Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của loài nấm Cordyceps neovolkiana

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ  GVHD: ThS. Dương Thúc Huy SVTH: Nguyễn Khánh Toàn MSSV: K38.106.133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016 LỜI CẢM ƠN Trên con đường đi đến bến bờ của sự thành công không thể thiếu những người lái đò tận tụy. Thành công của em ngày hôm nay là cả một quá trình phấn đấu rèn luyện với sự hỗ trợ của những con người hết sức quan trọng. Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Dương Thúc Huy – người lái đò đầy tâm huyết và nhiệt tình nhất, tấm gương nghiên cứu khoa học. Thầy không những chỉ dạy cho em kiến thức chuyên môn cùng với những kinh nghiệm nghiên cứu quý báu mà còn giúp đánh thức niềm say mê nghiên cứu khoa học của em trong suốt thời gian được thầy hướng dẫn. Tất cả quý Thầy Cô khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em theo học và hoàn thành khóa luận. Các anh chị học viên cao học và các bạn sinh viên bộ môn Hóa Hữu cơ, khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã động viên, giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Các bạn sinh viên khóa 38, 39 chuyên ngành hóa hữu cơ, cùng các bạn sinh viên khoa Hóa trường Đại Học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình cộng tác, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu. Và cuối cùng con xin cảm ơn gia đình đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất về vật chất lẫn tinh thần để con có thể hoàn thành tốt khóa luận của mình. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................... 1 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CORDYCEPS ................................................ 1 1.1.1 Định nghĩa và phân loại chi Cordyceps .................................................... 1 1.1.2 Hoạt tính các hợp chất có trong chi Cordyceps ........................................ 1 1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI CORDYCEPS .......................................................................................................... 2 CHƯƠNG 2: NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM ............................................ 7 2.1 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ .................................................................................... 7 2.1.1. Hoá chất .................................................................................................... 7 2.1.2. Thiết bị ...................................................................................................... 7 2.2 NGUYÊN LIỆU ................................................................................................ 7 2.3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM ........................................................................ 8 2.3.2 Sắc kí cột trên phân đoạn cao A3.4 ........................................................... 9 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 11 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT TT4 ................................................... 11 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT T2 ..................................................... 14 4.1 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 16 4.2 ĐỀ XUẤT ........................................................................................................ 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 17 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13C-NMR : Carbon Nuclear Magnetic Resonance 1H-NMR : Proton Nuclear Magnetic Resonance d dd : Mũi đôi (Doublet) Mũi đôi đôi (Doublet of doublet) DMSO : Dimethyl sulfoxide EA : Ethyl acetate H : Hexane HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Coherence HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation J : Hằng số tương tác spin-spin m : Mũi đa (Multiplet) Me : Methanol NMR : Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) ppm : Part per million s : Mũi đơn (Singlet) t : Mũi ba (Triplet) UV : Tia cực tím (ultra violet) DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU  DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Polysaccharide được xác định bởi Yu và cộng sự, 2009 ............................ 3 Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps ................................ 4 Hình 1.3 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp) ...................... 5 Hình 1.4 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp) ...................... 6 Hình 3.1. Khung sườn sterol .................................................................................... 11 Hình 3.2 Tương quan HMBC trên nhân B của hợp chất TT4 (trái) và cấu trúc ergosterol (phải) ........................................................................................................ 12 Hình 3.3 Cấu trúc của hợp chất T2 .......................................................................... 15 Hình 4.1 Hai hợp chất cô lập được từ cao ethanol của mẫu nấm Cordyceps neovolkiana ............................................................................................................... 16  DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình cô lập hợp chất TT4 và T2  DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Phân đoạn trên cao methanol thô Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của TT4 và cerevisterol Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của T2 và ergosterol peroxide DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của TT4 (a) Phụ lục 2. Phổ 1H-NMR của TT4 (b) Phụ lục 3. Phổ 13C-NMR của TT4 Phụ lục 4. Phổ HSQCcủa TT4 Phụ lục 5. Phổ HSQC giãn rộng của TT4 Phụ lục 6. Phổ HMBC của TT4 Phụ lục 7. Phổ HMBC giãn rộng của TT4 Phụ lục 8. Phổ COSY của TT4 Phụ lục 9. Phổ 1H-NMR của T2 Phụ lục 10. Phổ 1H-NMR giãn rộng của T2 Phụ lục 11. Phổ 13C-NMR của T2 LỜI MỞ ĐẦU Từ lâu trong y học cổ truyền Trung Hoa và Tây Tạng người ta đã biết sử dụng một số loài nấm thuộc chi Cordyceps để chữa bệnh. Được biết đến nhiều nhất và có vai trò như một loại thần dược quý hiếm trong chi là loài Cordyceps sinensis (còn gọi là đông trùng hạ thảo). Chi Cordyceps với hơn 400 thuộc loài chi này có sự phân bố rộng khắp thế giới và phần lớn sinh sống ở châu Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Thái Lan và Việt Nam). Những nghiên cứu gần đây cho biết các polysaccharide hiện diện trong C. sinensis thể hiện đa dạng các hoạt tính sinh học như kháng oxi hóa, ức chế miễn dịch và chống xơ vữa động mạch, các nucleoside mang đa tác dụng trên macrophage và cordycepin có hoạt tính ức chế sự phát triển khối u và điều hòa miễn dịch. Vì thế, loài nấm này thu hút rất nhiều nhà nghiên cứu những năm gần đây dựa trên giá trị dinh dưỡng và dược học của nó. Tuy nhiên, nguồn cung cấp tự nhiên của các loài nấm này giảm dần bởi vì môi trường sống khắc nghiệt và sự khai thác quá mức nguồn nguyên liệu. Gần đây, một vài loài nấm thuộc chi Cordyceps được chiết tách và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Một nguyên cứu gần đây chứng tỏ có sự khác nhau về thành phần và hàm lượng các hợp chất hóa học giữa nấm tự nhiên và nấm nuôi cấy. Nấm nuôi cấy chứa hàm lượng của polysaccharide, adenine và adenosine cao hơn so với các loài nấm tự nhiên [27]. Xuất phát từ những ứng dụng Y học quý giá và kế thừa những kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước trên chi Cordyceps, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên loài nấm Cordyceps neovolkiana. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CORDYCEPS 1.1.1 Định nghĩa và phân loại chi Cordyceps Các loài nấm thuộc chi Cordyceps gồm có C. sinensis, C. militaris, C. pruinosa và C. ophioglossoides là nguồn nguyên liệu quý trong dược học. Thành phần dược liệu là loài nấm khô thuộc chi Cordyceps phát triển trên ấu trùng. Trong đó, phổ biến nhất là loài nấm Cordyceps sinensis, được gọi với tên Đông Trùng Hạ Thảo (Tiếng Trung Quốc, Dong-Chong-Xia-Cao hay Tochukaso, tiếng Nhật). Tên gọi trên bắt nguồn từ sự thay đổi theo mùa của nó. Vào mùa đông, ấu trùng nhiễm nấm sẽ chuyển thành sâu sống trong đất được gọi là Đông Trùng. Khi sang hè, stroma phát triển trên đầu của ấu trùng có hình dáng giống cỏ nên được gọi là Hạ Thảo. Ở Trung Quốc, đây là vị thuốc có nguồn gốc hàng ngàn năm [24]. 1.1.2 Hoạt tính các hợp chất có trong chi Cordyceps Thành phần hóa học của chi Cordyceps được tìm thấy gồm có cordycepin (30-deoxyadenosin) và dẫn xuất, ergosterol, polysaccharide, glycoprotein và peptide có chứa thành phần aminoisobutyric acid. Các hợp chất này có các hoạt tính sinh học như kháng ung thư, kháng đột biến (anti-metastatic), ức chế miễn dịch (immunomodulatory), kháng oxy hóa, kháng viêm, diệt sâu bọ (insecticidal), kháng khuẩn, hạ lipit trong máu, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ hệ thần kinh và thận. Những nghiên cứu gần đây cho biết các polysaccharide hiện diện trong C. sinensis thể hiện đa dạng các hoạt tính sinh học như : chống oxy hóa, ức chế miễn dịch, chống xơ vữa động mạch, các nucleoside mang đa tác dụng trên macrophage và cordycepin có hoạt tính ức chế sự phát triển khối u và điều hòa miễn dịch. Vì thế, loài nấm này thu hút rất nhiều nhà nghiên cứu những năm gần đây dựa trên giá trị dinh dưỡng và dược học của nó. Tuy nhiên, nguồn cung cấp tự nhiên của các loài nấm này giảm dần bởi vì môi trường sống khắc nghiệt và sự khai thác quá mức nguồn nguyên liệu. Gần đây, một vài loài nấm thuộc chi Cordyceps được chiết tách và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm [27]. 1 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn 1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI CORDYCEPS Các hợp chất như Cordycepin (3’-deoxyadenosine), 3’-amino-3’- deoxyadenosine, homocitrullyl aminoadenosine, adenine, cordycepic acid và D- mannitol đã được cô lập từ các loài nấm thuộc chi Cordyceps từ những năm 1950 (Cunningham và cộng sự, 1950 [6]; Chatterjee và cộng sự, 1957 [3]; Kredich và Guarino, 1961 [18]; Kaczka và cộng sự 1964 [10], Liu và cộng sự 1989 [22]). Một nguyên cứu gần đây chứng tỏ có sự khác nhau về thành phần và hàm lượng các hợp chất hóa học giữa nấm tự nhiên và nấm nuôi cấy. Nấm nuôi cấy chứa hàm lượng của polysaccharide, adenine và adenosine cao hơn so với các loài nấm tự nhiên. Li và cộng sự [19,20] cũng tìm thấy nấm C. sinensis nuôi cấy có hàm lượng nucleoside cao hơn loài tự nhiên. Ergosterol hiện diện trong C. sinensis được xác định bởi sắc kí lớp mỏng điều chế (Li và Li 1991; Li và cộng sự 2004) [21]. Boros và cộng sự (1994) [16] công bố ophiocordin (54), một hợp chất kháng nấm và kháng khuẩn được cô lập từ C. ophioglossoides (Kneifel và cộng sự 1977 [2]) có cấu trúc của balanol từ Verticillium balanoides. Bioxanthracenes (55-67) được cô lập từ C. pseudomilitaris (Isaka và cộng sự 2001 [8]). Ngoài ra các hợp chất cordypyridones A-D (68-71) cũng được cô lập từ loài nấm trên bởi cùng nhóm tác giả (Isaka và cộng sự 2001 [9]). Các hợp chất chứa vòng 10 carbon cepharosporolides C, E và F (71-73), cùng với cordycepin, pyridine-2,6-dicarboxylic acid và 2-carboxymethyl-4-(30- hydroxybutyl)furan (73-74) được cô lập từ C. militaris bởi Rukachaisirikul và cộng sự (2004) [26]. Krasnoff và cộng sự (2005) [17] công bố cicadapeptins I và II (các peptide chứa thành phần aminoisobutyric acid) và myriocin (kháng nấm) (51-53) từ C. heteropoda. Một glycoprotein với thành phần N-acetylgalactosamine [Gal-β(1→3)-Gal- N-Acol galactosyl-β(1→3)-N-acetyl-galactosaminitol] được cô lập từ C. ophioglossoides (Kawaguchi và cộng sự 1986) [10]. Các polysaccharide cũng được cô lập bởi nhiều nhóm tác giả. Bốn exopolysaccharides có khối lượng phân tử từ 50 kDa đến 2260 kDa được cô lập từ C. militaris bởi Kim và cộng sự (2003b, c) [13- 2 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn 15]. Yu và cộng sự (2004a, b) cũng công bố bốn polysaccharides từ C. militaris. [31-32]. Ngoài ra còn nhiều công bố khác nghiên cứu về polysaccharide từ nấm Cordyceps như Chun và cộng sự, 2003 [5]; Methacanon và cộng sự, 2005 [23]; Wu, Sun, và Pan, 2006 [28]; Xiao và cộng sự, 2006 [29]; Yu và cộng sự, 2007 [33]; Cheung và cộng sự, 2009 [4]. Các nghiên cứu chỉ dừng ở xác định thành phần các monosaccharide và khối lượng phân tử cũng như hoạt tính sinh học. Một nghiên cứu gần đây được thực hiện bởi Yu và cộng sự, 2009 [25] sử dụng nhiều phương pháp xác định cấu trúc của polysaccharide từ Cordyceps militaris. Hình 1.1 Polysaccharide được xác định bởi Yu và cộng sự, 2009. Gần đây, Yang và cộng sự [30] đã cô lập cordysinins A-E (1-5) cùng với 46 hợp chất đã biết khác từ nấm Cordyceps sinensis nuôi cấy: ergosterol (6), (17R)-17- methylincisterol (7), ergosterol peroxide (8), ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (9), fungisterol (10), hỗn hợp của β-sitosterol (11) và stigmasterol (12), hỗn hợp của β- sitosterol 3-O-acetate (13) và stigmasterol 3-O-acetate (14), 4,4-dimethyl-5α- ergosta-8,24(28)-dien-3β-ol (15), 3-O-ferulylcycloartenol (16), daidzein (17), p- hydroxybenzoic acid (18), vanillic acid (19), orobol (20), uracil (21), genistein (22), D-mannitol (23), p-methoxybenzoic acid (24), 3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone (25), acetovanillone (26), p-hydroxyphenylacetic acid (27), cyclo(L-Pro-L-Val) (28), syringic acid (29), cyclo(L-Phe-L-Pro) (30), cyclo(L-Pro-L-Tyr) (31), 2- furancarboxylic acid (32), p-methoxyphenol (33), glycitein (34), salicylic acid (35), methyl p-hydroxyphenylacetate (36), thymine (37), nicotinic acid (38), ergosteryl-3- O-β-D-glucopyranoside (39), flazin (40), 3′,4′,7-trihydroxyisoflavone (41), succinic acid (42), perlolyrine (43), 1-methylpyrimidine-2,4-dione (44), protocatechuic acid (45), 3,4-dihydroxyacetophenone (46), 4-hydroxyacetophenone (47), 2-deoxy-D- ribono-1,4-lactone (48), 1-acetyl-β-carboline (49), và adenosine (50). [ 4-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1 ]n→ → - ( 1→ 3 ) - β-D-Gal-(1 [ 6)-β-D-Gal-(1 ]3 4)-α-D-Glc→ → 3 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn N NH O OHO H O HO H H H N HO H OCH3 N N N H2N N H N CH3 HHO N H N CH3 OHH N H N OH OH HO H H Ergosterol (6) (17R)-17Methyl incisterol (7) O O O H H Ergosterol peroxide (8) HO HO O H Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (9) O H Fungisterol (10) HO HH H ß -Sitosterol (11)HO HH H Stigmasterol (12)HO HH H Cordysinin E (5)Cordysinin D (4) Cordysinin B (2) Cordysinin A (1) O HH H ß -Sitosterol 3-O-acetate (13) O Stigmasterol 3-O-acetate (14) O HH H O 4,4-Dimethyl-5a-ergosta-8,24(28)-dien-3ß -ol (15) HO H CH2 3-O-Ferulylcycloartenol (16) Daidzein (17) O HO O OH p -Hydroxybenzoic acid (18) O OH HO Vanillic acid (19) O HO O OH Orobol (20) O OH OH O HO OH Uracil (21) HN O H N O Genistein (22) OOH HO O OH D-Mannitol(23) OH OH OH OH OH HO p -Methoxybenzoic acid (24) O OH O 3-Hydroxy-2-methyl-4-pyrone (25) O O OH O H H O O O O Cordysinin C (3) Hình 2.2 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps 4 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn O O HO Acetovanillone (26) O OH HO p -Hydroxyphenylacetic acid (27) HO O O O OH Syringic acid (29) O O OH 2Furancarboxylic acid (32) HO O p -Methoxyphenol (33) O OH O HO H3CO Glycitein (34) OH O OH Salicylic acid (35) O O HO Methyl p-hydroxyphenylacetate (36) HN O N H O Thymine (37) N O OH Nicotinic acid (40) O OHO OH OH 3',4',7-Trihydroxyisof lavone (41) O HO O OH Succinic acid (42) N H N OO 1-Methylpyrimidine-2,4-dione (44) HO HO O OH Protocatechuic acid (45) OH OHO O 2-Deoxy-D-ribono- 1,4-lactone (48) OH HO HO O N N NH2 N N Adenosine (50) HN N O O CH3 H3C H Cyclo-(L-Pro-L-Val) (28) HN N O O Cyclo(L-Phe-L-Pro) (30) N N H HO O O Cyclo(L-Pro-L-Tyr) (31) H HH OO OHHO OH HO Ergosterol 3-O-ß -D-glucoside (38) H N N OH O O OH Flazin (39) H N N O OH Perlolyrine (43) OH OH CH3O 3,4- Dihydroxyacet ophenone (46) OH CH3O 4-Hydroxyacetophenone (47) H N N CH3 O 1-Acetyl-ß -carboline (49) O O OOH OH CO2H OH HN NH HO O N HO O N HO O N H O O H N N H O NH2O H N O N H O R2 R1 H N O NH2 Hyp-2 Hyp-1 Aib-1 Aib-2 Leu/Ile 51: R1 = CH3, R2 = H 52: R1 = H, R2 = CH3 Cicadapeptin I (51) and cicadapeptin II (52) Val Gln HOOC NH2HOH2C OH OH O53: Myriocin Ophiocordi (54) Hình 1.3 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp) 5 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn Hình 1.4 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp) OH N H O OH 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415 17 OH N H O OH O N H O OCH3 OH H N H O X 12 47 89 13 15 14 70 : X = OH 71 : X = H 72 68 69 O N H O 12 3 4 5 6 8 13 13 14 14 OR1 N H O OCH3 O N H O OCH3 N H O 13 14 76 : R2 = HgX 77 : R2 = OH 78 : R2 = p -bromobezoyloxy 79 73 74 : R1 = H 75 : R1 = CH3 OCH3 R2 O OCH3 OH OH N H O OH 14 O N H O OH 13 H 80 81 O H3CO H3CO OH CH3 R1 O CH3 OHOCH3 H3CO R2 O H3CO H3CO OH CH3 OH O CH3 OHOCH3 H3CO R2 O H3CO H3CO OH CH3 OH O CH3 OHOCH3 H3CO OH O H3CO H3CO OH CH3 R1 O CH3 OHOCH3 H3CO OH O H3CO H3CO OH CH3 R1 55 : R1 = OH, R2 = OH 56 : R1 = OAc, R2 = OH 57 : R1 = OAc, R2 = OAc 58 : R1 = OH, R2 = H 59 : R1 = OAc, R2 = H4 60 : R1 = H, R2 = H 61 : R2 = OH 62 : R2 = H 63 64 : R1 = OH 65 : R1 = H 66 : R1 = OH 67 : R1 = H 4a 34 5 6 7 8 9 1 9a8a 1010a 11 5' 10' 1' 3'4' 1 34 5 1' 3'4' 5' 1 34 5 10 1' 3' 10'5' 4' 6 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn CHƯƠNG 2: NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ 2.1.1. Hoá chất  Silica gel 0,04-0,06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí.  Sắc kí bảng mỏng loại Kieselgel 60F 254 (20×20), Merck.  Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, ethyl acetate, acetic acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol, butanol và nước cất.  Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: sử dụng vanillin/H2SO4. 2.1.2. Thiết bị  Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.  Các cột sắc kí.  Máy cô quay chân không.  Bếp cách thuỷ.  Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm.  Cân điện tử.  Các thiết bị ghi phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và 2D-NMR tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. 2.2 NGUYÊN LIỆU Mẫu nấm Cordyceps neovolkiana được cung cấp từ TS. Đinh Minh Hiệp (Ban quản lý khu nông nghiệp công nghệ cao) vào tháng 7 năm 2015 với khối lượng 3.5 kg. 7 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn 2.3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM Sinh khối nấm tươi (3.5 kg) được làm sạch, để khô, nghiền nhỏ thu được bột khô (700.0 g). Sau đó, bột khô được ngâm dầm trong ethanol ở nhiệt độ phòng. Lấy dịch cô quay thu hồi dung môi ở áp suất thấp thu được cao ethanol thô (với khối lượng 200.0 g). Cao ethanol thô sẽ được hòa tan nhiều lần trong methanol, tiếp tục cô quay thu hồi dung môi. Trong quá trình cô quay thu hồi dung môi, thấy xuất hiện kết tủa, lọc riêng phần kết tủa (70.0 g). Phần dịch methanol thô còn lại 130.0 g. Sau đó tiến hành sắc ký cột cao methanol thô với hệ dung môi với độ phân cực tăng dần thu được các phân đoạn tương ứng như Bảng 2.1. Tiến hành sắc kí cột trên 2 phân đoạn cao A1 và A3 thu được 2 chất là T2 và TT4. Bảng 2.1 Phân đoạn trên cao methanol thô 2.3.1 Sắc kí cột trên phân đoạn cao A1 Từ phân đoạn cao A1 (1.56 g) tách riêng phần dầu DA1 (660.0 mg) và phần tủa TA1 (0.9 g), sau đó tủa TA1 được rửa bằng acetone. Tiếp tục lấy dịch rửa (200.0 mg) thực hiện sắc ký cột với hệ dung môi H:EA:AcOH (4:1:0.2) thu được hợp chất T2 có khối lượng 6.0 mg có dạng bột màu trắng. Hệ dung môi Cao H:EA 9:1 A1 (1.56 g) H:EA 8:2 A2 (5.0 g) H:EA 7:3 A3 (3.1 g) H:EA 5:5 A4 (10.0 g) H:EA 7:3 A5 (3.0 g) H:EA 9:1 A6 (10.0 g) EA:Me 5:5 A7 (30.0 g) Me 100% M (56.0 g) 8 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn 2.3.2 Sắc kí cột trên phân đoạn cao A3.4 Cao A3 (3.1 g) được tiến hành sắc kí cột với hệ dung môi H:EA:AcOH (4:1.0:0.2) thu được 6 phân đoạn kí hiệu từ A3.1 đến A3.6. Phân đoạn A3.4 (360.0 mg) tiếp tục được sắc kí cột với hệ dung môi C:Me (5:0.1) thu được hợp chất TT4 có khối lượng 15.0 mg có dạng bột màu trắng. 9 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn - Ngâm dầm trong Ethanol - Cô quay thu hồi dung môi - SKC (sắc ký cột) H:EA EA:Me Me [9:1 – 0:10] [5:5] 100% SKC H:EA:AcOH 4:1:0,2 C:Me 5:0,1 Rửa bằng Ac nhiều lần SKC H:EA:AcOH 4:1:0,2 Sơ đồ 2.1 Quy trình cô lập hợp chất TT4 và T2 Sinh Khối Nấm 3.5 kg Cao Ethanol Thô 200.0 g A1 1.56 g Dầu (DA1) 660.0 mg Tủa TA1 900.0 mg A2 5.0 g A3 3.1 g A3.1 150.0 mg A3.2 70.0 mg A3.3 256.0 mg A3.4 360.0 mg A3.5 210.0 mg A3.6 300.0 mg A4 10.0 g A5 3.0 g A6 10.0 g A7 30.0 g M 56.0 g TT4 (15.0 mg) Dịch 660.0 mg T2 (6.0 mg) Cao Methanol 130.0 g Tủa 70.0 g Hòa tan trong Methanol nóng 10 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT TT4  Hợp chất TT4 thu được từ phân đoạn A3.  Dạng bột màu trắng, không UV.  Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) được trình bày trong Bảng 3.1 (Phụ lục 1,2,3).  Phổ HSQC, HMBC trong dung môi DMSO-d6 (phụ lục 4, 5, 6, 7, 8).  Biện luận cấu trúc hợp chất TT4 (1) Phổ 1H-NMR cho thấy 6 tín hiệu của các nhóm methyl tại: δH 0.54 (s, H3- 18), δH 0.90 (s, H3-19), δH 0.80 (d, H3-26), δH 0.79 (d, H3-27), δH 0.88 (d, H3-28), δH 1.00 (d, H3-21). Trong đó có một nhóm methyl chuyển dịch về vùng từ trường rất cao tại δH 0.54 (s, H3-18) đặc trưng cho khung sườn sterol. Hình 3.1 Khung sườn sterol Trên phổ 1H-NMR xuất hiện 2 tín hiệu ở vùng từ trường thấp của 2 proton olefin tại δH 5.24 (dd, J1 = 15.5 Hz, J2 = 7.0 Hz) và δH = 5.20 (J1 =15.5 Hz, J2 = 8.0 Hz), phân tích sự chẻ mũi của 2 proton này cho thấy sự tồn tại của 2 proton olefin ghép trans với nhau ở lân cận với 2 nhóm methine khác, qua đó xác định sự tồn tại của nối đôi tại C-22, C-23 của khung sườn sterol. Phổ 1H-NMR còn cho thấy sự hiện diện của nhóm oxymethine H-3 tại δH 3.77 mũi multiplet đặc trưng cho H-3 khung sterol. H H H HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 A B 28 C D 11 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn Phổ 13C-NMR kết hợp phổ HSQC giúp xác định 28 carbon của khung sườn ergosterol. So sánh tất cả các tín hiệu carbon của hợp chất TT4 với ergosterol [6, 34] cho thấy có sự tương đồng của tất cả các tín hiệu, ngoại trừ tín hiệu carbon của nhân B, chứng tỏ sự thay đổi nhóm thế của TT4 so với ergosterol chỉ xảy ra trên vòng B của hợp chất này. Phổ 13C-NMR còn cho thấy ngoài sự xuất hiện của liên kết đôi tại C-22 và C-23, hợp chất TT4 còn mang một liên kết đôi khác tại C-7 (δC 119.5) và C-8 (δC 139.7) trên nhân B. Trên nhân B, phổ HMBC cho thấy proton 5-OH (δH 3.63) có sự tương quan với carbon C-5 (δC 74.5), C-6 (δC 72.2) và C-10 (δC 36.7), proton H3-19 (δH 0.9, δC 19.8) có sự tương quan với các carbon C-5 (δC 74.5) và C-10 (δC 36.7). Ngoài ra proton 6-OH (δH 4.50), 5-OH (δH 3.63) cho tương quan HMBC với C-5, giúp xác định các vị trí C-5 và C-6 liên kết với oxygen. Bên cạnh đó, tương quan HMBC của H-7 (δH 5.10) tới C-5 và C-6 giúp củng cố vị trí của liên kết đôi tại C-7. Từ những dữ kiện phổ phân tích trên và so sánh với dữ liệu phổ của cerevisterol [1] hợp chất TT4 được xác định là cerevisterol. Đây là lần đầu tiên cerevisterol được tìm thấy trong chi Cordyceps. Hình 3.2 Tương quan HMBC trên nhân B của hợp chất TT4 (trái) và cấu trúc ergosterol (phải) H H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 HO OH OH A B C D H H H HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 A B 28 C D 12 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của TT4 và cerevisterol Vị trí TT4 (1) Cerevisterol (2) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 1 33.4 32.5 2 31.2 30.2 3 3.77 (m) 66.0 3.87 (m) 67.0 4 36.7 39.1 5 74.5 75.7 6 3.34 (m) 72.2 3.62 (m) 72.9 7 5.25 (dd, 15.5, 7.0) 119.5 5.14 (m) 117.3 8 139.7 143.1 9 54.2 42.9 10 36.5 36.8 11 22.6 22.4 12 40.2 38.7 13 43.0 44.0 14 51.4 54.5 15 21.4 22.7 16 27.8 27.7 17 55.4 55.8 18 0.54 (s) 12.1 0.45 (s) 11.9 19 0.91 (s) 19.5 0.90 (s) 18.0 20 42.0 40.2 21 1.00 (d, 6.5) 21.0 0.87 (d, 6.5) 19.3 22 5.20 (dd, 15.5, 8.0) 131.5 5.10 (m) 131.8 23 5.24 (dd, 15.5, 7.0) 135.4 5.20 (m) 135.3 24 42.3 42.6 25 32.5 32.8 26 0.8 (d, 6.5) 17.8 0.69 (d, 6.3) 19.6 27 0.79 (d, 6.5) 19.8 0.65 (d, 6.9) 20.8 28 0.89 (d, 7.0) 17.3 0.77 (d, 6.6) 17.2 (1) ghi trong DMSO; (2) ghi trong CDCl3 13 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT T2  Hợp chất T2 thu được từ phân đoạn A1.  Dạng bột màu trắng, không UV.  Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trong bảng 3.1 (Phụ lục 9, 10, 11).  Biện luận cấu trúc hợp chất T2 (2) Phổ 1H-NMR hợp chất T2 cũng cho thấy sự xuất hiện của 6 nhóm tín hiệu – CH3 đặc trưng của khung sườn sterol tại δH 0.84 (s, H3-18), δH 0.88 (s, H3-19), δH 0.82 (d, H3-26), δH 0.80 (d, H3-27), δH 0.91 (d, H3-28), δH 0.99 (d, H3-21). Ngoài ra phổ 1H-NMR cũng cho thấy sự hiện diện của nối đôi tại C-22 và C-23 của khung sườn ergosterol tại δH 5.20 (J1 = 15.5, J2 = 7.5) và δH 5.15 (J1 = 15.5, J2 = 8.0), và tín hiệu H-3 đặc trưng của khung sterol tại δH 3.97. Phổ 13C-NMR cho thấy sự tồn tại của 28 carbon của khung ergosterol. So sánh dữ liệu phổ của hợp chất T2 với ergosterol và hợp chất TT4 cho thấy có sự tương đồng giữa các tín hiệu ở nhân A, C, D và dây hydrocarbon, chứng tỏ sự thay đổi nhóm thế chỉ xảy ra trên nhân B của hợp chất này. Tiếp tục phân tích phổ 1H-NMR, 2 tín hiệu proton alkene H-6 (δH 6.50) và H-7 (δH 6.20) cho thấy 2 proton này ghép cis với nhau bởi hằng số ghép J = 8.5 Hz và ở vị trí β so với oxygen. So sánh phổ 13C-NMR của (2) với ergosterol thấy có sự biến mất của 2 cặp carbon tứ cấp alkene ở vị trí C-5 và C-8 cùng với sự xuất hiện của 2 cặp carbon tứ cấp liên kết với oxi tại C-5 (δC 82.3) và C-8 (δC 79.6) giúp xác định thay đổi cấu trúc của nhân B của hợp chất T2. Từ những dữ kiện phổ phân tích trên và so sánh với dữ liệu phổ của ergosterol peroxide [12], hợp chất T2 được xác định là ergosterol peroxide. 14 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn Hình 3.3 Cấu trúc của hợp chất T2 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của T2 và ergosterol peroxide Vị trí T2 (3) Ergosterol peroxide (4) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 1 34.9 34.7 2 30.3 30.2 3 3.97 (m) 66.6 3.97 (m) 66.5 4 37.1 37.0 5 82.3 79.5 6 6.20 (d, 8.5) 135.6 6.24 (d, 8.4) 130.8 7 6.50 (d, 8.5) 130.9 6.50 (d, 8.4) 135.5 8 79.6 82.2 9 51.3 51.7 10 36.2 37.0 11 20.8 20.7 12 39.5 39.4 13 44.7 44.6 14 51.8 51.1 15 23.6 23.4 16 28.8 28.7 17 56.4 56.2 18 0.84 (s) 13.0 0.82 (s) 12.9 19 0.88 (s) 18.3 0.88 (s) 18.2 20 39.9 39.8 21 0.99 (d, 6.5) 21.0 1.00 (d, 6.5) 20.9 22 5.15 (dd, 15.5, 8.0) 132.5 5.14 (dd. 15.3, 7.8) 132.3 23 5.20 (dd, 15.5, 7.5) 135.4 5.22 (dd, 15.3, 7.0) 135.2 24 42.9 42.8 25 33.2 33.1 26 0.82 (d, 7.0) 18.3 0.82 (d, 6.3) 19.7 27 0.80 (d, 7.0) 20.1 0.83 (d, 6.5) 20.0 28 0.91 (d, 6.5) 17.7 0.91 (d, 6.8) 17.6 (3),(4) ghi trong CDCl3 H H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 HO H O O 15 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 KẾT LUẬN Trong khóa luận này, chúng tôi đã bước đầu tiến hành khảo sát thành phần hóa học cao ethanol của mẫu nấm Cordyceps neovolkiana được cung cấp bởi TS. Đinh Minh Hiệp. Thực hiện các phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với sắc ký cột trên silica gel pha thường, đã cô lập được hai hợp chất đó là: Cerevisterol (TT4) và ergosterol peroxide (T2). Hình 4.1 Hai hợp chất cô lập được từ cao ethanol của mẫu nấm Cordyceps neovolkiana 4.2 ĐỀ XUẤT Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên phân đoạn A1 và A3. Trong thời gian sắp tới, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát trên các phân đoạn còn lại. Đồng thời chúng tôi sẽ tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các loại cao và hợp chất đã cô lập được. H HH HO OH OH H H H HO O O T2 TT4 16 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Aminul Haque. Md., Hossain M. S., Rahman M. Z., Rahman M. R., Hossain Md. S., Mosihuzzaman M. M., “Isolation of Bioactive Secondary Metabolites from, the Endophytic Fungus of Ocimum basillicum”, Department of Chemistry, 129, 2005. [2] Boros C., Hamilton S. M., Katz B., Kulanthaivel P., “Comparison of balanol from Verticillium balanoides and ophiocordin from Cordyceps ophioglossoides”, J. Antibiot. (Tokyo), 47, 1010–1016, 1994. [3] Chatterjee R., Srinivasan K. S., Maiti P. C., “Cordyceps sinesis (Berkeley) Saccardo: structure of cordycepic acid”, J. Am. Pharm. Assoc. Am. Pharm. Assoc. (Baltimore), 46, 114–118, 1957. [4] Cheung JK1, Li J., Cheung AW., Zhu Y., Zheng KY., Bi CW., Duan R., Choi RC., Lau DT., Dong TT., Lau BW., Tsim KW., “Cordysinocan, a polysaccharide isolated from cultured Cordyceps, activates immune responses in cultured T- lymphocytes and macrophages: signaling cascade and induction of cytokines”, J Ethnopharmacol., 124(1), 61-8, 2009. [5] Chun K. Lob, Jerry K. H. Cheungb, Shang Q. Zhub, Karl W. K. Tsimb, “A polysaccharide isolated from Cordyceps sinensis, a traditional Chinese medicine, protects PC12 cells against hydrogen peroxide-induced injury, Life Sciences 73, 2503–2513”, 2003. [6] Cunningham K. G., Manson W., Spring F. S., Hutchinson S. A., “Cordycepin, a metabolic product isolated from cultures of Cordyceps militaris (Linn.) Link”, Nature, 166, 949, 1950. [7] Huneck S., Yoshimura I., Intendification of lichen substance, Springer, Berlin, 391, 1997. [8] Isaka M., Kongsaeree P., Thebtaranonth Y., “Bioxanthracenes from the insect pathogenic fungus Cordyceps pseudomilitaris BCC 1620. II. Structure elucidation.”, J. Antibiot. (Tokyo), 54, 36–43, 2001. 17 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn [9] Isaka M., Tanticharoen M., Kongsaeree P., Thebtaranonth Y., “Structures of cordypyridones A-D, antimalarial N-hydroxy- and N-methoxy-2-pyridones from the insect pathogenic fungus Cordyceps nipponica.”, J. Org. Chem., 66, 4803–4808, 2001. [10] Kaczka E. A., Trenner N. R., Arison B., Walker R. W., Folkers K., “Identification of cordycepin, a metabolite of Cordyceps militaris, as 3’- deoxyadenosine”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 14, 456–457, 1964. [11] Kawaguchi N., Ohmori T., Takeshita Y., Kawanishi G., Katayama S., Yamada H., “Occurrence of Gal beta (1—3) GalNAc-Ser/Thr in the linkage region of polygalactosamine containing fungal glycoprotein from Cordyceps ophioglossoides”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 140, 350–356, 1986. [12] Kim D. S., Baek N.-I., Oh S. R., Jung K. Y., Lee I. S., Kim J. H., Lee H.-K. (1997), Anticomplementary activity of ergosterol peroxide from Naematoloma fasciculare and reassignment of NMR data, Archives of Phamacal Research, 20(3), 201-205. [13] Kim K. M., Kwon Y. G., Chung H. T., Yun Y. G., Pae H. O., Han J. A., Ha K. S., Kim T. W., Kim Y. M., “Methanol extract of Cordyceps pruinosa inhibits invitro and invivo inflammatory mediators by suppressing NF-kappaB activation”, Toxicol. Appl. Pharmacol., 190, 1–8, 2003. [14] Kim S. W., Hwang H. J., Xu C. P., Sung J. M., Choi J. W., Yun J. W., “Optimization of submerged culture process for the production of mycelial biomass and exo-polysaccharides by Cordyceps militaris C738”, J. Appl. Microbiol., 94, 120–126, 2003. [15] Kim S. W., Xu C. P., Hwang H. J., Choi J. W., Kim C. W., Yun J. W., “Production and characterization of exopolysaccharides from an enthomopathogenic fungus Cordyceps militaris”, NG3. Biotechnol. Progr., 19, 428–435, 2003. [16] Kneifel H., Konig W. A., Loeffler W., Muller R., “Ophiocordin, an antifungal antibiotic of Cordyceps ophioglossoides Arch.”, Microbiol., 113, 121– 130, 1977. 18 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn [17] Krasnoff, S. B., Reátegui, R. F., Wagenaar, M. M., Gloer, J. B., Gibson, D. M., “Cicadapeptins I and II: new Aib-containing peptides from the entomopathogenic fungus Cordyceps heteropoda”, J. Nat. Prod. 68: 50-55, 2005. [18] Kredich N. M., GuarinoA. J., “Homocitrullyl amino adenosine, a nucleoside isolated from Cordyceps militaris”, J. Biol. Chem., 236, 3300–3302, 1961. [19] Li S. P., Li P., Dong T. T., Tsim K. W., “Anti-oxidationactivity of different types of natural Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps mycelia”, Phytomedicine, 8, 207–212, 2001. [20] Li S. P., Li P., Dong T. T., Tsim K. W., “Determination of nucleosides in natural Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps mycelia by capillary electrophoresis”, Electrophoresis, 22, 144–150, 2001. [21] Li S. P., Li P., Lai C. M., Gong Y. X., Kan K. K., Dong T. T., Tsim K. W., Wang Y. T., “Simultaneous determination of ergosterol, nucleosides and their bases from natural and cultured Cordyceps by pressurised liquid extraction and high- performance liquid chromatography”, J. Chromatogr. A, 1036, 239–243, 2004. [22] Liu J. M., Zhong, Y. R., Yang Z., Cui S. L., Wang F. H., “Chemical constituents of Cordyceps militaris (L.) Link.”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 14, 608–609, 1989. [23] Methacanon P., Madla S., Kirtikara K., Prasitsil M., “Structural elucidation of bioactive fungi-derived polymers”, Carbohydrate Polymers, 60, 199–203, 2005. [24] Ng T. B., Wang H. X., “Pharmacological actions of Cordyceps, a prized folk medicine”, Journal of Pharmacy and pharmacology, 57, 1509–1519, 2005. [25] Rongmin Yu, Yin Yin, Wei Yang, Weili Ma, Lin Yang, Xiujuan Chen, Zhang Zhang, Bin Ye, Liyan Song, “Structural elucidation and biological activity of a novel polysaccharide by alkaline extraction from cultured Cordyceps militaris”, Carbohydrate Polymers 75, 166–171, 2009. [26] Rukachaisirikul V., Pramjit S., Pakawatchai C., Isaka M., Supothina S. “10- membered macrolides from the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris BCC 2816”, J. Nat. Prod., 67, 1953–1955, 2004. [27] Wang J., Kan L., Nie S., Chen H., Cui S. W., Phillips A. O., Phillips G. O., Li Y., Xie M., “Comparison of chemical composition, bioactive components and 19 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn antioxidant activity of natural and cultured Cordyceps sinensis”, LWT - Food Science and Technology, 63, 2-7, 2015. [28] Wu Y. L., Sun C. R., Pan Y. J., “Studies on isolation and structural features of a polysaccharide from the mycelium of a Chinese edible fungus (Cordycepsm sinensis)”, Carbohydrate Polymers, 63, 251–256, 2006. [29] Xiao J. H., Chen D. X., Wan W. H., Hu X. J., Qi Y., Liang Z. Q., “Enhanced simultaneous production of mycelia and intracellular polysaccharide in submerged cultivation of Cordyceps jiangxiensis using desirability functions”, Process Biochemistry, 41, 1887–1893, 2006. [30] Yang M. L., Kuo P. C., Hwang T. L., Wu T. S., “Anti-inflammatory Principles from Cordyceps sinensis”, J. Nat. Prod., 74, 1996–2000, 2011. [31] Yu R. M., Song L. Y., Zhao Y., Bin W., Wang L., Zhang H., et al., “Isolation and biological properties of polysaccharide CPS-1 from cultured Cordyceps militaris”, Fitoterapia., 75, 465–472, 2004. [32] Yu R. M., Wang L., Zhang H., Zhou C. X., Zhao Y., “Isolation, purification and identification of polysaccharides from cultured Cordyceps militaris”, Fitoterapia., 75, 662–666, 2004. [33] Yu R. M., Yang W., Song L. Y., Yan C. Y., Zhang Z., Zhao Y., “Structural characterization and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of cultured Cordyceps militaris”, Carbohydrate Polymers, 70, 430–436, 2007. [34] 13/5/2016. 20 PHỤ LỤC 0.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.84.04.24.44.64.85.05.25.45.6 f1 (ppm) 2. 90 6. 63 6. 27 3. 22 1. 34 1. 08 1. 00 0. 90 0. 55 3 0. 80 1 0. 81 4 0. 82 7 0. 88 7 0. 90 1 0. 91 4 1. 24 2 1. 48 0 3. 60 8 4. 23 5 4. 24 6 4. 50 5 4. 51 7 5. 08 4 5. 08 9 5. 09 2 5. 09 4 5. 15 6 5. 17 2 5. 18 6 5. 20 3 5. 22 3 5. 23 8 5. 25 4 5. 26 8 CS-TT4-DMSO-1H 5. 08 4 5. 08 9 5. 09 2 5. 09 4 3 - Hax 21 28 1819 26 27 6 - OH 7 5.155.205.25 f1 (ppm) 5. 15 6 5. 17 2 5. 18 6 5. 20 3 5. 22 3 5. 23 8 5. 25 4 5. 26 8 23 22 5 - OH Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của TT4 (a) H HH HO OH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 0.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.84.04.24.44.64.85.05.25.45.6 f1 (ppm) 2. 90 6. 63 6. 27 3. 22 1. 34 1. 08 1. 00 0. 90 2. 32 0. 55 3 0. 80 1 0. 81 4 0. 82 7 0. 88 7 0. 90 1 0. 91 4 1. 24 2 1. 48 0 3. 60 8 4. 23 5 4. 24 6 4. 50 5 4. 51 7 5. 08 4 5. 08 9 5. 09 2 5. 09 4 5. 15 6 5. 17 2 5. 18 6 5. 20 3 5. 22 3 5. 23 8 5. 25 4 5. 26 8 CS-TT4-DMSO-1H 0. 55 3 0. 80 1 0. 81 4 0. 82 7 0. 88 7 0. 90 1 0. 91 4 1. 00 9 5. 08 4 5. 08 9 5. 09 2 5. 09 4 3 - Hax 23 22 21 28 1819 26 27 6 - OH 7 5 - OH Phụ lục 2. Phổ 1H-NMR của TT4 (b) H HH HO OH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 -20-100102030405060708090100110120130140 f1 (ppm) 12 .1 93 17 .2 70 17 .7 63 19 .5 11 19 .8 00 21 .0 28 21 .3 75 22 .5 89 27 .7 71 29 .0 75 31 .2 12 32 .4 42 36 .7 00 42 .0 24 42 .3 19 42 .9 77 54 .1 87 55 .2 95 66 .0 39 72 .1 75 74 .5 40 11 9. 39 4 13 1. 50 6 13 5. 45 7 13 9. 70 7 CS-TT4-DMSO-13C 19 28 26 18 27 21 15 11 16 25 4,108 7 5 62322 3 17 2 9 13 24 20 Phụ lục 3. Phổ 13C-NMR của TT4 H HH HO OH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5 f2 (ppm) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 f1 ( pp m ) CS-TT4-DMSO-HSQC 19 27 26 18 28 21 3 - Hax723 22 19 28 26 18 27 21 15,11 16 225 4,10 20 24 13 9 17 3 6 5 7 22 23 8 Phụ lục 4. Phổ HSQC của TT4 H HH HO OH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 0.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.22.42.6 f2 (ppm) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 f1 ( pp m ) CS-TT4-DMSO-HSQC 19 27 26 18 28 21 19 28 26 20 24 13 9 17 3 27 18 21 15 11 4, 10 25 2 16 Phụ lục 5. Phổ HSQC giãn rộng của TT4 H HH HO OH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0 f2 (ppm) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 f1 ( pp m ) CS-TT4-DMSO-HMBC 19 28 26 18 27 21 15,11 16 2 25 4,10 20 19 24 26 27 13 28 18 9 21 5 - OH 17 3 - Hax23 3 22 7 6 6 - OH 5 7 22 23 8 Phụ lục 6. Phổ HMBC của TT4 H HH HO OH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.31.41.51.61.71.81.92.0 f2 (ppm) 10 20 30 40 50 60 70 80 f1 ( pp m ) CS-TT4-DMSO-HMBC 19 2726 18 28 21 19 28 26 27 18 21 15 11 16 2 25 4, 10 20 24 13 9 17 3 6 5 Phụ lục 7. Phổ HMBC giãn rộng của TT4 H HH HO OH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0 f2 (ppm) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 f1 (p pm ) 3 - Hax 19 27 26 28 18 21 23 22 19 27 26 28 18 21 3 - Hax 23 22 6 - OH 5 - OH 6 - OH 5 - OH Phụ lục 8. Phổ COSY của TT4 H HH HO OH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5 f1 (ppm) -100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 9. 25 2. 80 3. 05 3. 13 3. 70 2. 89 11 .7 8 1. 98 2. 29 1. 97 1. 89 0. 91 1. 22 1. 19 1. 19 1. 18 0. 94 1. 00 0. 80 9 0. 81 5 0. 82 3 0. 82 5 0. 88 3 1. 35 9 1. 55 6 1. 67 3 1. 67 9 1. 68 6 1. 70 0 1. 70 6 1. 71 4 1. 84 4 1. 96 7 2. 02 4 2. 10 2 3. 92 1 3. 93 7 3. 94 7 3. 96 0 3. 97 0 3. 98 0 3. 99 3 4. 00 3 4. 01 2 4. 02 2 4. 03 4 4. 04 5 5. 12 0 5. 13 6 5. 15 1 5. 16 7 5. 19 9 5. 21 4 5. 23 0 5. 24 5 6. 23 2 6. 24 9 6. 49 5 6. 51 2 T2-CDCL3-1H 3-Hax 2223 67 18 26 27 19 28 21 Phụ lục 9. Phổ 1H-NMR của T2 H H H HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 O O 0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5 f1 (ppm) -100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 9. 25 2. 80 3. 05 3. 13 3. 70 2. 89 11 .7 8 1. 98 2. 29 1. 97 1. 89 0. 91 1. 22 1. 19 0. 80 9 0. 81 5 0. 82 3 0. 82 5 0. 88 3 1. 35 9 1. 55 6 1. 67 3 1. 67 9 1. 68 6 1. 70 0 1. 70 6 1. 71 4 1. 84 4 1. 96 7 2. 02 4 2. 10 2 3. 92 1 3. 93 7 3. 94 7 3. 96 0 3. 97 0 3. 98 0 3. 99 3 4. 00 3 4. 01 2 4. 02 2 4. 03 4 4. 04 5 5. 12 0 5. 13 6 5. 15 1 5. 16 7 5. 19 9 5. 21 4 5. 23 0 5. 24 5 6. 23 2 6. 24 9 6. 49 5 6. 51 2 T2-CDCL3-1H 3-Hax 2223 18 26 27 19 28 216.26.36.46.56.6 f1 (ppm) 0 100 200 300 400 6. 23 2 6. 24 9 6. 49 5 6. 51 2 7 6 5.055.105.155.205.25 f1 (ppm) 0 500 1000 5. 12 0 5. 13 6 5. 15 1 5. 16 7 5. 19 9 5. 21 4 5. 23 0 5. 24 5 Phụ lục 10. Phổ 1H-NMR giãn rộng của T2 101520253035404550556065707580859095100105110115120125130135 f1 (ppm) -5000 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 17 .7 07 18 .3 23 19 .7 87 20 .0 90 20 .6 43 21 .0 31 23 .6 20 28 .8 58 30 .2 88 33 .2 24 34 .8 58 37 .1 00 39 .3 71 39 .8 62 42 .8 83 44 .6 40 51 .2 72 51 .8 01 56 .1 77 66 .4 97 79 .5 75 82 .3 02 13 0. 90 5 13 2. 47 9 13 5. 35 6 13 5. 56 7 T2-CDCL3-13C 1224 13 9 14 17 3 85 7 2322 6 20 4,10 1 25 2 16 11 15 21 27 26 19 28 18 Phụ lục 11. Phổ 13C-NMR của T2 H H H HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 O O