungchusak K., Dowell S.F., et al. (2005), “Probable person-to-person transmission of avian influenza A (H5N1)”, The new England Journal of Medicine, 352, p. 333-340. 60. Vorndam V. and Beltran M. (2002), “Enzyme-linked immunosorbent assay- format microneutralization test for dengue viruses”, Am J Trop Med Hyg, 66(2), p. 208-12. 61. Webby R.J. (2001), “Emergence of influenza A viruses” Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 356, p. 1817-1828. 62. White D.O. and Frank L. F. (1994), Medical Virology, Academic Press. 63. WHO (2005), “WHO inter-country-consultation: influenza A/H5N1 in humans in Asia”, Manila, Philippines. 64. WHO (2006), “H5N1 avian influenza in domestic cats”. 65. WHO (2007), “Availability of H5N1 prototype strains for influenza pandemic vaccine development”. 66. WHO (2007), “H5N1 avian influenza: Timeline of major events 30 November 2007”. 67. World Organisation for Animal Health (2000), “Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines 2000” 68. Yu, H.J., et al. (2006), “The first confirmed human case of avian influenza A (H5N1) in mainland, China”, Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi, 27(4), p. 281-7.