Luận án Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết dengue và chế tạo kháng nguyên ns1 tái tổ hợp gộp 4 týp phát hiện kháng thể kháng vi rút dengue bằng kỹ thuật elisa

ublic Health 2022, 19, 8756 5 of 27 Dengue Day 1 Test; (6) Dengue Ag Rapid Test- Cassette (CTK Biotech, Inc., Poway, CA, Mỹ); (7) CareUS Dengue Combo (WellsBio, Seoul, Hàn Quốc); (8) Humasis Dengue Combo (Humasis, Anyang, Hàn Quốc); (9) Wondfo Dengue Combo (Trung Quốc); (10) SD BIOLINE Dengue DUO® (Standard Diagnostic Inc., Seoul, Hàn Quốc); (11) Biosynex®Dengue NS1 assay (Biosynex SA, Illkirch-Graffenstaden, Pháp); (12) ViroTrack Dengue Acute (BluSense Diagnostics, Đan Mạch); (13) SD Dengue NS1 Ag 5 ELISA (Standard Diagnostics, Hàn Quốc); (14) Answer Dengue Ag Rapid Test (CTK Biotech, Hoa Kỳ); (15) Rapid Dengue NS1 Antigen Test Card (Xiamen Boson Biotech, Trung Quốc); (16) SD Bioline Dengue NS1 Ag (Standard Diagnostics, Hàn Quốc); (17) Dengue NS1 BSS (Biosynex, Thụy Sĩ); (18) Panbio Dengue Early Rapid (Standard Diagnostics, Hàn Quốc); (19) ELISA; (20) SD BIOLINE Dengue NS1Ag (Bioline Diagnostics LLP, Delhi, Ấn Độ); (21) DEN-NS-PAD (Int J Infect Dis., 2021; 107); (22) Standard QTM Dengue Duo (SD Biosensor); (23) MULTISURE Dengue Ab/Ag Rapid Test (MP Biomedicals); (24) DENV Detect NS1 ELISA (InBios International, Inc.); (25) Dengue vi rút NS1 ELISA (Euroimmun); (26) Asan Easy Test Dengue NS1 Ag 100 (Asan Pharm); (27) Ichroma Dengue NS1 (Boditech Med); (28) Dengue NS1 Antigen (AsiaGen Corp., Đài Loan). Phụ lục VII DIỆN TÍCH DƯỚI ĐƯỜNG CONG VÀ TỶ SUẤT CHẨN ĐOÁN CỦA TEST NHANH KHÁNG NGUYÊN NS1 NS1/IGM VÀ NS1/IGM/IGG Ở MỘT SỐ NGHIÊN CỨU Tác giả, năm, quốc gia Tỷ lệ (+) (a) XN tham chiếu Loại test AUROC (KTC 95%) DOR (KTC 95%) Haider M. và cs. (2022) (n= 5202) [117] 55,9% ELISA, RT-PCR 9 loại NS1 48,35 6 loại IgM 10,54 NS1/IgM 27,87 Chong Z. L., 2020 Malaysia (n= 490) [165] 46,3% RT-PCR hoặc Panbio NS1 ELISA (12)NS1 0,79 (0,75–0,82) 31,7 (17,2–58,5) (13)NS1 0,81 (0,78–0,84) 41,4 (22,0–77,9) (10)NS1 0,75 (0,72–0,78) 47,0 (20,5–108,0) (10)IgM 0,72 (0,69–0,75) 53,6 (20,0–143) (10)IgG 0,58 (0,55–0,62) 3,1 (1,9–5,0) (10) NS1/IgM 0,86 (0,83–0,89) 87,9 (42,8–180) (10) NS1/IgM/IgG 0,85 (0,82–0,88) 32,4 (19,7–53,4) Prabowo M. H. và cs. (2021), Thái Lan (n= 219) [174] 45,0% Nested- PCR (21)NS1 52 (22,9–117,9) (10)NS1 65,25 (27,9–152,4) * Mẫu: Huyết thanh; (a) Xét nghiệm tham chiếu; (10) SD BIOLINE Dengue DUO® (Standard Diagnostic Inc., Seoul, Hàn Quốc); (12) ViroTrack Dengue Acute (BluSense Diagnostics, Đan Mạch); (13) SD Dengue NS1 Ag ELISA (Standard Diagnostics, Hàn Quốc); (21) DEN-NS-PAD (Int J Infect Dis., 2021; 107) Phụ lục VIII TRÌNH TỰ MỒI KHUẾCH ĐẠI CÁC ĐOẠN GEN XÁC ĐỊNH TÝP HUYẾT THANH CỦA VI RÚT DENGUE Týp huyết thanh vi rút Trình tự mồi 5’-3’ Kích thước Dengue_F 5′-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3′ DENV1_R 5′-CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3′ 482 bp DENV2_R 5′-CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3′ 119 bp DENV3_R 5′-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3′ 290 bp DENV4_R 5′-CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA-3′ 392 bp Phụ lục IX SỰ PHÙ HỢP GIỮA CHẨN ĐOÁN KHÁNG NGUYÊN NS1 VÀ KẾT QUẢ PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ IGM/IGG CỦA MỘT SỐ XÉT NGHIỆM [163] Abcam Euroimmun Asan SD Boditech Med NS1 InBios - 98,6* , 0,93 (0,82–1,00) # 92,8, 0,51 (0,25–0,77) 94,9, 0,67 (0,45–0,90) 95,7, 0,73 (0,52–0,93) Euroimmun - - 92,8, 0,51 (0,25–0,77) 94,9, 0,67 (0,45–0,90) 95,7, 0,73 (0,52–0,93) Asan - - - 97,8, 0,79 (0,56–1,00) 97,1, 0,73 (0,49–0,98) SD - - - - 97,8, 0,82 (0,60–1,00) IgM InBios 86,2, 0,71 (0,60–0,83) 70,3, 0,34 (0,21–0,48) 74,6, 0,44 (0,31–0,58) 73,2, 0,42 (0,27–0,56) 84,8, 0,69 (0,57–0,81) Abcam - 79,7, 0,52 (0,38–0,66) 81,2, 0,55 (0,42–0,69) 82,6, 0,60 (0,46–0,74) 81,2, 0,61 (0,48–0,74) Euroimmun - - 91,3, 0,71 (0,55–0,86) 89,9, 0,69 (0,54–0,84) 69,6, 0,33 (0,20–0,47) Asan - - - 91,3, 0,74 (0,60–0,88) 73,9, 0,43 (0,30–0,57) SD - - - - 72,5, 0,41 2 Abcam Euroimmun Asan SD Boditech Med (0,27–0,55) IgG InBios 92,8, 0,86 (0,77–0,94) 97,1, 0,94 (0,89–0,99) 83,3, 0,67 (0,55–0,78) 84,8, 0,70 (0,58–0,81) 95,7, 0,91 (0,85–0,98) Euroimmun - 92,8, 0,86 (0,77–0,94) 77,5, 0,57 (0,45–0,69) 80,4, 0,62 (0,50–0,74) 91,3, 0,83 (0,73–0,92) Asan - - 84,8, 0,69 (0,58–0,81) 86,2, 0,72 (0,61–0,83) 95,7, 0,91 (0,84–0,98) SD - - - 94,2, 0,87 (0,79–0,96) 83,3, 0,66 (0,54–0,78) SD - - - - 86,2, 0,72 (0,61–0,83) *: Tỷ lệ phù hợp, Thỏa thuận (%), (#) Hệ số Kappa (KTC 95%). Phụ lục IX TRÌNH TỰ CỦA TỪNG DENGUE Týp Trình tự protein 112-260 Trình tự DNA DENV1 KYSWKSWGKAKIIGAD VQNTTFIIDGPNTPECPD NQRAWNIWEVEDYGF GIFTTNIWLKLRDSYTQ VCDHRLMSAAIKDSKA VHADMGYWIESEKNET WKLARASFIEVKTCIWP KSHTLWSNGVLESEMII PKIYGGPISQHNYRPGY AAATACTCGTGGAAAAGCTGGGGA AAAGCCAAAATCATAGGAGCAGAT GTACAGAATACCACCTTCATCATCG ACGGCCCAAACACCCCAGAATGCC CTGATAACCAAAGAGCATGGAACA TTTGGGAAGTTGAAGACTATGGATT TGGAATTTTCACGACAAACATATGG TTGAAATTGCGTGACTCCTACACTC AAGTGTGTGACCACCGGCTAATGTC AGCTGCCATCAAGGATAGCAAAGC AGTCCATGCTGACATGGGGTACTGG ATAGAAAGTGAAAAGAACGAGACT TGGAAGTTGGCAAGAGCCTCCTTCA TAGAAGTTAAGACATGCATCTGGCC AAAATCCCACACTCTATGGAGCAAT GGAGTCCTGGAAAGTGAGATGATA ATCCCAAAGATATATGGAGGACCA ATATCTCAGCACAACTACAGACCA GGATAT DENV2 KYSWKTWGKAKMLST ESHNQTFLIDGPETAEC PNTNRAWNSLEVEDYG FGVFTTNIWLKLKEKQ DVFCDSKLMSAAIKDN RAVHADMGYWIESALN DTWKIEKASFIEVKNCH WPKSHTLWSNGVLESE MIIPKNLAGPVSQHNYR PGY AAGTATTCATGGAAAACATGGGGC AAAGCAAAAATGCTCTCTACAGAG TCTCATAACCAGACCTTTCTCATTG ATGGCCCCGAAACAGCAGAATGCC CCAACACAAATAGAGCTTGGAATT CGTTGGAAGTTGAAGACTATGGCTT TGGAGTATTCACCACCAATATATGG CTAAAATTGAAAGAAAAACAGGAT GTATTCTGCGACTCAAAACTCATGT CAGCGGCCATAAAAGACAACAGAG CCGTCCATGCCGATATGGGTTATTG GATAGAAAGTGCACTCAATGACAC ATGGAAGATAGAGAAAGCCTCTTT CATTGAAGTTAAAAACTGCCACTGG CCAAAATCACACACCCTCTGGAGC AATGGAGTGCTAGAAAGTGAGATG ATAATTCCAAAGAATCTCGCTGGAC CAGTGTCTCAACACAACTATAGACC AGGCTAC 2 Týp Trình tự protein 112-260 Trình tự DNA DENV3 KYSWKTWGKAKIVTAE TQNSSFIIDGPNTPECPS ASRAWNVWEVEDYGF GVFTTNIWLKLREVYT QLCDHRLMSAAVKDER AVHADMGYWIESQKN GSWKLEKASLIEVKTCT WPKSHTLWTNGVLESD MIIPKSLAGPISQHNYRP GY AAATACTCATGGAAAACGTGGGGA AAGGCAAAAATAGTGACAGCTGAA ACACAAAATTCCTCTTTCATAATAG ACGGGCCAAACACACCGGAGTGTC CAAGTGCCTCAAGAGCATGGAATG TGTGGGAGGTGGAAGATTACGGGT TCGGAGTCTTCACAACCAACATATG GCTGAAACTCCGAGAGGTCTACAC CCAACTATGTGACCATAGGCTAATG TCGGCAGCTGTCAAGGATGAGAGG GCCGTGCATGCCGACATGGGCTACT GGATAGAAAGCCAAAAGAATGGAA GTTGGAAGCTAGAAAAAGCATCCC TCATAGAGGTAAAAACCTGCACAT GGCCAAAATCACACACTCTCTGGAC TAATGGTGTGCTAGAGAGTGACAT GATCATCCCAAAGAGTCTAGCTGGT CCTATCTCACAACACAACTACAGGC CCGGGTAC DENV4 KYSWKTWGKAKIFTPE ARNSTFLIDGPDTSECP NERRAWNSLEVEDYGF GMFTTNIWMKFREGSS EVCDHRLMSAAIKDQK AVHADMGYWIESSKNQ TWQIEKASLIEVKTCLW PKTHTLWSNGVLESQM LIPKSYAGPFSQHNYRQ GY AAATATTCATGGAAGACATGGGGA AAAGCAAAAATCTTCACCCCAGAA GCAAGAAATAGCACATTTTTAATAG ACGGACCAGACACCTCTGAATGCC CCAATGAACGAAGAGCATGGAACT CTCTTGAGGTGGAAGACTATGGATT TGGCATGTTCACGACCAACATATGG ATGAAATTCCGAGAAGGAAGTTCA GAAGTGTGTGACCACAGGTTAATGT CAGCTGCAATTAAAGATCAGAAAG CTGTGCATGCTGACATGGGTTATTG GATAGAGAGCTCAAAAAACCAGAC CTGGCAGATAGAGAAAGCATCTCTT ATTGAAGTGAAAACATGTCTGTGGC CCAAGACCCACACACTGTGGAGCA ATGGAGTGCTGGAAAGCCAGATGC TCATTCCAAAATCATATGCGGGCCC TTTTTCACAGCACAATTACCGCCAG GGCTAT 3 Týp Trình tự protein 112-260 Trình tự DNA Trình tự protein concensus chung cho 4 týp (Trình tự nucleotide được optimine bởi gensmart cho E.coli) KYSWKTWGKAKILTAE SQNSTFLIDGPNTPECPN TNRAWNSLEVEDYGFG VFTTNIWLKLREKYTQ VCDHRLMSAAIKDNRA VHADMGYWIESAKND TWKIEKASFIEVKTCHW PKSHTLWSNGVLESEMI IPKSLAGPISQHNYRPG Y AAGTATTCATGGAAAACATGGGGA AAAGCTAAGATCTTGACCGCAGAA TCCCAGAATTCGACCTTCCTGATTG ACGGCCCAAATACTCCGGAGTGCC CGAACACGAACCGCGCGTGGAATA GCTTGGAGGTGGAAGACTATGGTTT CGGCGTCTTTACCACGAACATCTGG CTGAAACTGCGCGAAAAGTACACC CAGGTGTGCGATCATCGTCTGATGA GCGCGGCAATTAAAGATAACCGTG CGGTGCACGCTGATATGGGTTACTG GATCGAGTCTGCTAAAAACGACAC CTGGAAAATCGAGAAGGCGAGCTT TATCGAGGTTAAGACCTGTCATTGG CCGAAGTCCCACACCCTGTGGAGC AATGGCGTTCTGGAATCTGAAATGA TTATCCCGAAAAGCCTTGCCGGTCC GATTAGCCAACACAACTATCGTCCG GGTTAC Phụ lục X TÍNH CHẤT VẬT LÝ ĐOẠN PEPTIT LỰA CHỌN Đặc điểm Số axit amin 149 Khối lượng 17167.44 Số a.a tích điện âm 16 Số a.a tích điện dương 18 pI lý thuyết 8.43 Hệ số tắt 53065 Thời gian bán hủy in vivo trong tế bào động vật 1.3 hours Chỉ số bất ổn 34.07 Chỉ số béo 68.12 Giá trị kị nước GRAVY -0.608 Tính kháng nguyên (VaxiJen) 0.4426 Phụ lục XI CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ PHỤC VỤ CHO NGHIÊN CỨU MỤC TIÊU 2 1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số - Nguyên lý: Việc thu nhận DNA từ tế bào vi khuẩn được tiến hành thông qua nhiều bước. Các giai đoạn cơ bản của tách chiết DNA bao gồm: (1) Phá màng tế bào và màng nhân, (2) Loại protein, (3) Tủa DNA. - Tiến hành: Ly tâm dịch khuẩn nuôi qua đêm với tốc độ 8000 v/p trong 7 phút, thu cặn loại bỏ dịch. Bổ sung 540 μl đệm tách chiết vào mỗi mẫu rồi votex kĩ để hòa tan tế bào. Bổ sung 5 μl protease K vào mỗi mẫu, đem lắc ở 37oC trong 90 phút. Bổ sung 60 μl SDS 20%, ủ ở 65oC trong 120 phút, có đảo trộn. Bổ sung 600 μl CI (Chloroform isoamylalcohol), ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC, sau đó thu pha trên ra ống eppendorf mới. Lặp lại bước này thêm 1 lần nữa. Kết tủa DNA bằng 350 μl Isopropanol ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ, ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 4oC, thu tủa. Rửa tủa bằng 500 μl Ethanol 70%, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC, thu cặn. Làm khô DNA bằng máy hút chân không Mi-vac 110 V, sau đó hòa tan DNA trong nước khử ion và bảo quản mẫu ở -20oC. 2. Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) - Nguyên lý: Phương pháp PCR được Kary Mullis và cộng sự phát triển năm 1986. Phương pháp này được ứng dụng trong sinh học phân tử để khuếch đại in vitro số lượng lớn một trình tự DNA bằng enzyme polymerase và một cặp mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) qua phản ứng chuỗi trong một chu kì nhiệt. - Tiến hành Gen NS1-DENV1-4 được nhân bản với các cặp mồi tương ứng (NS1_Cl_F CATATGAAGTATTCATGGAAAACATGGGG và NS1_Cl_R CTCGAGGTAACCCGGAGG) trong phản ứng PCR có thành phần như trong Bảng PL1 và chu trình nhiệt ở Bảng PL2. Bảng PL1. Thành phần PCR Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) Đệm 10x 1X 2,50 MgCl2 2,5 mM 2,50 dNTP 2 mM 2,00 Mồi xuôi 10 pmol/µl 1,00 Mồi ngược 10 pmol/µl 1,00 Taq-polymerase 5 U/µl 0,25 DNA khuôn 50-100 ng/l 1,00 H2O khử ion vô trùng 14,75 Tổng thể tích 25,00 2 Bảng PL2. Chu trình nhiệt của các PCR Phản ứng PCR Chu trình nhiệt Nhân gen NS1-DENV1-4 95°C/3 phút, 30 chu kỳ (95°C/30 giây, 58°C/30 giây, 72°C/30 giây); 72°C/2 phút 3. Tách dòng bằng vector pjet1.2 - Nguyên lý: pJET1.2 là vector chọn lọc có kích thước 2974 bp, có khả năng tiếp nhận các đoạn chèn có kích thước từ 6 bp đến 10 kb. Đầu 5’ của vị trí tách dòng chứa các nhóm phosphoryl, do đó, không cần phosphoryl hóa các mồi PCR. - Tiến hành: Thực hiện phản ứng cắt tạo đầu bằng trên đá với thành phần phản ứng gồm 10 µl 2X Reaction Buffer, 1 µl Sản phầm PCR sau tinh sạch, thêm nước khử ion đến 17 µl rồi thêm 1 µl DNA Blunting Enzyme. Hỗn hợp phản ứng được làm tan trong thời gian ngắn và li tâm trong 3 đến 5 giây, sau đó được ủ 70oC trong 5 phút rồi cắm vào đá. Thêm 1 µl vector nhân dòng pJET (50 ng/µl) và 1 µl T4 DNA Ligase vào ống phản ứng, làm tan nhẹ rồi li tâm 3 đến 5 giây. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ phòng (22oC) trong 5 phút, sau đó có thể được sử dụng trực tiếp cho biến nạp. 4. phương pháp đọc trình tự dna trên máy đọc trình tự tự động và phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụng - Trình tự nucleotide của gen seb được xác định bằng phương pháp xác định trình tự gen tự động trên máy ABI PRISMR 3100 Avant Genetic Analyzer. Tại phòng thí nghiệm Viện Nghiên cứu hệ gen – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phân tích kết quả: + Kiểm tra kết quả thu được bằng phần mềm máy tính BioEdit 7.0. + Khai thác dữ liệu từ genbank để so sánh. + Xử lý và phân tích các trình tự đoạn gen NS1-DENV1-4 (gọi tắt là recombinant NS1/ rNS1) bằng chương trình phân tích chuỗi BioEdit. 5. Phản ứng nối ghép gen - Nguyên lý: Enzyme T4 ligase được tách chiết từ các tế bảo E. coli bị nhiễm thực khuẩn thể T4. Enzyme này có khả năng hình thành liên kết phosphodiester giữa nhóm OH ở đầu 3’ và nhóm phosphat đầu 5’ trên mạch DNA hoặc RNA. - Tiến hành: Phản ứng gắn dính bao gồm 4 µl đệm gắn dính 5x; 3 µl DNA plasmid; 9 µl đoạn chèn DNA; 2,5 µl T4 ligase; 1,5 µl nước khử ion; tổng thể tích 20 µl phản ứng. Trộn hỗn hợp phản ứng cẩn thận và ủ qua đêm ở 16°C. 6. Phương pháp biến nạp dna plasmid vào tế bào khả biến Escherichia Coli - Nguyên lý: Plasmid được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5 và E.coli BL21 theo phương pháp sốc nhiệt và hóa học. Nguyên lý của phương pháp là E. coli được xử lý bằng CaCl2 giúp DNA dễ dàng bám dính vào màng tế bào, khi sốc nhiệt, sử dụng sự thay đổi đột ngột về nhiệt độ để tác động lên cấu trúc thành tế bào, tạo điều kiện cho DNA ngoại lai đi vào trong tế bào. 3 - Quy trình + Chuẩn bị tế bào khả biến: Khuẩn lạc E. coli được nuôi trong 4 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Chuyển 1 ml dịch nuôi vào bình 100 ml LB lỏng, tiếp tục nuôi lắc ở 37°C trong 3-3,5 giờ để đạt OD600nm 0,5-0,6. Dịch nuôi cấy để lạnh hoặc cắm trong đá 10 phút cho ổn định rồi ly tâm thu tế bào 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. Thu cặn tế bào, úp ngược ống trên giấy phơi khô trong 1 phút. Hòa tế bào bằng cách khuấy hoặc vortex nhẹ trong 30 ml dung dịch MgCl2- CaCl2 lạnh (80 mM MgCl2; 20 mM CaCl2). Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C để thu cặn tế bào, sau đó úp ngược phơi khô trong 1 phút. Tiếp tục hòa tế bào trong 2 ml CaCl2 0,1 M với 50 ml môi trường gốc. Sử dụng tế bào này cho biến nạp, nếu chưa dùng ngay thì bổ sung glycerol 70% theo tỷ lệ 2 CaCl2: 1 glycerol 70% rồi đặt vào tủ âm 80 để dùng dần. + Biến nạp plasmid vào E. coli: Đưa tế bào khả biến từ -80oC ra xốp đá. Để tan từ từ (trong khoảng 20 phút). Cho 40 µl tế bào khả biến và 3 µl dung dịch sau phản ứng nối ghép gen vào một ống eppendorf mới, đảo nhẹ nhàng ủ trong đá khoảng 20 phút. Sau đó, mẫu được sốc nhiệt trong bể ổn nhiệt 42°C sau 45 giây, lấy mẫu ra và đặt lên đá trong 2 phút. Bổ sung 250 µl môi trường LB lỏng và nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37°C trong 1 giờ. Cấy trải 100 µl dịch nuôi trên đĩa LB bổ sung ampicilin (100 µg/ml). Nuôi ở 37°C qua đêm. 7. Phương pháp tách chiết DNA plasmid -Nguyên lý: Vi khuẩn được nuôi và nhân lên đến giai đoạn cuối của pha log. Tế bào được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy mạnh. DNA plasmid được thu lại bằng cách kết tủa với isopropanol. - Quy trình: Nuôi một dòng vi khuẩn trong 1,5 ml môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin (100 µg/ml) ở 37°C qua đêm. Lấy 1,5 ml dịch nuôi ly tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút, thu kết tủa. Bổ sung 100 µl sol I trộn đều bằng máy lắc rung cho cặn tan hoàn toàn. Bổ sung 200 µl sol II, đảo nhẹ rồi đặt trong đá 2 phút. Bổ sung 150 µl sol III, đảo nhẹ rồi đặt trong đá 20 phút. Thêm 450 µl chloroform: isoamyl alcohol (24:1), trộn đều và ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf mới. 400 l dịch trong phía trên được bổ sung 320 l isopropanol (theo tỷ lệ 10:8), trộn đều, ủ ở -20C trong 1-3 giờ hoặc ủ ở -80C trong 5 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, đổ dịch thu cặn. Rửa kết tủa 2 lần bằng cồn 70%. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu cặn, phơi khô. Hòa tan DNA bằng 20 µl TE hoặc nước khử ion vô trùng. Plasmid có thể được bảo quản ở -20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 8. Cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn Enzyme cắt giới hạn là các endonuclease nội bào có khả năng nhận dạng một trình tự DNA ngắn rồi cắt cả hai mạch ở vị trí đặc thù trong nội tại đoạn nhận biết hoặc tại vị trí lân cận đoạn nhận biết. Các enzyme này phá vỡ liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch kép mà không gây tổn hại các base. 4 Để kiểm tra dòng plasmid lựa chọn có mang sản phẩm mong muốn hay không, các plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc được cắt bằng các enzyme giới hạn. Các enzyme này được thiết kế ở hai đầu của đoạn gen ngoại lai. Hỗn hợp phản ứng cắt được trộn với tỉ lệ sử dụng theo hướng dẫn của hãng sản xuất. Ủ trong 2-3 giờ ở 37°C, sau đó điện di kiểm tra. 9. tinh sạch phân đoạn DNA - Phân đoạn DNA được tinh sạch bằng kit AccuPrep PCR Purification của hãng Bioneer theo quy trình của nhà sản xuất. - Quy trình: Cắt vùng gel chứa đoạn DNA quan tâm trên bản điện di. Cân đoạn gel vừa cắt được và xác định thể tích đoạn gel này theo quy ước 1mg trọng lượng sẽ tương đương với 1 µl thể tích. Thêm V ml Gel Binding Buffer vào ống eppendorf [với tỉ lệ VBuffer = 3 Vgel]. Ủ hỗn hợp ở 60oC trong 10 phút và cứ 2 phút votex 1 lần cho để hòa tan gel hoàn toàn. Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết DNA và ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Tiếp tục bổ sung đệm rửa 500 µl WB (Washing Buffer), ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm tiếp 13000 v/p trong 1 phút để cột khô hoàn toàn. Chuyển cột sang ống eppendorf mới 1,5 ml. Bổ sung đệm thôi DNA (Elution buffer), để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm 13000 v/p trong 1 phút để thu mẫu DNA. 10. Phương pháp biểu hiện gen đích trong chủng E. coli BL21(DE3) Chủng tái tổ hợp được nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 mg/l (LBA) ở nhiệt độ 37oC, lắc 200 vòng/phút qua đêm. Chuyển 2% dịch tế bào nuôi cấy qua đêm sang môi trường LBA, tiếp tục nuôi lắc điều kiện 37oC, 200 vòng/phút đến khi mật độ tế bào (OD600) đạt khoảng 0,5 đến 0,8. Bổ sung chất cảm ứng IPTG và tiếp tục nuôi lắc 200 vòng/phút ở 28C để cảm ứng tế bào tổng hợp protein ngoại lai. Sau 5 giờ nuôi cấy cảm ứng, tế bào vi khuẩn được thu lại bằng cách ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. Cặn tế bào được hòa lại trong đệm TE (Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM) pH8 sao cho OD600nm = 10. Protein tổng số của chủng tái tổ hợp được kiểm tra trên gel điện di biến tính SDS-PAGE 12%. Sau đó, chúng tôi tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp như: nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng, thời gian cảm ứng để tìm ra các điều kiện tối ưu nhất cho việc sinh tổng hợp protein ngoại lai. Kết quả cho thấy quy trình biểu hiện protein NS1 tối ưu là 0.1 mM IPTG, 37oC, nuôi cấy trong 16 giờ, nuôi lắc 200 vòng/ phút. 11. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose - Nguyên lý: Điện di trên gel agarose là phương pháp được sử dụng để phân tách các phân tử DNA có kích thước khác nhau dưới tác dụng của điện trường. Do phân tử DNA tích điện âm nên khi bị đặt trong 1 điện trường đều thì chúng sẽ dịch chuyển từ cực âm về cực dương của điện trường. Gel agarose có cấu tạo là một hệ thống các sợi polysaccarit nên sẽ cản trở đường đi của DNA. Phân tử DNA có kích thước càng lớn thì di chuyển càng chậm và ngược lại. 5 - Tiến hành: Pha gel agarose 1% gồm 1 g agarose cho vào 100 ml đệm TAE, khuấy đều, ngâm cho agarose nở trong 20 phút rồi đun trong lò vi sóng cho agarose tan hết. Sau đó làm nguội gel xuống khoảng 50oC thì đổ gel vào khuôn và lắp lược. Khi gel nguội thì rút lược và đặt bản gel vào buồng điện di. Đổ dung dịch đệm vào sao cho dung dịch đệm cao hơn mặt bản gel 2-5 mm. Sau đó trộn DNA với loading dye và tra vào các giếng cũng với marker theo các thể tích thích hợp. Sau khi tra mẫu thì cắm điện cực, bắt đầu chạy điện di với điện thế 100 V trong 40 phút. Sau khi kết thúc quá trình điện di, đưa bản gel vào nhuộm trong Ethidium Bromide trong khoảng 5 phút rồi mang đi soi tia UV để xem kết quả. 12. Phương pháp diện di protein trên gel polyacrylamide - Nguyên lý: Gel polyacrylamide được sử dụng để điện di protein theo phương pháp điện di biến tính của Laemmli. Nguyên lý của phương pháp là các phân tử protein trong môi trường có SDS sẽ bị duỗi thẳng và trở nên tích điện âm, do vậy sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng. - Quy trình: Bản gel được đổ hai lớp, lớp dưới là gel tách được đổ cách mặt trên 1,5 cm, để đông 30 phút, cài lược rồi đổ tiếp lớp gel cô ở trên, để 30 phút cho gel đông hoàn toàn và ổn định. Thành phần gel như Bảng PL3. Bảng PL3. Thành phần gel cô và gel tách Thành phần Gel tách 12% (µl) Gel cô 5% (µl) H2O 2450 2100 30% Acrylamid 3000 500 Tris-HCl 1,5M; pH 8,8 1900 0 Tris-HCl 1M; pH 6,8 0 380 10% SDS 75 30 APS 10% 75 30 TEMED 3 3 Tổng 7053 3043 Điện di: bản điện di được lắp vào hệ thống điện di và chạy với 60V, 30 phút cho lớp gel cô và 100 V, 60 phút cho lớp gel tách. Sau điện di, bản gel được tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R-250 trong 1-3 giờ, bản gel được tẩy màu bằng dung dịch tẩy. Các protein dưới dạng monomer tinh sạch xuất hiện một băng duy nhất. 13. Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp - Nguyên lý: Protein tái tổ hợp được tinh sạch bằng hệ thống cột resin gắn nickel chuyên dùng cho các protein tái tổ hợp chứa các gốc histidine. Trong đó, resin là chất mang dạng agarose liên kết chéo, chứa thụ thể iminodiacetic acid và chất này làm cầu nối với Ni2+. Cột resin-nickel có ái lực cao với các protein chứa 6 gốc histidine. Việc gắn kết hình thành thông qua liên kết giữa ion Ni2+ và His trong phân tử protein. Tinh 6 sạch protein được thực hiện dưới các điều kiện biến tính, không biến tính và hỗn hợp. Protein liên kết với resin được thôi bằng đệm pH thấp hoặc bằng muối imidazole. - Quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp dạng tan: Tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp được nuôi trong 100ml môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin và cảm ứng IPTG với nồng độ cuối cùng là 0,1 mM trong khoảng thời gian 16 giờ trên máy lắc 200 v/p ở nhiệt độ 37oC. + Ly tâm 8000 v/p trong 15 phút 400ml dịch khuẩn rồi tiến hành thu cặn. + Thêm 15ml dung dịch đệm gắn (Binding buffer). + Ủ trong đá 15 phút. + Tiến hành siêu âm ở 4oC để phá vỡ thành tế bào với chu kỳ 20 giây/lần, nghỉ 20 giây trong 1 tiếng 30 phút. + Chia nhỏ dung dịch ra các ống Eppendorf 2ml rồi tiến hành ly tâm 12000 v/p trong 10 phút rồi thu dịch. - Phần dịch nổi có chứa protein tái tổ hợp được đưa lên cột Ni-NTA Agarose đã chuẩn bị trước (8 ml dịch nổi). + Đảo cột nhẹ nhàng trong 1 giờ để giữ resin lơ lửng trong dịch nổi protein. + Lắng bằng trọng lực rồi nhẹ nhàng thu dịch nổi chảy qua cột, giữ ở 4oC để chuẩn bị cho kiểm tra SDS-PAGE. + Bổ sung 8 ml Native Wash buffer với thành phần: 50ml dung dịch đệm tinh sạch (Native purification buffer) (250mM NaH2PO4, 2,5M NaCl, pH 8,0), 335μl dung dịch imidazole 3M, pH 6,0, chuẩn pH 8,0, đảo nhẹ rồi lắng resin bằng trọng lực, thu dịch chảy qua cột giữ ở 4oC. Lặp lại bước này 3 đến 4 lần. + Bổ sung 8 -12 ml Native Elution Buffer có thành phần 50mM NaH2PO4 pH 8,0; 500 mM NaCl, 250 mM imidazole, thu các phân đoạn chảy qua cột vào mỗi ống eppendorf 1,5 ml giữ ở 4oC. Kiểm tra sản phẩm tinh sạch protein trên gel polyacrylamide 12%. 14. Phương pháp định lượng protein theo phương pháp bradford - Nguyên lý: Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng thấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dương và hấp thu cực đại ở mức cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein. - Tiến hành: + Chuẩn bị dung dịch BSA ở các nồng độ 0 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,75 mg/ml; 1 mg/ml; 1,5 mg/ml và 2 mg/ml + Lấy 20 µl mỗi nồng độ BSA và 1000 µl dung dịch màu (Reagent Bradford) vào các ống Eppendorf. + Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm, thu kết quả xử lý số liệu và dựng đường chuẩn trên phần mềm Excel. 7 + Lấy 20 µl mẫu protein tinh sạch và 1000 µl dung dịch màu (Reagent Bradford) vào các ống Eppendorf. + Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm, thu kết quả và dựa vào hàm số tương quan giữa nồng độ protein và độ hấp thụ để suy ra hàm lượng protein chứa trong mẫu. 15. Quy trình xét nghiệm miễn dịch ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp để phát hiện kháng thể IGM/IGG kháng lại vi rút dengue - Nguyên lý: Phương pháp xét nghiệm phát hiện kháng thể IgM/ IgG kháng vi rút Dengue dựa trên nguyên lý miễn dịch kháng nguyên kháng thể bằng phương pháp ELISA giá tiếp. Kháng nguyên tái tổ hợp rAg-DENV-1-4 được cố định trên đĩa với nồng độ 20 µg/ml trên một giếng. Xét nghiệm phát hiện kháng thể IgM/ IgG Dengue (nếu có) trong huyết thanh của mẫu thử sẽ kết hợp với kháng thể kháng IgM/ IgG được gắn đuôi enzyme peroxidase Labeled HRP – conjugate được cung cấp từ bộ kit Human Anti-Dengue Virus IgM/IgG ELISA kit (Abcam, UK). Sau quá trình ủ, các giếng được rửa bằng dung dịch đệm PBS 1X, sau đó thêm dung dịch cơ chất không màu (TMB). Cơ chất sẽ được enzyme thủy phân chuyển sang màu xanh và chuyển sang màu vàng trong môi trường axit khi thêm dung dịch dừng phản ứng. Mật độ quang của dung dịch màu vàng tỷ lệ thuận với lượng kháng thể IgM/ IgG kháng lại virus Dengue thu được trên đĩa. - Vật liệu, hóa chất và thiết bị + Thu 2ml máu bệnh nhân, để 20 - 30 phút để hình thành cục máu đông trong nhiệt độ phòng. Sau đó đặt các ống nghiệm vào máy ly tâm, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong khoảng 10 phút. Phần dung dịch màu vàng thu được chính là huyết thanh. Hút phần huyết thanh để riêng ra ống eppendorf 2mL sạch. Nếu xét nghiệm được thực hiện trong vòng 5 ngày kể từ ngày lấy mẫu, mẫu huyết thanh được giữ ở nhiệt độ 2-8°C. Nếu không thì nên chia nhỏ và bảo quản ở nhiệt độ đông lạnh sâu (-20 đến - 80°C). Nếu mẫu được bảo quản đông lạnh, trộn đều các mẫu đã rã đông trước khi xét nghiệm. Tránh đóng băng và tan băng lặp đi lặp lại và không giã đông mẫu bằng nhiệt. + Đĩa elisa 96 giếng (Thermo Fisher Scientific – Mỹ) có gắn kháng nguyên tái tổ hợp rAg-DENV-1-4 (sản phẩm từ đề tài) ở nồng độ 20 µg/ml trên một giếng. Các giếng chưa dùng đến cần được bảo quản với túi hút ẩm ở 2 - 8oC. + Dung dịch cộng hợp kháng kháng thể Dengue virus anti-IgM/IgG HRP Conjugate (từ bộ kit chứa 0.2 % Bronidox L) dùng trực tiếp, bảo quản ở 2-8oC. + Dung dịch rửa PBS Tween 20X (Thermo Fisher Scientific – Mỹ) chai 500 ml với độ đậm đặc 20 lần của đệm muối phosphate. Dung dịch rửa có thể bị kết tủa khi được giữ ở nhiệt độ thấp, có thể làm tan kết tủa khi ủ ở 37oC đến khi tan hết. Pha loãng 1 phần dung dịch rửa và 19 phần nước khử ion để nồng độ cuối cùng đạt 10 mM natri photphat, NaCl 0,15 M và 0.05% Tween 20, pH = 7.5. Dung dịch rửa đã pha loãng dùng được trong 1 tuần nếu bảo quản ở 20 - 25oC. + Dung dịch pha loãng mẫu TBS Tween 20X (Thermo Fisher Scientific – Mỹ) chai 500 mL, dùng trực tiếp. Pha loãng 1 phần dung dịch rửa và 19 phần nước khử ion 8 để nồng độ cuối là đệm muối Tris chứa 25 mM Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20, đảm bảo pH = 7.5, bảo quản ở 2-8oC, sử dụng trong 1 tuần. + Dung dịch cơ chất TMB (từ bộ kit) chai 100 mL dùng trực tiếp. Được khuyên dùng cho xét nghiệm miễn dịch enzyme dựa trên peroxidase. Sau quá trình oxy hóa, TMB tạo thành sản phẩm phản ứng màu xanh lam hòa tan trong nước, có thể đo quang phổ ở bước sóng 605nm. Sau khi axit hóa, sản phẩm phản ứng có màu vàng với đỉnh hấp thụ ở bước sóng 450nm, bảo quản ở 2-8oC. + Đối chứng dương – ống Dengue vi rút IgM/ IgG Positive Control 2mL (từ bộ kit chứa 0.1 % Kathon), bảo quản ở 2oC - 8oC. + Đối chứng âm – 1 chai 200 µl huyết thanh người (từ bộ kit chứa 0.1 % Kathon), bảo quản ở 2oC - 8oC. + Dung dịch dừng phản ứng, ống 15 ml (từ bộ kit) dùng trực tiếp, bảo quản ở 2oC - 8oC. + Các thiết bị và vật liệu cần dùng: máy đọc ELISA, tủ ủ, máy vortex, máy ly tâm, nước khử ion, pipet đa kênh và đơn kênh, đầu tip và ống eppendorf dùng một lần. - Các bước tiến hành thí nghiệm + Bổ sung 150 µL kháng nguyên tái tổ hợp rAg-DENV-1-4 vào các giếng của đĩa 96 giếng, ủ đĩa 37℃ trong 1 giờ. Đổ dịch và loại bỏ các kháng nguyên tái tổ hợp thừa không gắn bản bằng 300 µL/giếng dung dịch rửa PBS Tween 1X. Lặp lại 3 lần rửa. + Khóa màng bằng 300 µL dung dịch BSA 1.5% vào mỗi giếng, ủ đĩa ở 37℃ trong 1 giờ. Rửa đĩa bằng 300 µL/giếng dung dịch rửa PBS Tween 1X. Lặp lại 3 lần rửa. + Thêm 150 µL mẫu huyết thanh vào 150 µL dung dịch pha loãng mẫu TBS Tween 1X tỷ lệ 1:2. Bổ sung 200 µL huyết thanh đã được pha loãng vào các giếng, mỗi mẫu lặp lại 3 lần để đánh giá sai số. Với mỗi đĩa, dành ra 3 giếng đối chứng âm, 3 giếng đối chứng dương, 3 giếng blank (là nước khử ion) được cung cấp từ bộ kit để làm đối chứng. Ủ đĩa ở 37℃ trong 1 giờ. Đổ dịch và loại bỏ các kháng thể thừa bằng 300 µL/giếng dung dịch rửa PBS Tween 1X. Lặp lại 3 lần rửa. + Bổ sung 100 µL dung dịch kháng thể cộng hợp Dengue virus anti-IgM/IgG HRP Conjugate đã được pha loãng theo tỷ lệ 1:5000 với nước khử ion vào mỗi giếng. Ủ đĩa ở 37℃ trong 1 giờ. Rửa đĩa bằng 300 µL/giếng dung dịch rửa PBS Tween 1X. Lặp lại 3 lần rửa. + Bổ sung 100 µL cơ chất TMB vào mỗi giếng, ủ tại nhiệt độ phòng trong 15 phút trong tối. + Dừng phản ứng bằng 100 µL dung dịch dừng phản ứng. + Đọc kết quả OD bằng máy đọc ELISA tại bước sóng 450 nm. - Phân tích kết quả: Theo công thức đã trình bày ở trên giá trị ngưỡng cut-off value được xác định là 0,353. Do đó, có thể xác định các mẫu huyết thanh dương tính kháng thể kháng NS1 của DENV 1-4 nếu giá trị OD 450 từ 0,353 trở lên; nếu không, các mẫu có thể được xác định là âm tính. Phụ lục XII MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRANG THIẾT BỊ ĐƯỢC SỬ DỤNG A B 2 C D A: Máy siêu âm; B: Máy sinh hóa; C: Máy XQ; D: Máy huyết học