Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của cây phèn đen Phyllanthus reticulatus Poir., - Họ thầu dầu (Euphorbiaceae)

ống oxi hóa từ dịch chiết methanol của 5 loài Phyllanthus là: Phyllanthus debilis, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus virgatus, Phyllanthus maderaspatensis, Phyllanthus amarus. Kết quả cho thấy các dịch chiết này đều thể hiện tính kháng oxi hóa [24]. 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC Chi Phyllanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có trên 700 loài gồm từ những cây thân thảo đến cây bụi hay cây gỗ nhỏ. Ở Việt Nam có 44 loài, các loài đáng được chú ý nhiều hơn cả là Phyllanthus urinaria L. (cây Chó đẻ răng cưa), Phyllanthus reticulatus Poir. (cây Phèn đen) và Phyllanthus amarus Schum et Thonn. (cây Diệp hạ châu đắng). Thành phần hoá học của chi này rất phong phú và đa dạng [10]. Năm 1976, Wai-Haan Hui và cộng sự [46] đã cô lập được 21-α-hydroxyfriedel- 4(23)-en-3-one (61), β-sitosterol (43), friedelin-1β,22β-diol (58) và glochidonol (60) khi nghiên cứu trên loài Phyllanthus reticulatus Poir. Năm 1981, Joshi và cộng sự [19] đã phân lập được các hợp chất kém phân cực như friedelin (57), betulin (55) và β-sitosterol (43) từ rễ và thân cây Phyllanthus reticulatus Poir. 7 Năm 2009, Phan Văn Dân [7] khảo sát thành phần hóa học cây Phyllanthus reticulatus Poir. Kết quả cho thấy rằng cây Phyllanthus reticulatus Poir. có chứa các hợp chất β-sitosterol (43), β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (44), 2-acetamido-3- phenylpropyl 2-benzamido-3-phenylpropanoate (76). Năm 2012, J. Xiong Ma và cộng sự [21] đã phân lập được hai arylnaphthalene lignan glycoside từ dịch chiết methanol của cây Phyllanthus reticulatus Poir., đó là reticulatusides A (40) và reticulatusides B (41). Ngoài ra, tác giả còn đề cập tới sự hiện diện của syringaresinol (42) trong cây này. Do chưa có nhiều công trình nghiên cứu trên cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) nên chúng tôi chỉ trình bày thành phần hoá học của một số cây khác cùng chi. 1.3.1. Phyllanthus acidus Năm 1966, Sengupta và cộng sự [37] phân lập được hai pentacyclic triterpenoid, đó là: phyllanthol (74) và olean-12-en-3β-ol (β-amyrin) (51). 1.3.2. Phyllanthus acuminatus Năm 1984 - 1985, Pettit và cộng sự [31,32] đã tách được phyllanthostatin 1 (32), phyllanthostatin 2 (33), phyllanthostatin 3 (34), phyllanthostatin 4 (35) và phyllanthostatin 5 (36). Năm 1990, Pettit và cộng sự [30] cũng đã cô lập được phyllanthostatin 6 (37) . 1.3.3. Phyllanthus amarus L. Năm 1995, Yeap Foo [25] phân lập được acid amariinic (45). Năm 1996, Peter J. Houghton và cộng sự [29] đã tách được 2 alkaloid mới là isobubbialine (4) và epibubbialine (2) cùng với 3 alkaloid đã biết là phyllanthine (11), securinine (13) và nor-securinine (9). Cấu trúc của chúng được xác định dựa vào phân tích các dữ liệu phổ UV, IR, phổ MS và NMR. Năm 2005 và 2007, Herbert Kolodziej và Farah Naaz [15,17] cô lập được acid shikimic (88) và epigallocatechin gallate (16). Năm 2008, Thales R.Cipriani và cộng sự [43] phân lập được acid thiobarbituric (14) và acid ascorbic (77). 8 1.3.4. Phyllanthus discoides Năm 1973, Manske và cộng sự [26] đã tách được phyllanthin (38) và 2 alkaloid là phyllanthine (11) và phyllantidine (12). Năm 1983, Aripova và cộng sự [38] đã cô lập được phyllalbine (10). Năm 1988, Calixto và cộng sự [10] phân lập được 14,15-dihydroallosecurinine- 15β-ol (1) tinh thể màu vàng da cam. 1.3.5. Phyllanthus emblicaL. Năm 1992, Kumar Roy và cộng sự [23] đã cô lập được acid ascorbic (77). Năm 1995, Mekkawy [13] phân lập được putranjivain A (50). Năm 1996, Ghosal [16] đã tách được phyllanemblinin A (48) là chất bột màu trắng, emblicanin-A (46) và emblicanin-B (47). Năm 1988, Calixto và cộng sự [10] đã cô lập được acid 2-O-galloylgalactaric (80) và acid galloylmalic (81). Năm 2000, Zhang và cộng sự [53] đã tách được prodelphinidin A1 (49). Năm 2002, Zang và cộng sự [54] đã phân lập được 1-([2-O-β-D-glucopyranoside]- 4,6-dihydroxyphenyl)-2-metylpropan-1-one (82) ở dạng tinh thể và 1-({2-O-[D- apiofuranosyl)-(16)-D-glucopyranoside]}-4,6-dihydroxyphenyl)-2-metylpropan-1-one (83) là chất vô định hình màu vàng. Năm 2006, Ying-Jun Zhang [51] đã tách được acid phyllaemblic (87). Năm 2008, Xiaoli Liu và cộng sự [49] đã phân lập từ dịch chiết methanol được quercetin (22) và catechin (15), đây là hai chất có hoạt tính chống oxi hóa cao. 1.3.6. Phyllanthus flexuosus Năm 1993, Tanaka và các cộng sự [42] đã phân lập được 5 triterpenoid có tên gọi như sau: olean-12-en-3β,15α-diol (70); lup-20(29)-en-3β,24-diol (66); olean-12-en-3β, 24-diol (71); oleana-11,13(18)-dien-3β,24-diol (73), olean-12-en-3β,15α,24-triol (72), betulin (55) và lup-20(29)-en-3β,15α-diol (67). 1.3.7. Phyllanthus fratermus Năm 1988, Shunyo Matsunaga và cộng sự [40] công bố đã tách được acid trichadenic B (75). 9 Năm 1997, Rajasubramaniam cùng các cộng sự [33] đã tách được acid indole-3- butyric (5) và acid 1-naphthaleneacetic (84). 1.3.8. Phyllanthus myrtifolius Năm 1999, Chen Lui và cộng sự [12] đã phân lập và nhận danh được 4-O- brevifolincarbonyl-1-O-galloyl-3,6-O-hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranos (78) . 1.3.9. Phyllanthus niruroides Năm 1996, Babady Bila và cộng sự [9] đã phân lập được một hợp chất mới thuộc nhóm alkaloid là niruroidine (2,7-diepimer) (8). 1.3.10. Phyllanthus niruri L. Năm 1986, Joshi và cộng sự [20] đã tách được nirurine (7) và 4-methoxy-nor- securinine (6). Năm 1991, Satyanarayana và Venkateswarlu [36] đã tách được 4 diarylbutane lignan: 2,3-desmethoxy seco-isolintetralin (24), 5-desmethoxyniranthin (25), linnanthin (39) và cuối cùng là demethylenedioxyniranthin (26). Năm 2007, tại vùng Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh từ phần dịch chiết ethyl acetate đã phân lập được hai chất là: 2,4,6-cyclohepta-trien-2,3,7-trihydroxy-5-ethoxy-1-one (79) và 5,7,8-trihydroxy-9,10-peroxy-4-ethoxybenzo[2,3-d]coumarin (89) [5]. Năm 2008, Shakil và Pankaj [39] đã tách được 2 flavanone: 8-(3- methyl-but-2- enyl)-2-phenylchroman-4-one (21) và 2-(4-hydroxyphenyl)-8-(3-methyl-but-2-enyl)- chroman-4-one (19) có khả năng làm thuốc chữa bệnh gút (gout) và bệnh thận. 1.3.11. Phyllanthus oxyphyllus Năm 2003, Sutthivaiyakit và cộng sự [41] đã tách được: acid 29-nor-3,4-seco- friedelantriterpen (68) và guaiane (85). Những hợp chất này được đánh giá là có khả năng chống oxi hóa tốt ở nồng độ IC50= 0.017 ± 0.001 mM. 1.3.12. Phyllanthus polyanthus Năm 2008, Vuyelwa J.N. và cộng sự [45] đã tìm ra được một số triterpenoid gồm: (20S)-3β-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol (54), lupenone (63) và (20S)-3α- acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol (53). 10 1.3.13. Phyllanthus sellowianus Năm 2002, Hnatyszyn [18] đã phân lập được rutin (23) và isoquercitrin (20). 1.3.14. Phyllanthus simplex Năm 1998, Rajkishor S. Negi và Thawra M. Fakhir [34] đã phân lập được (14- hydroxy-4-methoxy-13,14-dihydronorsecurinine) (3) và phyllanthin (38). Chất (3) đã và đang được sử dụng làm thuốc Tây y dạng viên nén (sản phẩm có tên là simplexin), phổ biến trên thị trường. 1.3.15. Phyllanthus tenellus Theo luận văn cao học của Phan Văn Dân [7], năm 1971, 1972, 1974, các tác giả lần lượt là Asakawa, Bick và Bilia đã phân lập được tenellus-1 (17) và tenellus-2 (18). 1.3.16. Phyllanthus urinaria Năm 2000, Zhang L.Z. và cộng sự [52] đã tách được một số triterpenoid như: lupeol acetate (64), β-amyrin (51), β-amyrylglucosid (52) và lupeol (62). Năm 2003, Chang và cộng sự [11] đã cô lập được 2,3-desmethoxy seco- isolintetralin diacetate (27), linnanthin (39), phyllanthin (38), hypophyllanthin (28), niranthin (29), nirtetralin (30) và phyltetralin (31). Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng cách thuỷ giải và dựa vào các dữ liệu phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Năm 2005, Wanxing Wei và cộng sự [47] đã phân lập được acid pentahydroxybenzoic (86). 1.3.17. Phyllanthus watsonii Năm 1992, Matsunaga và Tanaka [27] đã tách được hợp chất triterpen: 26-nor- D:A-friedooleanane (69) cùng với một số hợp chất khác là: lupenyl palmitate (65), friedelin (57), epi-friedelanol (56), glochidone (59), glochidonol (60), lupeol (62) và lup- 20(29)-en-3β,24-diol (66). Các công thức cấu tạo một số hợp chất trong chi Phyllanthus • Các alkaloid 11 N H O O H OH H N H O O H OH 14,15-Dihydroallosecurinine-15-ol (1) Epibubbialine (2) N O O H3CO OH N H O O OH H (14-Hydroxy-4-methoxy-13,14- Isobubbialine (4) dihydronorsecurinine) (3) N H COOH N O CH3 O O Acid indole-3-butyric (5) 4-Methoxy-nor-securinine (6) N O O H N O H O H H H OH H N O O Nirurine (7) Niruroidine (8) nor-Securinine(9) O OH H3CO O NCH3 N O O H3CO Phyllalbine (10) Phyllanthine (11) N O O O H H N O O N H NH O S O Phyllantidine (12) Securinine (13) Acid thiobarbituric (14) 12 • Các flavonoid OOH OH OH OH OH O OH OH O OH OH OH O OH OH OH Catechin (15) Epigallocatechin gallate (16) OH OH OH O O O O OH OH O O OOH OOH OH OH Flavonoide tenellus-1 (17) OH OH OH O O O O O OH O O OOH OOH OH OH O OH OH OH Flavonoide tenellus-2 (18) O O CH3CH3 OH 1 2 3 4 5 6 7 8 4a 8a 1'' 2'' 3'' 1' 2' 3' 4' 5' 6' OOH OH O O OH OH O OH OH OH OH Isoquercitrin (20) 2-(4-Hydroxyphenyl)-8-(3-metyl- but-2-enyl)-chroman-4-one (19) 13 O O CH3CH3 1 2 3 4 5 6 7 8 4a 8a 1'' 2'' 3'' 1' 2' 3' 4' 5' 6' OOH OH O OH OH OH Quercetin (22) OOH OH O O OH OH O OH OH OH O OCH3 OH OH OH Rutin(23) • Các lignan O O OCH3 OCH3 CH2OH CH2OH O O OCH3 OCH3 CH2OCH3 CH2OCH3 2,3-Desmethoxy seco-isolintetralin (24) 5-Desmethoxyniranthin (25) OCH3 OCH3 CH2OCH3 CH2OCH3OH OH OCH3 CH2OCOCH3 CH2OCOCH3 O O OCH3 OCH3 Demethylenedioxyniranthin (26) 2,3-desmethoxy seco-isolintetralin diacetate (27) 8-(3-Methyl-but-2-enyl)-2- phenylchroman-4-one (21) 14 H3CO CH2OCH3 CH2OCH3 OCH3 OCH3 O O H3CO CH2OCH3 CH2OCH3 OCH3 OCH3 O O Hypophyllanthin (28) Niranthin (29) CH2OCH3 CH2OCH3 OCH3 OCH3 H3CO O O CH2OCH3 CH2OCH3 OCH3 OCH3 H3CO H H H H3CO Nirtetralin (30) Phyltetralin (31) O O CH3 O O O O O O OH O CH3 CH3 O O OH O OH CH3 CH3 O O O CH3 O O O O O O O CH2OH O OH O OH CH3 CH3 O CH3 O OH Phyllanthostatin 1(32) Phyllanthostatin 2 (33) 15 O O CH3 O CH2OH OH O O O O O OH CH3 O OH O OH CH3 CH3 O CH3 O O O CH3 O O O O O O O OH CH3 O OH O CH3 CH3 O CH3 O OH Phyllanthostatin 3 (34) Phyllanthostatin 4 (35) O O CH3 O O O O O O OH O CH3 O OH O CH3 CH3 O OH CH3 O O O CH3 O O O O O O OH OH CH2OH O OH OH CH3 OH Phyllanthostatin 5 (36) Phyllanthostatin 6 (37) CH2OCH3 CH2OCH3 OCH3 OCH3 H3CO H3CO H H OCH3 OCH3 CH2OCH3 CH2OCH3H3CO H3CO OCH3 Phyllanthin (38) Linnanthin (39) 16 O O H3CO H3CO O O O O OH OH OH O O HOH2C OH OH Reticulatusides A (40) O O O H3CO O O O O OH CH2OH OH OH O OH OH OH Reticulatusides B (41) O O HH H3CO OH H3CO OCH3 OH OCH3 Syringaresinol (42) • Các steroid CH3 OH CH3 H CH3 CH3 CH3 H H CH3 H β-Sitosterol (43) 17 CH3 O CH3 H CH3 CH3 CH3 CH3 H H HO OH OH CH2OH OH β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (44) • Các tannin OH OH OH OH OH OH O O O O O O O O OH OH OH O O O OH OHO O CH3 O OH OH OH OH OH OH OH OH CO CO O O O O O O OH OH OH O OH OH OH O Acid amariinic (45) Emblicanin-A (46) OH OH OH OH OH OH CO CO O O O O O O O O OH OH OH OH OH OH O OH OH OH OH CO CO O O O HOH2C OH O OH OH OH O Emblicanin-B (47) Phyllanemblinin A (48) 18 OHOH OH CO CO OH OH OH O O O O O O OH OH OH CO CO CO O OH OH O OH H OH O O OH OH OH OH O OH OH OH OH O OH OH OH OH OH OH Prodelphinidin A1 (49) Putranjivain A (50) • Các triterpenoid OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H O CH3 CH2OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 O CH2OH OH OH OH β-Amyrin (51) β-Amyrylglucosid (52) CH3 H H CH3 H CH3 CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH2 CH3 CH3 OO CH3 CH3 H H CH3 H CH3 CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH2 CH3 CH3 OO CH3 (20S)-3α-Acetoxy-24- (20S)-3β-Acetoxy-24- methylenedammaran-20-ol (53) methylenedammaran-20-ol (54) 19 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH2OH H CH3 CH2 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H Betulin (55) Epi-friedelanol (56) O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3 CH3 CH3 H H CH3 OH O OH CH3 H CH3 CH3 CH3 Friedelin (57) Friedelin-1β,22β-diol (58) CH3 CH3 CH3 H CH3 CH3 CH2 CH3CH3 O H CH3 H CH3 O CH3CH3 OH CH3 H CH3 H CH3 CH2 Glochidone (59) Glochidonol (60) O CH2 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3 CH2 21-α-Hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one (61) Lupeol (62) 20 O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH2 CH3 H O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3 CH2 CH3 CH3 O Lupenone (63) Lupeol acetate (64) O CH3 H CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H O CH3 H H Lupenyl palmitate (65) OH CH3 CH2OH CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3 CH2 OH CH3 CH2OH CH3 CH3 CH3 H CH3 CH2 CH3 OH Lup-20(29)-en-3β,24-diol (66) Lup-20(29)-en-3β,15α-diol (67) HOOC CH3 CH2 CH3 CH3 CH3 HCH3 CH3 CH2 O CH3 CH3 COOH CH3 CH3 CH3 CH3 H H OH H H H Acid 29-nor-3,4-seco-friedelantriterpen (68) 26-Nor-D:A-friedooleanane (69) 21 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 H OH CH3 CH2OH CH3 CH3 CH3 H CH3 CH3 CH3 H Olean-12-en-3β,15α-diol (70) Olean-12-en-3β, 24-diol (71) OH CH3 CH2OH CH3 CH3 CH3 H CH3 CH3 CH3 H OH OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 OH Olean-12-en-3β,15α,24-triol (72) Oleana-11,13(18)-dien-3β,24-diol (73) OH H CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 HOOC HH H Phyllanthol (74) Acid trichadenic B (75) • Các chất khác O O NH CH3NH O O O O OHOH H OHH OH Acid ascorbic (77) 2-Acetamido-3-phenylpropyl 2- benzamido-3-phenylpropanoate (76) 22 O OH O OH OH OH O OH OH OH OH OH OH O O O O O OH OH OH O O O O 4-O-brevifolincarbonyl-1-O-galloyl-3,6-O-hexahydroxydiphenoyl- D-glucopyranos (78) OH O OH OH OC2H5 O O O OH OH OH OH OH OH OH OH O Acid 2-O-galloylgalactaric (80) OH OH O O O O OH OH OH CH3 O O CH3 OOH OH OH OH OH OH Acid galloylmalic (81) CH3 O O CH3 OOH OH OH OH OH O O OH OH OH O OH Acid 1-naphthaleneacetic (84) 1-({2-O-[(D-apiofuranosyl)-(1-6)-D- glucopyranoside]}-4,6-dihydroxyphenyl)- 2-metylpropan-1-one (83) 1-([2-O-β-D-glucopyranoside]-4,6- dihydroxyphenyl)-2-metylpropan-1-one (82) 2,4,6-cyclohepta-trien-2,3,7-trihydroxy-5- ethoxy-1-one (79) 23 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 O OH OH OH OH OH O OH O O O CH3 O OH OH O H O OH Guaiane (85) Acid pentahydroxybenzoic (86) Acid phyllaemblic (87) COOH OH OH OH OOH OH OH O O O OCH2CH3 Acid shikimic (88) 5,7,8 - trihydroxy-9,10-peoxy-4- ethoxybenzo[2,3-d] coumarin (89) 24 CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM 25 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Thu hái nguyên liệu Mẫu cây dùng trong khảo sát thành phần hóa học là lá, thân và rễ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) được thu hái tại huyện Tân Uyên, Bình Dương, vào tháng 7/2012. Mẫu cây đã được GS.TS Võ Văn Chi nhận danh tên khoa học là “Phyllanthus Reticulatus Poir.”, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). 2.1.2. Xử lý mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn, đem sấy đến khối lượng không đổi. Sau đó tiến hành ngâm chiết và phân lập các hợp chất. 2.2. HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.2.1. Hoá chất Silica gel: silica gel 60, 0,04-0,06 mm, Merck dùng cho cột sắc ký. Silica gel pha đảo, RP-18, Merck dùng cho sắc ký cột. Sắc ký bảng mỏng loại 25DC – Aflufolein 20×20, Kiesel gel 60F254, Merck; sắc ký bảng mỏng loại 25DC, RP-18, Merck. Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: ether dầu hoả, ethanol, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol và nước cất. Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: sử dụng H2SO4 30%. 2.2.2. Thiết bị Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu. Các cột sắc ký. Máy cô quay chân không hiệu Heidolph. Bếp cách thuỷ. Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm. Cân điện tử hiệu Sartorius max 620 g. 26 2.3. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 2.3.1. Phương pháp phân lập các hợp chất - Sử dụng kỹ thuật SKC silica gel pha thường, pha đảo Rp-18 kết hợp SKLM. - Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 30%. 2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2D-NMR đo trên máy Bruker Avance tại Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp.Hồ Chí Minh. - Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy Bruker micrOTOF Q-II. 2.4. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Lá, thân và rễ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) được phơi khô, chặt nhỏ và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi (m = 26.00 kg). Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm, sau đó đem lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô (534.00 g). Cao ethanol thô được chiết lỏng – lỏng với ether dầu hoả, ethyl acetate thu được cao ether dầu hoả (52.00 g), cao ethyl acetate (118.00 g). Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 1. 27 Sơ đồ 1. Qui trình điều chế cao ether dầu hoả và ethyl acetate (EA) 2.5. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE 2.5.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate Thực hiện SKC silica gel trên cao ethyl acetate (118,00 g) với hệ dung môi rửa giải ED:EA có độ phân cực tăng dần từ 20% - 100% ethyl acetate. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn. Kết quả thu được 4 phân đoạn (EA.1 - EA.4), được trình bày trong bảng 1. Bảng 1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate (EA) Cao ether dầu hoả ED (52,00 g) Cao ethyl acetate EA (118,00 g) - Chiết lỏng-lỏng với ether dầu hoả, ethyl acetate - Cô quay thu hồi dung môi Cao ethanol (534.00 g) Bã khô Dịch ethanol Cô quay thu hồi dung môi Bột lá, thân và rễ phèn đen m = 26.00 kg - Ngâm dầm trongethanol - Lọc Ethanol còn lại 28 Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (g) Sắc ký lớp mỏng Ghi chú EA.1 ED:EA = 4:1 86,00 Vệt dài Chưa khảo sát EA.2 ED:EA = 7:3 7,90 Nhiều vết, tách không rõ Chưa khảo sát EA.3 ED:EA = 1:1 2,53 Nhiều vết, tách rõ Khảo sát EA.4 EA = 100% 2,65 Nhiều vết Chưa khảo sát Ghi chú: ED (ether dầu hỏa), EA(ethyl acetate) 2.5.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3 của bảng 1 Sắc kí lớp mỏng trên phân đoạn EA.3 (2.53 g, bảng 1) cho nhiều vết, các vết tách rõ nên phân đoạn EA.3 được SKC silica gel với hệ dung môi rửa giải ED:C có độ phân cực lần lượt tăng dần từ 80 – 90% C. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn. Kết quả thu được 4 phân đoạn (EA.3.1 - EA.3.4), được trình bày trong bảng 2. Bảng 2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3 của bảng 1 Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg) Sắc ký lớp mỏng Ghi chú EA.3.1 ED:C = 1:4 20 mg Nhiều vết, kéo dài Chưa khảo sát EA.3.2 ED:C = 1:4 116 mg Vết tím rõ, lẫn dơ Khảo sát thu được V3 EA.3.3 ED:C = 1:4 119 mg Vết tím rõ, lẫn dơ Khảo sát thu được V1 EA.3.4 ED:C = 1:9 167 mg Nhiều vết, lẫn dơ Chưa khảo sát Ghi chú: C (chlorofom), ED (ether dầu hỏa) 2.5.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.2 của bảng 2 Thực hiện SKC silica gel trên phân đoạn EA.3.2 (116 mg) của bảng 2 với hệ dung môi rửa giải ED:C có độ phân cực tăng dần từ 60-90% C. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn. Kết quả thu được 3 phân đoạn (EA.3.2.1 - EA.3.2.3), được trình bày trong bảng 3. 29 Bảng 3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.4 của bảng 2 Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg) Sắc ký lớp mỏng Ghi chú EA.3.2.1 ED:C = 2:3 32 mg Nhiều vết dơ, mờ Chưa khảo sát EA.3.2.2 ED:C = 1:4 21 mg Vết tím, tách rõ Khảo sát, thu được V3 EA.3.2.3 ED:C = 1:9 29 mg Vết dơ, mờ Chưa khảo sát Ghi chú: C (chlorofom), ED (ether dầu hỏa) Nhận xét: Từ phân đoạn EA.3.2 của bảng 2, sắc kí cột thu được 3 phân đoạn sắp xếp theo thứ tự EA.3.2.1 - EA.3.2.3. Trong đó, phân đoạn B.3.2.2 có sắc kí lớp mỏng cho vết rõ đẹp màu tím ẩn dưới vết dơ mờ. Thực hiện sắc kí cột silica gel pha thường nhiều lần kết hợp với sắc ký điều chế trên phân đoạn này thu được chất ở dạng gum, không màu (8.0 mg). Kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng với nhiều hệ dung môi, hiện hình bằng H2SO4 30%, đun nóng chỉ thu được 1 vết rõ, màu tím, Rf = 0,4 (dung môi giải ly C100%). Hợp chất này được ký hiệu là V3. 2.5.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.3 của bảng 2 Thực hiện SKC silica gel trên phân đoạn EA.3.3 (119 mg) của bảng 2 với hệ dung môi rửa giải ED:C có độ phân cực lần lượt tăng dần từ 60 – 100% C. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn. Kết quả thu được 3 phân đoạn (EA.3.3.1 - EA.3.3.3), được trình bày trong bảng 4. Bảng 4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.3 của bảng 2 Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg) Sắc ký lớp mỏng Ghi chú EA.3.3.1 ED:C = 2:3 43 mg Nhiều vết dơ, mờ Chưa khảo sát EA.3.3.2 ED:C = 1:4 35 mg Vết tím, tách rõ Khảo sát, thu được V1 EA.3.3.3 C = 100% 16 mg Vết dơ, mờ Khảo sát 30 Ghi chú: C (chlorofom), ED (ether dầu hỏa) Nhận xét: Từ phân đoạn EA.3.3 của bảng 2, sắc kí cột thu được 3 phân đoạn sắp xếp theo thứ tự EA.3.3.1 - EA.3.3.3. Trong đó, phân đoạn EA.3.3.2 có sắc kí lớp mỏng cho vết rõ đẹp màu tím ẩn dưới vết dơ mờ. Thực hiện sắc kí cột silica gel pha thường nhiều lần trên phân đoạn này thu được hợp chất dạng bột, màu trắng (25.0 mg). Kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi khác nhau, hiện hình bằng H2SO4 30%, đun nóng chỉ thu được một vết rõ, màu tím, Rf = 0,35 (dung môi giải ly C100%). Kết tinh lại trong MeOH thu được hợp chất ký hiệu là V1. 31 Sơ đồ 2. Sơ đồ cô lập các chất hữu cơ trong cao ethyl acetate của cây Phèn đen - Sắc ký cột silica gel nhiều lần - Giải ly: ED:C V3 (8.0 mg) - Sắc ký cột silica gel nhiều lần - Giải ly: ED:C V1 (25.0 mg) Phân đoạn EA.3.2.1 32.00 mg Phân đoạn EA.3.2.2 21.00 mg Phân đoạn EA.3.2.3 29.00 mg Phân đoạn EA.3.3.3 16.00 mg Phân đoạn EA.3.3.2 35.00 mg Phân đoạn EA.3.3.1 43.00 mg - Sắc ký cột silica gel - Giải ly: ED:C - Cô quay thu hồi dung môi Phân đoạn EA.3.1 20.00 mg Phân đoạn EA.3.2 116.00 mg Phân đoạn EA.3.3 119.00 mg Phân đoạn EA.3.4 167.00 mg - Sắc ký cột silica gel - Giải ly: ED:C - Cô quay thu hồi dung môi Cao ethyl acetate EA (118,00 g) - Sắc ký cột silica gel - Giải ly: ED:EA - Cô quay thu hồi dung môi Phân đoạn EA.2 7,90 g Phân đoạn EA.1 86,00 g Phân đoạn EA.3 2,53 g Phân đoạn EA.4 2,65 g - Sắc ký cột silica gel - Giải ly: ED:C, C100% - Cô quay thu hồi dung môi 32 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT V3 Hợp chất V3 (8.0 mg) thu được từ phân đoạn EA.3.2.2 của sơ đồ 2 có những đặc điểm sau: - Chất ở dạng gum, không màu. - Sắc ký lớp mỏng cho một vết duy nhất với Rf = 0.4 trong hệ giải ly C100%, hiện hình bằng đèn UV; sau đó phun thuốc thử H2SO4 30%, đun nóng, cho vết màu tím. - Phổ 1H-NMR (CDCl3), (phụ lục 1 và bảng 5), δH 6.58 (2H, s, H-2, H-6); 4.73 (1H, d, J=3.5Hz, H-7); 4.28 (2H, dd, J=9.0/7.0 Hz, H-9); 3.09 (1H, m, H-8). - Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT (CDCl3), (phụ lục 2, 3 và bảng 5), δC 147.3 (=CCH-, C-2, C-6); 86.2 (>CH-, C-7); 71.9 (-CH2-, C-9); 54.5 (>CH-, C-8). Độ chuyển dịch hóa học của các carbon khác được trình bày cụ thể trong bảng 5. - Phổ COSY, HSQC, HMBC (CDCl3) (phụ lục 4, 5, 6)  BIỆN LUẬN CẤU TRÚC: Phổ 1H-NMR của V3 xuất hiện mũi đơn tại δH 6.58 (2H, s, H-2, H-6) của một vòng benzene mang 4 nhóm thế tại 1, 3, 4 và 5. Tín hiệu mũi đơn tại δH 5.49 (1H, s) không cho tương quan HSQC đến carbon nào, thể hiện đó là proton của 1 nhóm hydroxyl. Tín hiệu mũi đơn tại δH 3.90 (6H, s) thể hiện có sự hiện diện của 2 nhóm methoxy. Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn thể hiện các tín hiệu proton bão hòa, đặc trưng của khung diepoxytetrahydrofuran lignan tại δH 4.73 (1H, d, J = 3.5 Hz, H-7); 4.28 (1H, dd, J = 9.0/7.0 Hz, H-9a); 3.90 (1H, m, H-9b); 3.09 (1H, m, H-8). Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT chỉ thể hiện 8 tín hiệu carbon, gồm các carbon thơm ở vùng từ trường thấp, carbon methine mang oxygen tại δC 86.2 (C-7), carbon methylene mang oxygen tại δC 71.7 (C-9), carbon methine bão hòa tại δC 54.5 (C-8), 2 nhóm methoxy tại δC 56.5. Phổ COSY cho thấy sự tương quan giữa proton δH 3.09 (H-8) với proton δH 4.73 (H-7) và 4.28 (H-9). Phổ HSQC thể hiện sự tương quan giữa proton có δH 6.58 (H-2 và H-6) với carbon tại δC 102.9 (C-2 và C-6); proton cộng hưởng tại δH 4.73 (H-7) tương quan với carbon δC 86.2 (C-7); proton tại δH 4.28 và 3.90 (2H, H-9) tương quan với carbon δC71.9 (C-9); proton có δH 3.09 (H-8) tương quan với carbon δC 54.5 (C-8). 34 Như vậy, V3 được dự đoán là một lignan có cấu trúc đối xứng loại bicyclooctane. Phổ HMBC giúp kết nối các carbon hình thành cấu trúc phân tử. Tương quan HMBC từ tín hiệu δH 4.73 (H-7 và H-7') đến tín hiệu δC 102.9 (C-2,C-6 và C-2', C-6') cho biết vòng thơm gắn vào diepoxytetrahydrofuran tại vị trí 7 và 7'. Các nhóm methoxy gắn vào vòng thơm được xác định bởi tương quan HMBC từ tín hiệu δH 3.90 (6H, s) đến tín hiệu δC 147.3 (C-3, C-5). Theo tác giả Robert S. Ward [35], trong tự nhiên, hóa học lập thể của H-8 và H-8' trong cấu hình các epoxytetrahydrofuran lignan luôn có cấu hình cis. Theo tác giả Kotaro Takahashi [22], hóa học lập thể tại C-7 và C-7' có thể xác định dựa vào hằng số ghép giữa H-7/H-8 và H-7'/H-8'. Nếu J7,8 < 5.5 Hz thì H-7 và H-8 ở vị trí trans với nhau. Trong trường hợp của hợp chất V3, hằng số ghép J7,8 = 3.5 Hz nên H-7 và H-8 ở vị trí trans với nhau. Hóa học lập thể tại 2 vị trí C-7 và C-7' giống nhau do V3 có cấu trúc đối xứng, phổ nghiệm chỉ thể hiện một nửa phân tử. Việc phân tích các dữ liệu phổ nghiệm của V3 và so sánh với số liệu phổ nghiệm của syringaresinol [48] được trình bày trong bảng 5 cho thấy có sự tương đồng. Vì vậy, V3 được đề nghị là syringaresinol. 6 9 O O HH H3CO OH H3CO OCH3 OH OCH3 1 2 3 4 5 7 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' 6 9 O O H H OCH3 OH OCH3 H3CO OH H3CO 1 2 3 4 57 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' Hình 3. Tương quan HMBC của hợp chất V3 6 9 O O HH H3CO OH H3CO OCH3 OH OCH3 1 2 3 4 5 7 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' 6 9 O O H H OCH3 OH OCH3 H3CO OH H3CO 1 2 3 4 57 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' 35 (+)-Syringaresinol (-)-Syringaresinol 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT V1 Hợp chất V1 (25.0 mg) thu được từ phân đoạn EA.3.2.3 của sơ đồ 2 có những đặc điểm sau: - Chất bột, màu trắng. - Sắc ký lớp mỏng cho 1 vết duy nhất với Rf = 0.35 trong hệ giải ly C100%, hiện hình bằng đèn UV; sau đó phun thuốc thử H2SO4 30%, đun nóng, cho vết màu tím. - Phổ 1H-NMR (CDCl3), (phụ lục 7, 7a, 7b và bảng 6), δH 7.92 (1H, s, H-6); 7.03/7.01(1H, s, H-3); 6.91 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'); 6.77/6.73 (1H, br s, H-2'); 6.71 (1H, s, H-6'); 6.06/6.02 (2H, s, H-10'); 5.48 và 5.43 (2H, d, J = 15.0/15.0 Hz, H-9); 5.29 (1H, br, s, H-4"); 4.96 (1H, dd, J = 10.0/3.5 Hz, H-3"); 4.82 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1"); 4.25 (1H, m, H-2"); 4.03/3.58 (2H, m, dd, J = 12.0/1.5 Hz, H-5"). - Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT (CDCl3), (phụ lục 8, 8a, 8b, 9 và bảng 6), δC 170.7 (>C=O); 170.3 (>C=O); 170.0 (>C=O); δC 152.1 (=C<, C-5); 150.0 (=C<, C-4); 144.3 (=CCH-, C-3); 101.3 (C-6); δC 147.6 (=C<, C-3', C-4'); 136.7/136.8 (=C<, C-7'); 128.3 (=C<, C- 1'); 123.6/123.7 (=CH-, C-6'); 119.1/119.2 (=C<, C-8'); 110.7 (=CH-, C-2'); 108.2 (=CH-, C-5'); δC 105.4 (>CH-, C-1"); 69.9 (>CH-, C-2"); 68.1 (>CH-, C-4"); 73.2 (>CH-, C-3"); 64.7 (-CH2-, C-5"); 110.0 (-O-CH2-O-); 67.5 (-CH2-, C-9). Độ chuyển dịch hóa học của các carbon khác được trình bày trong bảng 6. - Phổ COSY, HSQC, HMBC (CDCl3) (phụ lục 10, 11, 11a, 11b, 12, 12a, 12b). - Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 13) cho mũi ion giả phân tử ở m/z = 619.1430 [M+Na]+.  BIỆN LUẬN CẤU TRÚC: Phổ 1H-NMR của hợp chất V1 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của 5 proton vòng thơm trong vùng δH 7.92 – 6.71. Trong đó, hai proton cộng hưởng dưới dạng mũi đơn tại δH 7.92 (1H, s, H-6); 7.03/7.01 (1H, s, H-3). Tín hiệu cộng hưởng của vòng benzene mang 3 nhóm thế ở vị trí 1, 3 và 4 [ δH 6.91 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'); 6.77 và 6.73 (1H, br s, H- 2'); 6.71 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6')]. Hai proton tại δH 6.06 (1H, s) và 6.02 (1H, s) cho tương quan với HSQC carbon δC 101.0. 36 Hai proton không tương đương của nhóm methylen mang oxygen cộng hưởng tại δH 5.48 (1H, m, H-9a) và 5.43 (1H, m, H-9b). Một proton anomer cộng hưởng tại δH 4.82 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1"). Các proton >CH-O- của phân tử đường cộng hưởng trong vùng δH 5.29 – 3.19. Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT (CDCl3) cho thấy V1 có 3 carbon >C=O cộng hưởng tại δC 170.7; 170.3; 170.0; 5 carbon vòng benzene mang oxygen xuất hiện ở δC 152.1 (C-5), 150.3 (C-4), 147.6 (C-3' và C-4') và 119.1/119.2 (C-8') và nhóm methylendioxy tại δC 101.0 (-O-CH2-O-). Tín hiệu cộng hưởng của phân tử đường 5 carbon gồm một carbon anomer ở δC 105.4 (C-1"); ba carbon mang oxygen của phân tử đường cộng hưởng tại δC 73.2 (C-3"); 68.1 (C-4"); 64.7 (C-5") và một carbon methylen mang oxygen tại δC 67.5 (C-9). Ngoài ra, phổ 13C và DEPT còn cho thấy có 2 nhóm methoxy tại δC 56.4 và 55.9; hai carbon methyl của nhóm acetoxy ở δC 21.0 (-CH3-, 4"-OAc) và 20.9 (-CH3-, 3"- OAc). Phổ HSQC thể hiện sự tương quan giữa proton δH 7.92 (1H, s, H-6) với carbon ở δC 101.3 (C-6); proton ở δH 7.03 (1H, s, H-3) tương quan với carbon δC 106.3 (C-3). Ba proton của vòng benzene còn lại ở δH 6.91 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'); 6.77 (1H, br s, H-2'); 6.71 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6') tương quan HSQC lần lượt với các carbon ở δC 108.2 (C-5'); 110.7 (C-2') và 123.6/123.7 (C-6'). Phổ 13C, DEPT và HSQC còn cho thấy một số tín hiệu cộng hưởng của carbon xuất hiện cặp đôi như δC 136.8/136.7 (C-7'); 123.6/123.7 (C-6'); 119.1/119.2 (C-8'). Phổ HMBC cho thấy sự tương quan từ hai proton ở δH 5.49; 5.42 (H-9) đến carbon tại δC 170.0 (>C=O, C-9') và δC 119.2 (=C<, C-8'). Proton ở δH 6.06 (1H, s); 6.02 (1H, s) tương quan đến carbon δC 147.6 (=C<, C-3' và C-4'). Từ các dữ liệu phổ trên cho phép dự đoán V1 là một lignan dạng arynaphthalen có gắn 1 phân tử đường 5 carbon. Sự tương quan từ proton đến carbon trong phổ HMBC giúp xác định thêm cấu trúc của V1. Proton ở δH 7.03 (1H, s, H-3) có tương quan HMBC đến δC 150.3 (C-4) và 127.1 (C-2). Tương tự, proton ở δH 7.92 (1H, s, H-6) có tương quan HMBC đến carbon δC 152.1 (C-5) và 136.8 (C-1). Hai nhóm methoxy ở δH 4.00 (3H, s); 3.77 (3H, s) tương 37 quan HMBC đến carbon δC 152.1 (C-5) và 150.3 (C-4). Như vậy, 2 nhóm methoxy gắn tại vị trí C-4 và C-5. Từ các dữ liệu phổ nghiệm trên, kết hợp so sánh với số liệu phổ của các dẫn xuất của diphyllin cho thấy có sự tương đồng nên chúng tôi đề nghị V1 là glycoside có phần aglycon là diphyllin. Proton anomer ở δH 4.82 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1") của phân tử đường tương quan HMBC tới carbon δC 144.3 (C-7) khẳng định phân tử đường gắn vào aglycon qua vị trí C-7. Phổ COSY cho thấy sự tương quan giữa proton ở δH 4.25 (1H, m, H-2") với proton anomer tại δH 4.82 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1"). Các tương quan khác trong phổ COSY giúp xác định vị trí các proton và carbon của phân tử đường. Phổ HMBC cho thấy tương quan từ proton tại δH 4.96 (1H, dd, J = 10.0/3.5 Hz, H- 3") đến carbon ở δC 170.3 (4"-OAc); proton tại δH 5.29 (1H, br, s, H-4") tương quan đến carbon δC 170.7 (3"-OAc), nên tại vị trí C-3" và C-4" của phân tử đường đã bị acetyl hóa. Proton anomer (H-1") và proton (H-3") có hằng số ghép lần lượt bằng 8.0 Hz và 10.0/3.5 Hz, kết hợp với proton (H-4") cho cộng hưởng dưới dạng mũi đơn rộng nên phân tử đường là α-L-arabinose. Phổ HR-ESI-MS cho phân tử ion giả ở m/z = 919.1430 [M+Na]+, phù hợp với công thức phân tử (C30H28O13 + Na) với M = 619.1428, sai số 0.0002. Qua việc phân tích các dữ liệu phổ nghiệm của hợp chất V1 và so sánh việc phân tích các dữ liệu phổ của 4-O-arabinopyranosydiphyllin [50] cho thấy có sự tương đồng, ngoại trừ hợp chất V1 có 2 nhóm –OAc gắn vào vị trí 3", 4" của phân tử đường arabinose, nên V1 được đề nghị là 4,5-dimethoxy-3',4'-methylenedioxy-7-O-(3",4"-di-O- acetyl arabinopyranosyl)-2,7'-cyclolign-7,7'-dien-9,9'-lactone. Đây là hợp chất mới trong tự nhiên đã được xác định bằng phần mềm Scifinder vào ngày 20/05/2013 tại Đại học Leuven, Bỉ. 38 O C O O O H3CO H3CO O O O O OH C O CH3 C O CH3 1 2 3 4 5 7 8 9' 1' 2' 3' 4' 5' 6' 8' 7' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 9 6 Hình 4. Tương quan HMBC của hợp chất V1 O C O O O H3CO H3CO O O O O OH C O CH3 C O CH3 1 2 3 4 5 7 8 9' 1' 2' 3' 4' 5' 6' 8' 7' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 96 4,5-dimethoxy-3',4'-methylenedioxy-7-O-(3",4"-di-O-acetyl arabinopyranosyl)-2,7'-cyclolign-7,7'-dien-9,9'-lactone 39 Bảng 5. Số liệu phổ NMR của V3 Vị trí Hợp chất V3 (CDCl3) Hợp chất so sánh [48] (CDCl3) Loại carbon δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) HMBC 1H13C δC (ppm) 1 =C< - 132.3 - 132.1 2 >CH- 6.58, s 102.9 C-7,C-3,C-4 102.7 3 =C< - 147.3 - 147.2 4 =C< - 134.5 - 134.3 5 =C< - 147.3 - 147.2 6 >CH- 6.58, s 102.9 C-7,C-3,C-4 102.7 7 >CH- 4.73, d(3.5) 86.2 C-8,C-9,C-2,C-6,C-8' 86.1 8 >CH- 3.09, m 54.5 C-1 54.3 9 -CH2- 4.28, dd, (9.0/7.0) 3.90, m 71.9 C-8,C-7 71.8 1' =C< - 132.3 - 132.1 2' >CH- 6.58, s 102.9 C-7',C-3',C-4' 102.7 3' =C< - 147.3 - 147.2 4' =C< - 134.5 - 134.3 5' =C< - 147.3 - 147.2 6' >CH- 6.58, s 102.9 C-7',C-3',C-4' 102.7 7' >CH- 4.73, d(3.5) 86.2 C-8',C-9',C-2',C-6',C-8 86.1 8' >CH- 3.09, m 54.5 C-1' 54.3 9' -CH2- 4.28, dd,(9.0/7.0) 3.90, m 71.9 C-8',C-7' 71.8 4-OH - 5.49, s - - - 4'-OH - 5.49, s - - - 3-OCH3 3.90, s 56.5 C-3 56.5 3'-OCH3 3.90, s 56.5 C-3' 56.5 5-OCH3 3.90, s 56.5 C-5 56.5 5'-OCH3 3.90, s 56.5 C-5' 56.5 40 Bảng 6. Số liệu phổ NMR của V1 Vị trí Hợp chất V1 (CDCl3) Hợp chất so sánh [50] (DMSO-d6) Loại cacbon δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) HMBC 1H13C δC (ppm) 1 =C< - 130.8 129.6 2 =C< - 127.1 126.6 3 =CH- 7.03, s /7.01, s 106.3 C-2,C-5,C-7 107.9 4 =C< - 150.3 149.9 5 =C< - 152.1 151.4 6 =CH- 7.92, s 101.3 C-1,C-7',C-4 101.8 7 =C< - 144.3 144.5 8 =C< - 131.2 128.9 9 -CH2- 5.49, d, (15.0) 5.42, d, (15.0) 67.5 C-7,C-8,C-8',C-9' 67.0 1' =C< - 128.3 128.2 2' =CH- 6.77/6.73, br s 110.7 C-3',C-4',C-7',C-6' 110.7 3' =C< - 147.6 146.8 4' =C< - 147.6 146.9 5' =CH- 6.91, d, (8.0) 108.2 C-1',C-3',C-4' 104.8 6' =CH- 6.71, d, (8.0) 123.6/123.7c C-2',C-4',C-7' 123.5 7' =C< - 136.7/136.8c 134.4 8' =C< - 119.1/119.2c 118.6 9' >C=O - 170.0 169.0 1" >CH- 4.82, d, (8.0) 105.4 C-7 105.4 2" >CH- 4.25, mb 69.9 C-1",C-3" 70.8 3" >CH- 4.96, dd, (10.0/3.5) 73.2 C-2",3"-OAc 72.2 4" >CH- 5.29, br s 68.1 4"-OAc 67.2 5" -CH2- 4.03, mb 3.58, dd, (12.0/1.5) 64.7 C-1",C-3",C-4" 65.7 -OCH2O- -CH2- 6.06, s 6.02, s 101.0 C-3',C-4' 101.0 4-OCH3 -CH3 3.77, s 55.9 C-4 5-OCH3 -CH3 4.00, s 56.4 C-5 3"-OAc -CH3 >C=O 2.21, s - 21.0a 170.3 4"-OAc -CH3 >C=O 2.11, s - 20.9a 170.7 a: Tín hiệu có thể trao đổi lẫn nhau b: Tín hiệu bị chồng chập c: Tín hiệu xuất hiện do phân tử xoay quay trục C-7 và C-7' 41 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 4.1 KẾT LUẬN Việc khảo sát thành phần hóa học của cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) thu hái tại Tân Uyên – Bình Dương đã thu được những kết quả như sau: Từ phân đoạn EA.3.2.2 (sơ đồ 2) cao ethyl acetate, sử dụng các phương pháp trích ly, chiết xuất, đã cô lập được hợp chất với kí hiệu V3. Sử dụng các phương pháp phân tích hóa lí hiện đại NMR, kết hợp so sánh với các tài liệu tham khảo đã đề nghị cấu trúc V3 như sau: 6 9 O O HH H3CO OH H3CO OCH3 OH OCH3 1 2 3 4 5 7 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' 6 9 O O H H OCH3 OH OCH3 H3CO OH H3CO 1 2 3 4 57 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' (+)-Syringaresinol (-)-Syringaresinol Từ phân đoạn EA.3.2.3 (sơ đồ 2) cao ethyl acetate, sử dụng các phương pháp trích ly, chiết xuất, đã cô lập được hợp chất với kí hiệu V1. Sử dụng các phương pháp phân tích hóa lí hiện đại NMR, kết hợp so sánh với các tài liệu tham khảo đã đề nghị cấu trúc V1 như sau: O C O O O H3CO H3CO O O O O OH C O CH3 C O CH3 1 2 3 4 5 7 8 9' 1' 2' 3' 4' 5' 6' 8' 7' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 96 4,5-dimethoxy-3',4'-methylenedioxy-7-O-(3",4"-di-O-acetyl arabinopyranosyl) -2,7'-cyclolign-7,7'-dien-9,9'-lactone 4.2 ĐỀ XUẤT Do hạn chế về thời gian nên còn rất nhiều phân đoạn chúng tôi chưa nghiên cứu. Trong khóa luận này, chúng tôi chỉ mới tiến hành phân lập với cao ether dầu hỏa và ethyl 43 acetate. Ngoài ra, còn phần cao methanol chúng tôi chưa khảo sát. Vì vậy, thời gian tới chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu những loại cao và phân đoạn còn lại, đồng thời tiến hành thử hoạt tính sinh học đối với các loại cao và các hợp chất đã cô lập được. 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO  TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Đỗ Tất Lợi (1997), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y học Hà Nội, 65-67. [2] Đỗ Tất Lợi (2000), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y học, 550-551. [3] Nguyễn Thượng Phong (2001), “Khảo sát công dụng làm thuốc của một số loài Phyllanthus ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 6, 72-75. [4] Nguyễn Văn Đậu, Lưu Hoàng Ngọc, Nguyễn Đình Chung (2003), “Nghiên cứu hoạt chất sinh học từ cây chó đẻ thân xanh (Phyllanthus niruri L. Euphorbiaceae)”, Tạp chí Dược học, 9 , 12-15. [5] Nguyễn Văn Đậu, Trần Thị Thu Hà (2007), “Nghiên cứu hóa thực vật cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L. Euphorbiaceae)”. Tạp chí dược học, 369, 15-18. [6] Lê Trần Đức (1997),“Cây thuốc Việt Nam”, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 724-725. [7] Phan Văn Dân (2009), “Nghiên cứu thành phần hoá học có trong cây Phèn đen (Phyllanthus Reticulatus Poir. Euphorbiaceae)”, Luận văn cao học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, 12-40. [8] Trần Đình Thắng, Bùi Quang Chính, Hoàng Văn Lựu, Nguyễn Xuân Dũng (2007), “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất phenolic từ cây chó đẻ răng cưa”, Tạp chí Dược học, 371, 14-17.  TÀI LIỆU TIẾNG ANH [9] Babady-Bila (1996), “Niruroidine, a norsecurinine type alkaloid from Phyllanthusniruroides”, Phytochemistry, 41(5), 1441-1443. [10] Calixto J. B., Santos A. R. (1998), “A review of the plants of the genus Phyllanthus”, Pharmacology, Medicinal Research Reviews, 18(4), 225-258. [11] Chang, C.-C., Lien, Y.-C, Liu, K.C.S.C., and Lee, S.-S.(2003), “Lignans from Phyllantus urinaria”, Phytochemistry, 63(7), 825-833. [12] Chen Lui (1999), “A new flavanone isolated from Rhizoma Smilacis Glabrae and the structural requirements of its derivatives for preventing immunological hepatocyte damage”, Planta Med., 65, 43-46. 45 [13] El-Mekkawy (1995), “Inhibitory effects of Egyptian folk medicines on human immunodeficiency virus (HIV) reverse transcriptase”. The Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 43, 641-648. [14] E. Omulokoli, B. Khan, S.C. Chhabra (1997), “Antiplasmodial activity of four Kenyan medicinal plants”, Journal of Ethnopharmacology, 56, 133-137. [15] Farah Naaz, Saleem Javed, M.Z. Abdin (2007), “Hepatoprotective effect of ethanolic extract of Phyllanthus amarus Schum. et Thonn”, Ethnopharmacology, 113(3), 503-509. [16] Ghosal (1996), “Active constituents of Emblica Officinalis: part 1. The chemistry and antioxidative effcts of two new hydrolysable tannins, emblicanin A and B”, Indian Journal of Chemistry, 35B(9), 941-948. [17] Herbert Kolodziej (2005), “Tannins and related compounds induce nitric oxide synthase and cytokines gene expressions in Leishmania major”, Bioorganic, 13(23), 6470-6476. [18] Hnatyszyn, (2002), “The hypoglycemic effect of Phyllanthus sellowianus fractions”, Phytomedicine, 9(6), 556-559. [19] Joshi KC, Singh P, Mehra A. (1981), “Crystalline components of the roots of Phyllanthus reticulatus”, J. Ind . Chem. Soc ,58, 102–103. [20] Joshi (1986), “Crystalline compounds of the roots of Phyllanthus niruri”. Journal of the Indian Chemical society, 58, 102-103. [21] Jian-Xiong Ma, Ming-Sheng Lan, Shi-Jin Qu, Jun-Jie Tan, Hong-Feng Luo, Chang- Heng Tan & Da-Yuan Zhu (2012),“Arylnaphthalene lignan glycosides and other constituents from Phyllanthus reticulatus”, Journal of Asian Natural Products Research, 14, 1073-1077. [22] Kotaro Takahashi, Toshie Nakagawa (1966), “Studies on constituents of medicinal plants, the stereochemistry of paulowin and isopaulowin”, Chem . Pharm . Bull. , 14(6), 641-647. [23] Kumar Roy, H. Dhir, A. Sharma (1992), “Modification of metal-induced micronuclei formation in mouse bone marrow erythrocytes", Toxicology Letters, 62(1), 9-17. [24] Kumaran, Karunakaran (2007), “In vitro antioxidant activities of methanol extracts of five Phyllanthus species from India”, Food Science, 40(2), 344-352. 46 [25] L. Yeap Foo (1995), “Amariinic acid and related ellagitannins from Phyllanthus amarus”, Phytochemistry, 39(1), 217-224. [26] Manske R. H. F (1925), “The alkaloids chemistry and physiology”, Phytochemistry, 15, 428. [27] Matsunaga, Tanaka (1992), “26-Nor-D:A-friedooleananetrit erpenes from Phyllanthus watsonii”, Phytochemistry, 32(1), 165-170. [28] Ming-Sheng Lana, Jian-Xiong Ma, Chang-Heng Tan, Song Wei, and Da-Yuan Zhu (2010),“Chemical Constituents of Phyllanthus reticulatus”, Helvetica Chimica Acta, 93, 2276. [29] Peter J. Houghton, Tibebe Z. Woldemariam (1996), “Two securinega-type alkaloids from Phyllanthus amarus”, Phytochemistry, 43(3), 715-717. [30] Pettit GR, Schaufelberger DE, Nieman RA, Dufresne C, Saenz-Renauld JA (1990), “Antineoplastic agents, 177. Isolation and structure of phyllanthostatin 6”, Journal of Organic Chemistry, 53(6), 1406-1413. [31] Pettit GR, Cragg GM, (1984), “Antineoplastic Agents 104. Isolation and Structure of the Phyllanthus acuminatus Euphorbiaceae Glycosides”, Journal of Organic Chemistry, 49, 4258-4266. [32] Pettit GR, Cragg GM, Suffness M (1985), “Phyllanthostatin 1 Phyllanthoside Orthoacid Rearrangement”, Journal of Organic Chemistry, 50, 5060-5063. [33] Rajasubramaniam, Pardha Saradhi (1997), “ Rapid multiplication of Phyllanthus fraternus: a plant with anti-hepatitis viral activity”, Industrial Crops and Products, 6(1), 35-40. [34] Rajkishor S. Negi, Thawra M. Fakhir (1998), “An alkaloid from Phyllanthus simplex”, Phytochemistry, 27(9), 3027-3028. [35] Robert S. Ward (1997), “Lignan, neolignan and related compounds”, Nat. Prod. Rep. , 14, 43-74. [36] Satyanarayana, Venkateswarlu (1991), “Isolation, structure and synthesis of new diarylbutane lignans from Phyllanthus niruri”, Tetrahedron, 47(42), 8931-8940. [37] Sengupta, Mukhopadhyay (1966), “Terpenoids and related compounds-VII: Triterpenoids of Phyllanthus acidusskeels”, Phytochemistry, 5(3), 531-534. [38] S. F. Aripova (1983), “Tropane alkaloids of two species of plants of the Phyllanthus discoides”, 16, 677. 47 [39] Shakil, Pankaj (2008), “Nematicidal prenylated flavanones from Phyllanthus niruri”, Phytochemistry, 63(3), 759-764. [40] Shunyo Matsunaga, Reiko Tanaka, (1988), “Revised structure of trichadenic acid B”, Tetrahedron Letters, 29(37), 4751-4754. [41] Sutthivaiyakit, Nakorn N. (2003), “A new guaiane sesquiterpene from the roots of Phyllanthus oxyphyllus”, Tetrahedron, 59(50), 9991-9995. [42] Tanaka, K. Masuda and S. Matsunaga (1993), “Lup-20(29)-en-3β,15α-diol and ocotillol-II”, Phytochemistry, 32(2), 472-474. [43] Thales R. Cipriani, Caroline G. Mellinger (2008), “Acidic heteroxylans from medicinal plants and their anti-ulcer activity”, Carbohydrate Polymers, 74(2), 274-278. [44] The Health Bureau of Guangxi Province (1974), “Compilation of Medicinal Herbs in Guangxi”, II, Guangxi People Press, Nanning, 1588. [45] Vuyelwa J. N., Neil R. C. (2008), “Triterpenoids from the African tree Phyllanthus polyanthus”, Phytochemistry Letters, 1(1), 11-17. [46] Wai-Haan Hui, Man-Moon Li, Kam-Moon Wong (1976), “A new compound, 21α- hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one and other triterpenoids from Phyllanthus reticulatus”, Phytochemistry, 5(15), 797-798. [47] Wanxing Wei, Yuanjiang Pan (2005), “Carboxylic acids from Phyllanthus urinaria”, Chemistry of Natural Compounds, 41(1), 17-20. [48] Wisit Monthong, Siripit Pitchuanchom, Narong Nuntasaen and Wilart Pompimon (2011), “Syringaresinol Lignan from New Species Magnolia Thailandica”, American Journal of Applied Sciences, 8 (12), 1268-1271. [49] Xiaoli Liu, Chun Cui, M. Zhao (5/2008), “Antioxidant activity of methanolic extract of emblica fruit”, Journal of Food, 21(3), 219-228. [50] Ya Zhao, Chunyan Ni, Yuting Zhang, Li Zhu (2012), “Synthesis and bioevaluation of diphyllin glycoside as novel Anti cancer Agents”, Arch. Pharm. Chem. Life Sci, 345, 622-628. [51] Ying-Jun Zhang (2006). “A novel highly oxygenated norbisabolane from the roots of Phyllanthus emblica”, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Japan, 1-14. [52] Zhang L. Z., Guo Y. J. (2000), “Studies on chemical constituents of Phyllanthus urinaria L.”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 10(25), 615-617. 48 [53] Zhang, Y. J., Tanaka, T., and Iwamoto (2000), “Novel Nor-sesquiterpenoids from the roots of Phyllanthus emblica”, Journal of Natural Products, 63(11), 1507-1511. [54] Zhang (2002), “Two new acylated flavanone glycosides from the leaves and branches of Phyllanthus emblica”, Chem. Pharm. Bull., 50, 841. PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất V3 Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất V3 Phụ lục 3. Phổ DEPT của hợp chất V3 Phụ lục 4. Phổ COSY của hợp chất V3 Phụ lục 5. Phổ HSQC của hợp chất V3 Phụ lục 7. Phổ 1H-NMR của hợp chất V1 Phụ lục 7a. Phổ 1H-NMR của hợp chất V1 Phụ lục 7b. Phổ 1H-NMR của hợp chất V1 Phụ lục 8. Phổ 13C-NMR của hợp chất V1 Phụ lục 8a. Phổ 13C-NMR của hợp chất V1 Phụ lục 8b. Phổ 13C-NMR của hợp chất V1 Phụ lục 9. Phổ DEPT của hợp chất V1 Phụ lục 10. Phổ COSY của hợp chất V1 Phụ lục 11. Phổ HSQC-NMR của hợp chất V1 Phụ lục 11a. Phổ HSQC của hợp chất V1 Phụ lục 11b. Phổ HSQC của hợp chất V1 Phụ lục 12. Phổ HMBC của hợp chất V1 Phụ lục 12a. Phổ HMBC của hợp chất V1 Phụ lục 12b. Phổ HMBC của hợp chất V1 Phụ lục 13. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất V1 NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG CHỦ TỊCH THƯ KÝ ỦY VIÊN .......................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................... .......................................................................................................................................................... ..........................................................................................................................................................