Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và đa dạng nguồn gen di truyền của một số loài lá kim ở Tây nguyên, Việt Nam

o Trong mười một hợp chất phân lập từ loài Đỉnh tùng thì có 8 hợp chất là alkaloid 118 trong đó có 6 hợp chất là alkaloid harringtoinia. Đây là các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào mạnh và đã được quan tâm nghiên cứu. Riêng hợp chất Nordeoxyharringtonine (DT4) chưa được nghiên cứu nhiều về hoạt tính gây độc tế bào mới chỉ có báo cáo về hoạt tính ức chế tế bào bạch cầu ở chuột [24]. Vì vậy khi phân lập được hợp chất này từ loài Đỉnh tùng (C. mannii) chúng tôi đã chú ý tới việc tiếp tục nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của chất này đối với các dòng tế bào ung thư khác là tế bào ung thư phổi (Lu), ung thư biểu mô miệng (KB), ung thư vú (MCF7) và ung thư gan (Hep-G2). Kết quả (Bảng 3.24) cho thấy hợp chất DT4 thể hiện hoạt tính mạnh đối với cả 4 dòng tế bào thử nghiệm. Cụ thể là đối với dòng tế bào ung thư KB chất DT4 thể hiện hoạt tính chống tế bào ung thư mạnh gấp 21 lần chất đối chứng, với dòng tế bào ung thư phổi Lu-1 mạnh gấp 91,5 lần, với tế bào ung thư gan HepG2 mạnh gấp 8,9 lần và đặc biệt hoạt tính chống tế bào ung thư vú MCF7 mạnh gấp 107,5 lần ellipticine. Bảng 3.24. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của DT4 với 4 dòng tế bào ung thư STT Kí hiệu mẫu Hoạt tính gây độc tế bào in vitro IC50 (µM) KB Lu-1 HepG2 MCF7 1 DT4 0,06 0,02 0,16 0,02 2 Ellipticine 1,26 1,83 1,42 2,15 Các hợp chất phân lập được từ dịch EtOAc của loài Hoàng đàn giả đã được nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào đối với bốn dòng tế bào ung thư ở người gồm ung thư phổi (LU-1), ung thư gan (HepG2), ung thư vú (MCF7) và ung thư biểu mô miệng (KB). Ellipticine được sử dụng làm chất đối chứng. Bảng 3.25 . Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập từ loài Hoàng đàn giả ST T Kí hiệu mẫu Hoạt tính gây độc tế bào in vitro IC50 (M) KB Lu-1 HepG2 MCF7 1 HĐ1 162,53 ± 9,75 167,03 ± 19,75 224,24 ± 22,03 184,97 ± 17,28 2 HĐ4 185,63 ± 11,47 209,40 ± 15,65 135,50 ± 11,70 147,28 ± 17,56 3 HĐ5 194,02 ± 13 196,60 ± 8,33 199,85 ± 6,70 206,52 ± 16,56 4 HĐ6 > 100* > 100* > 100* > 100* 5 Ellipticine 1,79 ± 0,12 1,50 ± 0,16 1,26 ± 0,16 1,30 ± 0,24 *Các chất không có hoạt tính và không qui đổi ra (M) Kết quả trên cho thấy các hợp chất HĐ1,HĐ4 và HĐ5 thể hiện hoạt tính yếu, trong khi HĐ6 chưa thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của các tế bào ở các nồng độ thử nghiệm. 119 Đây là các kết quả nghiên cứu lần đầu tiên về hoạt tính sinh học của các dịch chiết và các chất sạch phân lập được từ cây Hoàng đàn giả Năm hợp chất phân lập được là KG1, KG4, KG5, KG8 và KG9 đã được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên tám dòng tế bào ung thư ở người với ellipticine là đối chứng dương. Các kết quả được thể hiện trong bảng 3.26. Bảng 3.26. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất KG1, KG4, KG5, KG8 và KG9 Chất Hoạt tính gây độc tế bào in vitro IC50 (M) Hep G2 KB LU-1 MCF7 SK- Mel2 HL60 SW626 SW480 KG8 13,71 8,30 14,51 16,40 15,36 7,42 16,84 13,85 KG4 289,34 305,79 264,27 262,35 302,55 276,19 314,47 288,47 KG9 >100* >100* >100* >100* >100* >100* >100* >100* KG5 130,82 149,34 114,59 107,37 148,04 107,88 126,2 107,85 KG1 >100* >100* >100* >100* >100* >100* >100* >100* Ellipticine 1,67 1,87 1,38 1,54 1,79 1,75 1,59 1,67 *Các chất có giá trị IC50 > 100 μg/mL được xem như không có hoạt tính và không qui đổi ra (M) Kết quả cho thấy hợp chất KG8 có hoạt tính mạnh nhất với tất cả các dòng tế bào thử nghiệm với các giá trị IC50 dao động từ 7,42-16,84 M. Điều thú vị là hoạt tính của chất KG8 đối với các dòng tế bào HL60 (IC50 7,42 M); KB (IC50 8,3μM) và Hep-G2 (IC50 13,71M) là khá cao và cần được tiếp tục nghiên cứu. Chất KG5 được đánh giá có hoạt tính gây độc tế bào yếu trên cả 8 dòng tế bào ung thư là Hep-G2 (ung thư gan), KB (ung thư miệng), LU-1 (ung thư phổi), MCF7 (ung thư vú), SK-MeI2 (ung thư sắc tố), HL-60 (ung thư máu cấp), SW626 (ung thư buồng trứng), SW480 (ung thư ruột kết). Tuy nhiên chất KG4, KG9 và KG1 tỏ ra không có hoạt tính trên các dòng tế bào ung thư đã thử nghiệm. Đây là công bố đầu tiên về hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ loài Kim giao núi đất.  Nhận xét về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 3 loài lá kim Thành phần hóa học chính của loài Đỉnh tùng (C. mannii) thu hái tại Tây Nguyên, Việt Nam chủ yếu là các hợp chất alkaloid (8 /11 chất phân lập) trong đó đa phần là các alkaloid có kiểu khung cephalotaxine (6 / 8 hợp chất) và số ít có khung 120 homoerythrina (2 / 8 hợp chất). Các hợp chất alkaloid được tìm thấy ở bộ phận vỏ thân của loài Đỉnh tùng nhiều hơn ở bộ phận lá và cành. Lớp chất này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý như hoạt tính chống oxi hóa, kháng khuẩn, nấm và đặc biệt là hoạt tính gây độc tế bào. Hợp chất DT4 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn cả chất đối chứng đối với 4 dòng tế bào ung thư HepG-2, KB, LH-60 và MCF-7 với giá trị IC50 0,02-0,16 μM. So sánh với các tài liệu tham khảo trong phần tổng quan cho thấy thành phần hóa học của loài Đỉnh Tùng ở Tây Nguyên, Việt Nam tương tự các loài khác trong chi Cephalotaxus. Tuy nhiên việc nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất alkaloid và không là alkaloid cùng với việc thử hoạt tính gây độc tế bào đối với các hợp chất alkaloid trong loài Đỉnh tùng (C. mannii) là chưa nhiều. Vì vậy những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài này là cần thiết nhằm khẳng định thêm giá trị khoa học và kinh tế của các loài trong chi Cephalotaxus. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học từ bộ phận gỗ thân và cành của loài Hoàng đàn giả (D. elatum) cho thấy sự tồn tại của các lớp chất diterpenoid (2 / 6 hợp chất) và steroitd khung ecdysteroid 3 / 6 hợp chất. Các dịch chiết tổng cũng như các chất sạch phân lập từ loài Hoàng đàn giả đã được nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào với 4 dòng tế bào ung thư thông thường là HepG-2, KB, LH-60 và MCF-7 kết quả cho thấy các chất sạch cho hoạt tính yếu đến trung bình với các dòng tế bào thử nghiệm và dịch chiết HĐE thể hiện hoạt tính trung bình đối với 4 dòng tế bào thử nghiệm nêu trên. Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Kim giao núi đất (N. wallichiana) được nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập cho thấy loài Kim giao núi đất chứa các lớp chất như biflavonoid (3 / 11 hợp chất), diterpenoid (5 / 11 hợp chất) và steroid (3 / 11). Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất được phân lập với 8 dòng tế bào ung thư cho thấy hợp chất KG8 có hoạt tính mạnh nhất với tất cả các dòng tế bào thử nghiệm với các giá trị IC50 dao động từ 7,42-16,84 M. Kết quả cho thấy loài Kim giao núi đất (N. wallichiana) nói riêng và các loài khác trong chi Nageia cần được quan tâm khai thác. 121 Bảng 3.27. Tổng kết các hợp chất phân lập được từ 3 loài lá kim nghiên cứu 1. Loài Đỉnh tùng ( C. mannii ) STT Kí hiệu/ Tên chất Cấu trúc Chú thích Các hợp chất alkaloid 1 DT1 Cephalotaxine Lần đầu tiên được phân lập từ loài 2 DT2 Cephalotaxine β-N-oxide N O O OMe HO H O H + - 1 2 3 4 5 6 7 89 101112 13 14 15 16 17 18 19 Lần đầu tiên được phân lập từ loài 3 DT3 Desoxy harringtonine Lần đầu tiên được phân lập từ loài 4 DT4 Nordeoxy harringtonine Lần đầu tiên được phân lập từ loài 5 DT5.1 Isoharringtonine Lần đầu tiên được phân lập từ loài 6 DT5.2 Norisoharring tonine Chất mới 122 7 DT6 3-Epischellham mericin Lần đầu tiên được phân lập từ loài 8 DT7 Manniicine Lần đầu tiên được phân lập từ loài Các hợp chất khác 9 DT8 Harringtonolide Có hoạt tính gây độc tế bào mạnh với 4 dòng tế bào ung thư 10 DT9 Epicatechin 11 DT10 Epigallocatechin 2. Loài Hoàng đàn giả (D. elatum) Các hợp chất diterpenoid 12 HĐ1 Lambertic acid - Có hoạt tính mạnh với 4 dòng tế bào ung thư. - Lần đầu tiên được phân lập từ loài 123 13 HĐ2 Dacrydianon OH H H OH O 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617 1819 20 1 A B C Chất mới Các hợp chất steroid 14 HĐ3 Daucosterol Lần đầu tiên được phân lập từ loài 15 HĐ4 Ponasterone A Lần đầu tiên được phân lập từ loài 16 HĐ5 20-hydroxyecdy sone Lần đầu tiên được phân lập từ loài 17 HĐ6 Ajugasterone C Lần đầu tiên được phân lập từ loài 3. Loài Kim giao núi đất (N. wallichiana) Các hợp chất biflavonoid 18 KG1 Amentoflavone Lần đầu tiên được phân lập từ chi và loài 124 19 KG2 4”’-O- methylamentoflavone Lần đầu tiên được phân lập từ chi và loài 20 KG3 4’,4’’’,7’’- trimethoxyamentoflavone Lần đầu tiên được phân lập từ chi và loài Các hợp chất diterpenoid 21 KG4 3β-hydroxytotarol OH 1 3 4 5 7 9 12 13 14 16 17 18 20 H3C 2 10 HO 19 6 8 Lần đầu tiên được phân lập từ chi và loài 22 KG5 Totarol-19-cacboxylic acid Lần đầu tiên được phân lập từ chi và loài 23 KG6 Ferruginol Lần đầu tiên được phân lập từ chi và loài 24 KG7 Sugiol Lần đầu tiên được phân lập từ chi và loài 25 KG8 Nagilacton B Có hoạt tính mạnh với 8 dòng tế bào ung thư Các hợp chất khác 125 26 KG9 5-hydroxy stigmastane-6-one-3β- hexadecanoat C15H31 O O 1 3 5 6 8 19 17 10 24 25 26 27 18 20 1' HO 29 28 O Lần đầu tiên được phân lập từ chi và loài 27 KG10 2-(4-hydroxyphenyl)- propan-1,3-điol HO OH OH 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1 2 3 Lần đầu tiên được phân lập từ chi và loài 28 KG11 β-Sitosterol Lần đầu tiên được phân lập từ chi và loài 3.2. Đa dạng di truyền nguồn gen của ba loài lá kim nghiên cứu Qua kết quả nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 3 loài lá kim là Đỉnh tùng (C. mannii), Hoàng đàn giả (D. elatum) và Kim giao núi đất (N. wallichiana) chúng tôi nhận thấy sự có mặt của các lớp chất alkaloid, diterpenoid, steroid, flavonoid, đây là các lớp chất có hoạt tính sinh học đa dạng. Trong 28 chất sạch thu được có 2 chất có cấu trúc mới là HĐ2 (Dacrydiaon) và DTV5.2 (norisoharringtonine), 2 chất có hoạt tính gây độc tế bào mạnh đáng chú ý là DT4 (nordeoxyharringtonine) và KG8 (Nagilacton B). Có thể khẳng định đây là các loài có giá trị của khu vực Tây nguyên cần có biện pháp bảo tồn, phát triển và khai thác hợp lí các cây tái sinh trong khu vực lân cận đối với cây lấy mẫu phân tích hóa học nhằm duy trì những lớp chất thứ cấp quan trọng trong loài. Mặt khác quần thể cây Đỉnh tùng, Hoàng đàn giả và Kim giao núi đất ở Tây Nguyên đều là những cây tái sinh từ hạt, sống trong cùng môi trường địa lý, địa chất như nhau, nên cho phép khẳng định rằng các lớp chất hóa học sẽ được bảo toàn nguyên trong các cá thể khác cùng loài ở Tây Nguyên. Với ý nghĩa đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu tính đa dạng nguồn gen di truyền của loài Đỉnh tùng, Hoàng đàn giả và Kim giao núi đất sử dụng chỉ thị ISSR và 126 SSR để có những đánh giá khoa học về sức sống của các quần thể phục vụ công tác bảo tồn, khai thác và phát triển loài đạt hiệu quả cao. 3.2.1. Đa dạng di truyền Tổng số 79 chỉ thị (44 chỉ thị ISSR và 35 chỉ thị SSR) đã được sử dụng để đánh giá tính đa dạng di truyền cho 3 loài lá kim ở Tây Nguyên là Đỉnh tùng, Hoàng đàn giả và Kim giao núi đất. Trong đó, số lượng chỉ thị dùng để phân tích cho loài Kim giao núi đất là cao nhất (48 chỉ thị), thứ hai là loài Hoàng đàn giả (47 chỉ thị) và thấp nhất là loài Đỉnh tùng (37 chỉ thị). Bảng 3.28. Một số thông số di truyền của 3 loài lá kim phân tích tổ hợp với hai chỉ thị ISSR và SSR Loài N Na Ne I He h PPB (%) *Fis Đỉnh tùng (C. mannii) 34 1,656 1,470 0,382 0,262 0,218 65,65 - 0,148 Hoàng đàn giả (D. elatum) 70 1,685 1,351 0,318 0,209 0,192 68,54 -0,002 Kim giao núi đất (N.wallichiana) 70 1,748 1,570 0,445 0,309 0,262 74,79 0,333 Ghi chú: Na: số alen quan sát trung bình trên một locus; Ne: số alen hiệu quả trên một locus; I: chỉ số đa dạng di truyền theo Shannon; He: hệ số gen di hợp tử mong đợi; h: chỉ số đa dạng di truyền theo Nei; PPB: phần trăm phân đoạn đa hình; *Fis: hệ số giao phấn cận noãn với p < 0,05 (số liệu chỉ xác định cho chỉ thị SSR). Kết quả phân tích các thông số di truyền của 3 loài lá kim đã chỉ ra loài Kim giao núi đất có tính đa dạng di truyền cao nhất (Na = 1,748; Ne = 1,570; I = 0,445; He = 0,309; h = 0,262 và PPB = 74,79%); thứ hai là loài Đỉnh tùng (Na = 1,656; Ne = 1,470; I = 0,382; He = 0,262; h = 0,218 và PPB = 65,65%) và thấp nhất là Hoàng đàn giả (Na = 1,685; Ne = 1,351; I = 0,318; He = 0,209; h = 0,192 và PPB = 68,54%) (Bảng 3.28). 3.2.2. Cây phát sinh chủng loại của 3 loài lá kim Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của từng loài nghiên cứu khi phân tích tổ hợp hai chỉ thị ISSR và SSR cho thấy các mẫu trong cùng loài đã không giống nhau hoàn toàn về mặt di truyền (cụ thể: mỗi mẫu của mỗi loài đều nằm ở một vị trí độc lập trên biểu đồ hình cây) và có hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng từ 70,7% (Cpm12 và Cpm25) đến 90,3% (Cpm4 và Cpm5) đối với loài Đỉnh tùng (Hình 3.46); từ 76% (De3 và De27) đến 96,6% (De12 và De13) đối với loài 127 Hoàng đàn giả (Hình 3.47); và 3,2% (Nw19 và Nw29) đến 97,9% (Nw23 và Nw24) đối với loài Kim giao núi đất (Hình 3.48). Trong đó các mẫu trong cùng một vùng địa lý đều nằm trong cùng một nhánh, chẳng hạn như 34 mẫu ở loài Đỉnh tùng ở hình 3.46 phân làm hai nhánh chính, nhánh I gồm 5 mẫu thu ở Hiệp An (kí hiệu a) và nhánh II gồm 29 mẫu thu ở Tà Nung (kí hiệu b). Kết quả phân nhánh tương tự cũng xảy ra ở cả loài Hoàng đàn giả (hình 3.47) và Kim giao núi đất (hình 3.48). b a Hình 3.46. Biểu đồ hình cây tính theo phương pháp của Jacccard và kiểu phân nhóm UPGMA thể hiện mối quan hệ di truyền của 34 mẫu Đỉnh tùng phân tích với chỉ thị ISSR và SSR (Ghi chú: a: mẫu ở Hiệp An, b: mẫu ở Tà Nung). 128 Hình 3.47. Biểu đồ hình cây tính theo phương pháp của Jacccard và kiểu phân nhóm UPGMA thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Hoàng đàn giả phân tích với chỉ thị ISSR và SSR (Ghi chú: a: mẫu ở Sơn Lang, A Yun và Kon Chư Răng (Gia Lai); b: mẫu ở Hòa Sơn (Đắk Lắk); c: mẫu ở Đa Chais (Lâm Đồng); d: mẫu ở Xã Hiếu (Kon Tum). I II a b c d I.1 I.2 II.2 II.1 129 Hình 3.48. Biểu đồ hình cây tính theo phương pháp của Jacccard và kiểu phân nhóm UPGMA thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Kim giao núi đất với chỉ thị ISSR và SSR (Ghi chú: a: mẫu thu ở A Yun, b: mẫu thu ở Hòa Sơn, c: mẫu thu ở Đa Chais, d: mẫu thu ở Tà Nung, e: mẫu thu ở Xã Hiếu. I II a b c d e I.1 I.2 130  Đánh giá sức sống của 3 quần thể chứa các loài lá kim nghiên cứu Đa dạng di truyền không chỉ là cơ sở để tạo ra những giống, loài mới mà còn là cơ sở cho công tác bảo tồn, khai thác và phát triển loài trong tương lai. Dựa vào các thông số di truyền của quần thể mà các nhà nghiên cứu có thể đánh giá sức sống của quần thể đó. Các thông số thường được quan tâm là số alen quan sát trên locus (Na – number of alleles per locus), hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He - expected heterozygosity), phần trăm phân đoạn đa hình (PPB), chỉ số đa dạng di truyền Shannon (I), mức độ di nhập gen (Nm - gene flow), hệ số giao phấn cận noãn (Fis),.. Trong đó alen dị hợp tử là một trong những thông số được quan tâm nhiều hơn cả vì qua đó người ta có thể xác định được cấu trúc và thậm chí cả lịch sử của quần thể. Giá trị He cao đồng nghĩa với quần thể đó có mức độ đa dạng di truyền cao và ngược lại. Theo nguyên tắc này nếu các dị hợp tử quan sát được thấp hơn so với mong đợi thì rất có thể đã xảy ra hiện tượng giao phấn cận noãn. Nếu dị hợp tử quan sát cao hơn mong đợi, có thể đã xảy ra những hiện tượng làm phá vỡ cấu trúc trước kia của quần thể như sự pha trộn của hai quần thể bị cô lập trước đó. Bên cạnh đó chỉ số đa dạng di truyền theo Shannon (I), Nei (h), hay phần trăm phân đoạn đa hình (PPB),cũng là những thông số phản ánh sức khỏe của quần thể đó. Trong nghiên cứu này cho thấy tính đa dạng di truyền của cả ba loài Đỉnh tùng, Hoàng đàn giả và Kim giao núi đất đều có tính đa dạng di truyền tương đối khá, trong đó loài Kim giao núi đất có tính đa dạng di truyền cao nhất (Na = 1,748; Ne = 1,570; I = 0,445; He = 0,309; h = 0,262 và PPB = 74,79%) và thấp nhất là Hoàng đàn giả (Na = 1,685; Ne = 1,351; I = 0,318; He = 0,209; h = 0,192 và PPB = 68,54%) (Bảng 3.28). Theo kết quả điều tra thực địa của nhóm nghiên cứu đề tài Tây Nguyên mã số TN15 [130] cho thấy cả 2 quần thể Đỉnh tùng ở Lâm Đồng (Tà Nung và Hiệp An) đều quá nhỏ về kích thước trong các mảnh rừng bị suy giảm, không quá 20 cá thể/quần thể. Kết quả điều tra thực địa tính đến tháng 12/2013 đã cho thấy, trong số 34 cá thể cây Đỉnh tùng ở Lâm Đồng thì chỉ còn có 5 cây trưởng thành (1 cây cao 35 mét, 03 cây cao 20 mét và 02 cây cao 15 mét), còn lại là các cây tái sinh có chiều cao từ 50 cm đến 2 mét). Kết quả khảo sát thực tế về khả năng tạo hạt, nảy mầm và 131 phát triển tại hai quần thể Tà Nung và Hiệp An ở Lâm Đồng cũng chỉ ra tỷ lệ tạo hạt và tái sinh cây mạ rất cao, nhưng chỉ có một tỷ lệ rất thấp (19,4%) (số liệu không chỉ ra ở đây) trong số đó phát triển thành cây có chiều cao 1 m. Lý do mà cây mạ không phát triển thành cây là do rễ cây mạ không nhận được dinh dưỡng bởi các lớp hổng của các tầng mùn tự nhiên hình thành. Việc mất môi trường sống cũng là nguy cơ giảm quy mô quần thể. Vì vậy, mặc dù có tính đa dạng di truyền tương đối khá xong lại có nguy cơ đe dọa tuyệt chủng (thuộc khung EN). Mặt khác quần thể của 3 cây lá kim ở Tây Nguyên đều là những cây tái sinh từ hạt, sống trong cùng môi trường địa lý, địa chất như nhau, nên cho phép khẳng định rằng các lớp chất hóa học, đặc biệt là các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như DT4, KG8 sẽ được bảo toàn trong các cá thể của loài. Từ những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và tính đa dạng di truyền nguồn gen chúng tôi có đề xuất với các nhà nghiên cứu và các cơ quan chức năng cần có chiến lược bảo tồn, phát triển và khai thác nguồn nguyên liệu là các loài cây lá kim có giá trị ở khu vực Tây Nguyên. 132 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Thành phần hóa học của 3 loài lá kim nghiên cứu  Từ loài Đỉnh tùng (C. mannii) Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 11 hợp chất từ các bộ phận lá, cành và vỏ loài Đỉnh tùng (C. mannii), bao gồm 8 hợp chất alkaloid có khung cephalotaxine (6/8) và khung homoerythrina (2/8) đặc trưng cho chi Cephalotaxus, 2 hợp chất flavonoid và 1 hợp chất norditerpenlactone. Trong đó có một alkaloid mới là norisoharringtonine (DTV5.2). Đây là lần đầu tiên các hợp chất này được phân lập từ loài Đỉnh tùng (C. mannii). Đã bổ sung một số dữ liệu phổ 13C NMR chưa có trong tài liệu của hai alkaloid là 3-Epischellhammericine (DT6) và isomer của nó được đặt tên là Manniicine (DT7).  Từ loài Hoàng đàn giả (D. elatum) Lần đầu tiên 6 hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc từ vỏ thân và cành của loài Hoàng đàn giả (D. elatum) gồm 2 hợp chất diterpenoid, 3 hợp chất thuộc nhóm ecdysteroid và 1 phytosteroid glucosid (daucosterol). Trong đó có một diterpene mới đặt tên là dacrydianone (HĐ2).  Từ loài Kim giao núi đất (N. wallichinana) Lần đầu tiên từ lá và cành của loài Kim giao núi đất (N. wallichiana) đã phân lập và xác định cấu trúc của 11 hợp chất bao gồm 3 hợp chất biflavonoid, 5 hợp chất diterpenoid, 2 hợp chất thuộc nhóm phytosterol, 1 hợp chất phenolic. Đã bổ sung một số dữ liệu phổ 13C NMR chưa có trong tài liệu của các chất là 3β-hydroxytotarol (KG4), Totarol-19-carboxylic acid (KG5), Ferruginol (KG6). 2. Hoạt tính sinh học của 3 loài lá kim Năm dịch chiết thô và 11 chất sạch chọn lọc đã được thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa và hoạt tính gây độc tế bào. Kết quả cho thấy + Hoạt tính kháng oxy hóa: Các dịch chiết và chất sạch hầu như không thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa. + Hoạt tính gây độc tế bào: Alkaloid nor-deoxyharringtonine (DT4) thể hiện 133 hoạt tính ức chế tế bào ung thư rất mạnh đối với cả 4 dòng tế bào thử nghiệm là KB, HepG2, MCF7 và Lu-1 với giá trị IC50 từ 0,02-0,16 μM. Hợp chất Nagilacton B (KG8) thể hiện hoạt tính ức chế mạnh với cả 8 dòng tế bào thử nghiệm với các giá trị IC50 từ 7,42-16,84 μM. Điều thú vị là hoạt tính của chất KG8 đối với các dòng tế bào HL60 (IC50 7,42 M); KB (IC50 8,3μM) và HepG2 (IC50 13,71M) là khá cao nên cần được tiếp tục nghiên cứu. Các hợp chất khác thể hiện hoạt tính yếu. 3. Tính đa dạng nguồn gen di truyền của 3 loài lá kim nghiên cứu Kết quả phân tích các thông số di truyền đã chỉ ra loài Kim giao núi đất có tính đa dạng di truyền cao nhất (Na = 1,748; Ne = 1,570; I = 0,445; He = 0,309; h = 0,262 và PPB = 74,79%); thứ hai là loài Đỉnh tùng (Na = 1,656; Ne = 1,470; I = 0,382; He = 0,262; h = 0,218 và PPB = 65,65%) và thấp nhất là Hoàng đàn giả (Na = 1,685; Ne = 1,351; I = 0,318; He = 0,209; h = 0,192 và PPB = 68,54%). Hai loài Đỉnh tùng và Hoàng đàn giả đều có hiện tượng trao đổi chéo cao (giá trị Fis< 0). Quần thể của cả loài cây này đều là những cây tái sinh từ hạt, sống trong cùng môi trường địa lý, địa chất như nhau, nên cho phép khẳn định sự bảo tồn được các lớp chất hóa học quí trong mỗi loài. Đây là những cơ sở khoa học cho việc bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen loài lá kim này ở Tây Nguyên. KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học từ các bộ phận khác của 3 loài nghiên cứu như rễ, gỗ thânđể có những đánh giá toàn diện hơn về 3 loài này. 2. Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học một số hợp chất có hoạt tính từ 3 loài nghiên cứu, tìm ra mối tương quan giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học. 3. Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và tính đa dạng di truyền nguồn gen chúng tôi có đề xuất với các nhà nghiên cứu và các cơ quan chức năng cần có chiến lược bảo tồn, phát triển và khai thác nguồn nguyên liệu từ ba loài Đỉnh tùng, Hoàng đàn giả và Kim giao núi đất ở khu vực Tây Nguyên để 134 một ngày không xa Việt Nam có thể phát triển một số loài thuốc có giá trị trong y học. 135 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Lần đầu tiên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Kim giao núi đất (N. wallichiana) được nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới.  Mười một hợp chất được phân lập từ loài này, 5/11 hợp chất đã được thử hoạt tính gây độc tế bào.  Đã tìm được hợp chất Nagilacton B (KG8) có hoạt tính mạnh đối với 8 dòng tế bào ung thư thử nghiệm, giá trị IC50 dao động từ 7,42- 16,84 μM.  Đây là kết quả nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học đầu tiên được báo cáo từ chi Nageia. 2. Lần đầu tiên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Đỉnh tùng (C. mannii) được nghiên cứu ở Việt Nam.  Mười một hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc từ loài này trong đó có một chất có cấu trúc mới là norisoharringtonine (DT.5.2).  Hợp chất nordeoxyharringtonine (DT4) thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư mạnh gấp nhiều lần chất đối chứng trên cả 4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm (KB, HepG2, MCF7, Lu-1) với giá trị IC50 từ 0,02-0,16 μM. 3. Sáu hợp chất lần đầu tiên được phân lập và xác định cấu trúc từ loài Hoàng đàn giả (D. elatum), trong đó một chất có cấu trúc mới là Dacrydianon (HĐ2). 4/6 hợp chất sạch được nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào. 4. Lần đầu tiên ở Việt Nam 3 loài lá kim Đỉnh tùng (C. mannii), Hoàng đàn giả (D. elatum) và Kim giao núi đất (N. wallichiana) được nghiên cứu tính đa dạng nguồn gen di truyền bằng 2 chỉ thị ISSR và SSR nhằm phục vụ công tác bảo tồn và phát triển bền vững các loài lá kim ở Tây Nguyên, Việt Nam. 136 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Tran Van Loc, Nguyen Thi Lieu, Tran Thi Phuong Thao, Nguyen Thi Luu, Ho Ngoc Anh, Le Thi Thu Ha, Tran Van Chien, Pham Thi Ninh, Dinh Thi Phòng, Tran Van Sung, The Alkaloidal constituents of Cephalotaxus mannii collected in LAM DONG province, Viet Nam, Chemistry of nature compound, 2017, 53 (6), 1122-1126. 2. Nguyen Thi Lieu, Tran Van Loc, Tran Thi Phuong Thao, Nguyen Thi Luu, Ho Ngoc Anh, Le Thi Thu Ha, Tran Van Chien, Pham Thi Ninh, Dinh Thi Phòng, Tran Van Sung, The non-Alkaloidal constituents of Cephalotaxus mannii, collected in LAM DONG province, Vietnam, Journal of Chemistry, 2016, 54 (2 ), 210-213. 3. Nguyễn Thị Liễu, Phạm Thị Ninh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Trịnh Thị Thủy, Nguyễn Thị Lưu, Trần Văn Lộc, Đinh Thị Phòng, Trần Thị Phương Thảo, Trần Văn Sung, Thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài Kim giao núi đất ( Nageia wallichiana ) thu hái tại tỉnh Lâm Đồng, phần 1. Các hợp chất diterpnoid, Tạp chí Hóa học, 2016, 54 (1), 88-92. 4. Nguyễn Thị Liễu, Phạm Thị Ninh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Nguyễn Thị Lưu, Trần Văn Lộc, Đinh Thị Phòng, Trần Thị Phương Thảo, Trần Văn Chiến, Trần Văn Sung, Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Kim giao núi đất thu hái tại tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam, phần 2. Các hợp chất biflavonoid, steroid và phenolic, Tạp chí Hóa học, 2016, 54 (3), 391-395. 5. Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Liễu, Vũ Thị Thu Hiền, Trần Thị Liễu, Trần Thị Việt Thanh, Nguyễn Quốc Bình, Vũ Đình Duy, Nguyễn Tiến Hiệp, Phạm Hữu Nhân, Đánh giá đa dạng di truyền quần thể tự nhiên loài Kim giao núi đất (Nageia wallichiana (C. Presl) Kuntze) ở Tây Nguyên bằng chỉ thị ISSR, tạp chí công nghệ Sinh học, 2015, 13 (1), 131-141. 6. Trần Thị Liễu, Vũ Thị Thu Hiền, Nguyễn Thị Liễu, Đinh Thị Phòng, So sánh hiệu quả của chỉ thị ISSR và SSR trong đánh giá đa dạng di truyền quần thể Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) tự nhiên ở Tây Nguyên, Việt Nam, tạp chí 137 Công nghệ sinh học, 2017, 15(2), 293-305. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Vidacovic M., Conifer, Morphology and Variation, Graficki Zavod Hrvatske, 1991, Croatia, 755. 2. http: //conifer.org / gymnospers.php 3. Nguyễn Tiến Hiệp, Phan Kế Lộc, Nguyễn Đức Tố Lưu, Philip Ian Thomas, Aljos Farjon, Leonid Averyanov, Jacinto Regalado, Thông Việt Nam: Nghiên cứu hiện trạng bảo tồn, 2004. Fauna &; Flora International, Chương trình Việt Nam, 2005, Hà Nội. 4. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Các loài cây lá kim ở Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, 2004, Hà Nội. 5. K. E. Tripp, Cephalotaxus The Plum Yew, Arnoldia, 1995, 55, 25–39. 6. L. Fu, N. Li and R. R. Mill, Cephalotaxaceae . In: Wu Z, Raven PH, Hong D (eds), Flora of China, 1999, 4, 85–88. 7. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, quyển 1, NXB Trẻ, 2003. 8. Bộ Khoa học và Công nghệ & Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam, Sách đỏ Việt Nam. Phần 2- Thực vật, NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ, 2007, 512, Hà Nội. 9. 10. 11. L. Ni, X-H. Zhong, J. Cai, M-F. Bao, B-J. Zhang, J. Wu, X-H. Cai, Five New Alkaloids from Cephalotaxus lanceolata and C. fortunei var. alpine, Nat. Prod. Bioprospect., 2016, 6, 149–154. 12. (a) W. W. Paudler, G. I. Kerley and J. McKay, J. Org. Chem. , 1963, 28, 2194–2197; (b) Additional works: W. W. Paudler and J. McKay, J. Org. Chem. , 1973, 38, 2110–2112. 13. R. G. Powell, D. Weisleder, C. R. Smith, Jr. and I. A. Wolff, Structure of cephalotaxine and related alkaloids, Tetrahedron Lett. , 1969, 46, 4081–4084. 14. S. Ma, X. Shi, H. Yan, Z. Ma , X. Zhang, Antiphytoviral activity of alkaloids from 138 Cephalotaxus sinensis, Industrial Crops and Products, 2016, 94, 658–664. 15. H. Morita, M. Yoshinaga and J. Kobayashi, Cephalezomines G, H, J, K, L, and M, new alkaloids from Cephalotaxus harringtonia var. nana, Tetrahedron, 2002, 58, 5489-5495. 16. W. W. Paulder, J. McKay, Structures of some of the minor alkaloids of Cephalotaxus fortune, J. Org. Chem., 1973, 38 (11), 2110-2112. 17. M. Bocar, A. Jossang and B. Bodo, New Alkaloids from Cephalotaxus fortune, J. Nat. Prod. , 2003, 66(1), 152–154. 18. Y-R He, Y-H Shen, B. Li, L. Lu, J-M Tian, W-D Zhang, Alkaloids from Cephalotaxus lanceolata and Their Cytotoxicities, Chem. Biodiv, 2013, 10, 584-595. 19. I. Takano, I. Yasuda, M. Nishuma, Y. Hitotsuyanagi, K. Takeya and H. Ttokawa, Alkaloids from Cephalotaxus harringtonia, Phytochemistry, 1996, 43(1), 299-303. 20. H. Morita, M. Arisaka, N. Yoshida and J. Kobayashi, Cephalezomines A-F, Potent Cytotoxic Alkaloids from Cephalotaxus harringtonia var. nana, Tetrahedron, 2000, 56, 2929–2934. 21. I. Takano, I. Yasuda, M. Nishijima, Y. Hitotsuyanagi, K. Takeya and H. Itokawa, New Cephalotaxus Alkaloids from Cephalotaxus harringtonia var. drupacea, J. Nat. Prod. , 1996, 59(10), 965–967. 22. I. Takano, I. Yasuda, M. Nishijima, Y. Hitotsuyanagi, K. Takeya and H. Itokawa, Ester-type Cephalotaxus Alkaloids from Cephalotaxus harringtonia var. drupacea, Phytochemistry , 1997, 44(4), 735-738. 23. I. Takano, I. Yasuda and M. Nishijima, New oxygenated Cephalotaxus Alkaloids from Cephalotaxus harringtonia var. drupacea, J. Nat. Prod. , 1996, 59(12), 1192–1195. 24. M. Yoshinaga, H. Morita, T. Dota and J. Kobayashi, Bis-Cephalezomin A-E from Cephalotaxus harringtonia var. nana, Tetrahedron, 2004, 60, 7861–7868. 25. R. G. Powell, Structures of homoerythrina alkaloids from Cephalotaxus harringtonia, Phytochemistry, 1972, 11, 1467-1472. 26. L.-W. Wang, H.-J. Su, S.-Z. Yang, S.-J. Won and C.-N. Lin, New Alkaloids 139 and a Tetraflavonoid from Cephalotaxus wilsoniana, J. Nat. Prod. , 2004, 67, 1182–1185 27. R. G. Powell, K. L. Mikolajczak, D. Weisleder, and C. R. Smith, Jr., Akaloids of Cephalotaxus wilsoniana, Phytochemistry, 1972, 11 (11), 3317. 28. Anonymous, Stadies on the antitumor constituents of Cefalotaxus hainanensisi, Acra Chim. Sin., 1976, 34(4), 283-292 . 29. Y-M. Zhang, R. Zhan, Y-G. Chen, Z-X. Huang, Two new flavones from the twigs and leaves of Cephalotaxus lanceolata, Phytochemistry Letters, 2014, 9, 82–85. 30. K. Bae, W. Y. Jin, P. T. Thuong, B. S. Min, M. K. Na ,Y. M. Lee, S. S. Kang, A new flavonoid glycoside from the leaf of Cephalotaxus koreana, Fitoterapia, 2007, 78, 409 – 413. 31. Y-H. Kuo, S-Y. Hwang, L-M. Y. Kuo, Y-L. Lee, S-Y. Li and Y-C. Shen, A Novel Cytotoxic C-Methylated Biflavone, Taiwanhomoflavone-B from the Twigs of Cephalotaxus wilsoniana, Chem. Pharm. Bull, 2002, 50(12), 1607—1608. 32. M. K. Lee, S. W. Lim, H. Yang, S. H. Sung, H-S. LeeM. J. Park and Y.C. Kim, Osteoblast differentiation stimulating activity of bioflavonoids from Cephalotaxus koreana, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2006, 16, 2850–2854. 33. M. Politi, N. De Tommasi, I. Morelli, A. Manunta, L. Battinelli and G. Mazzanti, Antimicrobial Diterpenes from the Seeds of Cephalotaxus harringtonia var. drupacea, Planta Med., 2003, 69, 468–470. 34. X.-H. Xu, W. Zhang, X.-P. Cao and S. Xue, Abietane diterpenoids synthesized by suspension-cultured cells of Cephalotaxus fortune, Phytochem. Lett., 2011, 4, 52–55. 35. J. G. Buta, J. L. Flippen and W. R. Lusby, Harringtonolide, a plant growth inhibitory tropone from Cephalotaxus harringtonia (Forbes) K. Koch, J. Org. Chem., 1978, 43 (5), 1002–1003 36. Z. Xue, N. J. Sun and X. T. Liang, Acta Pharm. Sinica, 1982, 17, 236–237. 37. K. D. Yoon, D. G. Jeong, Y. H. Hwang, J. M. Ryu and J. Kim, Inhibitors of 140 Osteoclast differentiation from Cephalotaxus koreana, J.Nat. Prod., 2007, 70 (12), 2029–2032. 38. R.G. Powell, R. W. Miller, and C. R. Smith, Jr., Cephalomannine; a new antitumor alkaloid from Caphalotaxus mannii, The Journal of the Chemistry Society, 1979, . 39. P. Coulerie, C. Eydoux, E. Hnawia, L. Stuhl , A. Maciuk, N. Lebouvier, B. Canard, B. Figadère, J-C. Guillemot, M. Nour, Biflavonoids of Dacrydium balansae with Potent Inhibitory Activity on Dengue 2 NS5 Polymerase, Planta Med, 2012, 78, 672–677. 40. Simon F. R. Hinkley, Nigerl B. Perry and Rex T. Weaves, Confirmation of structure and absolute Stereochemistry of 9-epi-β- Caryophyllene from Dacrydium cupressinium, Phytochemistry, 1994, 35(6), 1489-1494. 41. Trần Thu Hương, Đóng góp vào việc chuyển hóa α-Cedren và Cedrol từ tinh dầu Giả Hoàng Đàn Việt Nam, Luận án phó tiến sĩ, Hà nội, 1996. 42. R. G. Powell, D. Weisleder, C. R. Smith, Jr. and W. K. Rohwedder, Structure of harringtonine, isoharringtonine and homoharringtonine, Tetrahedron Lett., 1970, 11 (11), 815–818.. 43. K. L. Mikolajczak, R. G. Powell and C. R. Smith, Jr., Deoxyharringtonine, a new antitumor alkaloid from Cephalotaxus: Structure and synthetic studies, Tetrahedron, 1972, 28 (7), 1995–2001. 44. H Meng, C Yang, J. Jin, Y Zhou, W Qian, Homoharringtonine inhibits the AKT pathway and induces in vitro and in vivo cytotoxicity in human multiple myeloma cells, Leukemia & lymphoma, 2008, 49 (10), 1954–1962. 45. Zhou DC, Zittoun R, Marie JP, Homoharringtonine: an effective new natural product in cancer chemotherapy, Bull cancer, 1995, 82 (12), 987-995. 46. L. Li, Xia LJ, C. Jiang, R. Han, Induction of apoptosis by harringtonine and homoharringtonine in HL-60 cells, Pubmed , 1994, 29(9), 667-672. 47. Y-H. Kuo, S-Y. Hwang, L-M. Y. Kuo, Y-L. Lee, S-Y. Li, and Y-C. Shen, A Novel Cytotoxic C-Methylated Biflavone, Taiwanhomoflavone-B from the Twigs of Cephalotaxus wilsoniana, Chem. Pharm. Bull., 2002, 50 (12), 1607—1608. 141 48. N. Sun, Z. Xue, X. Liang and L. Huang, Acta Pharm. Sinica, 1979,14, 39– 44; Chem. Abstr., 1980, 92 49. S. Kang, S. Cai and L. Teng, Acta Pharm. Sinica, 1981, 16, 867–868. 50. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D., Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored PCR amplification, Genomics, 1994, 20, 176-183. 51. Weising K., Winter P., Huttel B., Kahl G., Microsatellite markers for molecular breeding, J Crop Prod., 1998, 1 (1), 113-143. 52. Khuất Hữu Thanh, Kỹ thuật gen , NXB Khoa học và kĩ thuật Hà nội, 2003. 53. P.Y. Yip, C. F. Chau, C. Y. Mak and H. S. Kwan, DNA methods for identification of Chinese medicinal material, Chinese Medicine, 2007, 9 (2), 1-19. 54. Li Yingang, Zhou Zhichun, Jin Guoqing, Genetic Diversity for Different Provenances of Cephalotaxus fortune, Scientia Silvae Sinicae, 2008, 44(2), 64-69. 55. H-W. Pan,Y-R. Guo, Y-J Su and T. Wang, Development of microsatellite loci for Cephalotaxus oliver (Cephalotaxaceae) and cross-amplification in Cephalotaxus, American Journal of Botany, 2011, 229-232. 56. Y. Miao, X. Lang, S. Li, J. Su and Y. Wang, Characterization of 15 Polymorphic Microsatellite Loci for Cephalotaxus oliveri (Cephalotaxaceae), a Conifer of Medicinal Importance, Int. J. Mol. Sci., 2012, 13, 11165-11172. 57. T. Wang, Z. Wang, F. Xia and Y. Su, Local adaptation to temperature and precipitation in naturally fragmented populations of Cephalotaxus oliveri, an endangered conifer endemic to China, Scientific reports, 2016, 6, 25031. 58. Y-J Su, T. Wang and F. Deng, Population genetic variation, differentiation and bottlenecks of Dacrydium pectinatum (Podocarpaceae) in Hainan Island, China: implications for its conservation, Australian Journal of Botany, 2010, 58, 318–326. 59. K. N. Hong, Y. M. Kim, Y. J. Park and J. W. Lee, Genetic Diversity and Population Genetic Structure of Cephalotaxus koreanain South Korea, Korean J. Plant Res., 2014, 27 (6), 660-670. 60. K. Marxen, K. H. Vanselow, S. Lippemeier, et al., Determination of DPPH Radical Oxidation Caused by Methanolic Extracts of some Microalgal 142 Species by Linear Regression Analysis of Spectrophotometric Measurements, Sensors, 2007, 7, 2080-2095. 61. M. Burits and F. Bucar, Antioxidant activity of Nigella sativa essential oil, Phytotherapy Research, 2000, 14, 323–328. 62. M. Cuendet, K. Hostettmann and O. Potterat, Iridoid glucosides with free radical scavenging properties from Fagraea blumei, Helvetica Chimica Acta, 1997, 80, 1144–1152. 63. A. Monks, D. Scudiero, P. Skehan, R. Shoemake, K. Paull, D. Vistica, C. Hose, J. Langley, P. Cronise, H. Campbell, J. Mayo, M. Boyd, Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines, Journal of National Cancer Institute, 1991, 11( 83), 757-766. 64. D. A. Scudiero, R. H. Shoemaker, K. D. Paull, A. Monks, S. Tierney, T. H. Nofziger, M. J. Currens, D. Seniff, M. R. Boyd, Evaluation of a soluble Tetrazolium/Formazan assay for cell growth and drug sensivity in culture using human and other tumor cell lines, Cancer Research., 1988, 48, 4827-4833. 65. L. B. S. Kardono, C. K. Angerhofer, S. Tsauri, K. Padmawinata, J. M. Pezzuto, A. D. Kinghorn, Cytotoxic and antimalarial constituents of the roots of Eurycoma longifolia, J. Nat. Prod., 1991, 5 (54), 1360-1367. 66. M. C. Alley, D. A. scudiero, A. Monks, M. L. Hursey, M. J. Czerwinski, D. L. Fine, B. J. Abbott, J. G. Mayo, R. H. Shoemaker, M. R. Boyd, Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Research, 1988, 48, 589-601. 67. R. H. Shoemaker, D. A. Scudiero, E. A. Suasville, Application of high- throughput, molecular – targeted screening to anticancer drug discovery, Curr. Top. Med. Chem., 2002, 2 (3), 229-246. 68. Parasharami V. A., Thengane S. R., “Inter population genetic diversity analysis using ISSR markers in Pinus roxburghii (Sarg.) from Indian provenances”, Inter J Bio Conser , 2012, 4(5), 219-227. 69. Bornet B., Branchard M., Nonanchored inter simple sequence repeat (ISSR) markers: Reproducible and specific tools fr genome fingerprinting, Plant. 143 Mol. Biol. Rep., 2001, 19 (3), 209-215. 70. Carrasco B., Retamales J. B., Quiroz K., Garriga M., Caligari P. D. S., Gonzales R. G., Inter simple sequence repeat markers associated with flowering time duration in the Chilean strawberry (Fragaria chiloensis), J. Agr. Sci. Tech., 2013, 15, 1195-1207. 71. Baloch F. S., Kurt C., Arioglu H., Özkan H., Assaying of diversity among soybean (Glycin max (L.) Merr.) and peanut (Arachis hypogaea L.) genotypes at DNA level, Turk. J. Agric. For., 2010, 34, 285-301. 72. Phong D. T., Hiep V. T. T., Thanh T. T.V.,Tang D. V., Comparison of RAPD and ISSI marker for assessment of genetic diversity among endangered rare Dalbergia oliveri (Fabaceae) genotypes in Vietnam, Genet. Mol. Res.,2011, 10(4), 2382-2393. 73. Mahdizadeh V., Safaie N., Goltapeh E. M., Genetic diversity of sesame isolates of Macrophomina phaseolina using RAPD and ISSI marker, Trakia. J. Sci., 2012, 10(2), 65-74. 74. Arif M., Zaidi N. M., Singh Y. P., Haq Q. M. R., Singh U. S., A comparative analysis of ISSR and RAPD markers for study of genetic diversity in Shisham (Dalbergia sissoo), Plant. Mol. Biol. Rep., 2009, 27, 488- 495. 75. Isshiki S., Iwata N., Khan M. M. R.,. ISSR variations in eggplant (Solanum melongena L.) and related Solanum species, Scientia. Hortic, 2008, 117, 186–190. 76. Muthusamy, S., Kanagarajan S., Ponnusamy S., Efficiency of RAPD and ISSR markers system in accessing genetic variation of rice bean ( Vigna umbellata) landraces, Electronic Journal of Biotechnology, 2008, 11(3), 1-10. 77. Yingchun Miao, Xuedong Lang, Shuaifeng Li, Jianrong Su, Yuehua Wang, Characterization of 15 Polymorphic Microsatellite Loci for Cephalotaxus oliveri (Cephalotaxaceae), a Conifer of Medicinal Importance, International Journal of Molecular Science, 2012, 13, 11165-11172. 78. Pan H. W., Guo Y. R., Su Y. J., Wang T., Development of microsatellite loci 144 for Cephalotaxus oliveri (Cephalotaxaceae) and cross-amplification in Cephalotaxus, American Journal of Botany, 2011, 229-232. 79. Mariettea S., Chagnéa D., Decroocqa S., Vendraminb G. G., Lalannea C., Madura D., Plomiona C., Microsatellite markers for Pinus pinaster Ait, Ann. For. Sci., 2001, 58, 203-206. 80. Mellick R., Porter C., Rossetto M., Isolation and characterisation of polymorphic microsatellite loci from Podocarpus elatus (Podocarpaceae), Molecular Ecology Resources, 2009, 9(6), 1460-1466. 81. Hung K. H., Lin C. Y., Huang C. C., Hwang C. C., Hsu T. W., Ku Y. L., Wang W. K., Hung C. Y., Chiang T. Y., Isolation and characterization of microsatellite loci from Pinus massoniana (Pinaceae). Botanical Studies, 2012, 53, 191-196. 82. Chiang Y. C., Shih H. C., Chang L. W., Li W. R., Lin H. Y., Ju L. P., Isolation of 16 polymorphic microsatellite markers from an endangered and endemic species, Podocarpus nakaii (Podocarpaceae). Amer. J. Bot., 2011, 306-309. 83. Boys J., Cherry M., Dayanandan S., Microsatellite analysis reveals genetically distinct populations on red pine (Pinus resinosa, pinaceae). Amer. J. Bot., 2005, 92(5), 833-841. 84. Vendramin G. G., Lelli L., Rossi P., Morgante M., A set of primers for the amplification of 20 chloplast microsatellites in Pinaceae, Mol. Ecol., 1996, 5, 595-598. 85. Elsik C. G., Minihan V. T., Hall S. E., Scarpa A. M., Williams C. G., Low- copy microsatellite markers for Pinus taeda L., Genome, 2000, 43: 550-555. 86. Echt C. S., May-Marquardt P., Hseih M., Zahorchak R., Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome, 1996, 39, 1102-1108. 87. Porebski S., Bailey L. G., Baum B. R., Modification of a CTAB DNA Extraction Protocol for Plants Containing High Polysaccharide and Polyphenol Components, Plan Mol Biol Rep, 1997, 15(1), 8-15. 145 88. Rohlf F. J., NTSYS-PC, Numerical taxonomy and multivariate analysis system version 2.0, State University of New York, 1992, New York. 89. Yap I. V., Nelson R. J., Winboot: a program for performing bootstrap analysis of binary data to determine the confidence of UPGMA-based dendrograms, IRRI, 1996, Manila. 90. Peakall R., Smouse P. E., Genalex 6: Genetic analysis in excel, Population genetic software for teaching and research, Molecular ecology notes, 2006, 6, 288-295. 91. Nei M., Analysis of genetic diversity in subdivided populations, Proc Natl Acad Sci USA, 1973, 70, 3321-3323. 92. D. Weisleder, R. G. Powell, Jr C. R. Smith, Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy of cephalotaxus alkaloids, Org. Magn. Reson., 1980, 13 (2), 114-115. 93. N. Isono, M. Mori, Total Synthesis of (-) Cephalotaxine, J. Org. Chem., 1995, 60(1), 115-119. 94. Mikolajczak, K. L.; Powell, R. G.; Smith, C. R., Jr., Deoxyharringtonine, a new antitumor alkaloid from Cephalotaxus: Structure and synthetic studies, Tetrahedron, 1972, 28, 1995-2001. 95. I . Takano, I. Yasuda, M. Nishifima, Y. Hitosuyanagi, K. Takeya, H. Itokawa, Alkaloids from cephalotaxus harringtonia, Phytochemistry, 1996, 43 (1), 299-303. 96. R. G. Powell, D. Weisleder, C. R. Smith Jr., Antitumor Alkaloids from Cephalotaxus harringtonia: Structure and Activity, J. Pharm.Sci., 1972, 61(8), 1227-1230. 97. R. G. Powell, Structures of homoerythrina alkaloids from cephalotaxus harringtonia, Phytochemistry, 1972, 11 (4), 1467-1472. 98. S. R. Johns, J. A. Lamberton and A. A. Sioumis, Alkaloids of Schelhammera pedunculata (Liliaceae). III. The structures of the schelhammericine and alkaloids, Aust. J. Chem., 1969, 22 (10), 2219–2231. 99. J. George Buta, Judith L. Flippen, William R. Lusby, Harringtonolide, a Plant Growth Inhibitory Tropone from Cephalotaxus harringtonia (Forbes) 146 K. Koch, J. Org. Chem., 1978, 43(5), 1002-1003. 100. L. Evanno, A. Jossang, J. Nguyen-Pouplin, D. Delaroche, P. Herson, M. Senleimann, B. Bode, B. Nay, Further studies of the Norditerpene (+)- Harringtonolide isolated from Cephalotaxus harringtonia var. drupacea: Absolute configuration, Cytotoxic and Antifungal Activities, Planta Med, 2008, 74, 870-872. 101. Trinh Thi Thuy, Pham Thi Ninh, Nguyen Huy Cuong, Tran Van Sung, Catechin và epicatechin từ cây Dây săng máu (Celastrus paniculatusWilld.), Tạp chí Dược liệu (Journal of Materia Medica-Hanoi), 2008, 13 (3), 108- 110. 102. Tran Van Sung, Trinh Thi Thuy, Le Thi Hong Nhung, Ngo Van Quang, Nguyen Thi Ha, Bui Thi Thu Huong, Separation, purification andstructure determination of (-) -epigallocatechin-3-gallat from the leaves of Camilla sinesis. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, (Journal of Science and Technology), 2007, 45 (1B), 450-455 103. Guerriero A. , Pietra F., Isolation, in large amounts, of the rare plant ecdysteroid Ajugasterone-C from the mediterranean zoanthid Gerardia savaglia, Comp. Biochem.Physiol, 1985, 80 (2), 277-278 104. Campello, J. de P., Fonseca, S.F., Chang, C.J., Wenkert, E., Terpenes of Podocarpus lambertius, Phytochemistry, 1975, 14(1), 243–248. 105. L-C. Zhang, X-D. Wu, J. He, Y. Le, R-P. Zhang, Q-S. Zhao, Three new abietane diterpenoids from Podocarpus fleuryi, Phytochemistry, 2013, 6, 364-367. 106. Lin L.-Z, Blasko G., Cordel G. A, Diterpenes of Salvia prionitis, Phytochemistry , 1989, 28 (1), 177 -181. 107. Ulubelen A. , Topcu G., New Abietane Diterpenoids from Salvia montbretii, J.Nat.Prod., 1992, 55(4), 441-444. 108. Y. S. Jong, A. M. Eun, B. H. Myun, et al., Steroids from the aerial parts of Artemisia princeps Pampanini, Korean J. Medicinal Crop Sci., 2006, 14 (5), 273-277 147 109. Vokáč K., Buděšinský M., Harmatha J., Kohoutavá J., Ecdysteroid constittuents of the mushroom Tapinella Panuoides*, Phytochemistry, 1998, 49 (7), 2109-2114. 110. K. Nakanishi, M. Koreeda, S. Sasaki, M. L. Chang, and H. Y. Hsu, Insect Hormones, The structure of Ponasterone A, an Insect – moulting Hormone from the leaves of Podocarpus nakaii Hay, Chemical Communication (London), 1996, 24, 915-917. 111. N. Z. Mamadalieva , M. Z. El-Readi , A. A. Janibekov , A. Tahrani , and Michael Wink, Phytoecdysteroids of Silene guntensis and their in vitro Cytotoxic and Antioxidant Activity, Z. Naturforsch. , 2011, 66 c, 215 – 224. 112. S. Imai, E. Murata, and S. Fujioka, M. Koreeda and K. Nakanishi, Structure of Ajugasterone C, a Phytoecdysone with an 11-Hydroxy-group, Chemical comminucations, 1969, 10, 546-547. 113. V. N. Odinokov, I. V. Galyautdinov, D. V. Nedopekin, L. M. Khalilov, A. S. Shashkov, V. V. Kachala, L. Dinan, R.Lafont, Phytoecdysteroids from the juice of Serratula coronate L. (Asteraceae), Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2002, 32, 161-165. 114. S. Imai, E. Murata, and S. Fujioka, M. Koreeda and K. Nakanishi, Structure of Ajugasterone C, a Phytoecdysone with an 11-Hydroxy-group, Chemical comminucations, 1969, 10, 546-547. 115. E. Wollenweber, L. Kraut and R. Mues, External Accumulation of Biflavonoids on Gymnosperm Leaves, Z. Naturforsch, 1998, 53c, 946-950 . 116. Liao, Z., Kato, H., Pandey, M., Cantor, J. M., Ablooglu, A. J., Ginsberg, M. H. and Shattil, S. J. (2015). Interaction of kindlin-2 with integrin β3 promotes outside-in signaling responses by the αVβ3 vitronectin receptor. Blood 125, 1995-2004. 117. Ferchichi L, Derbre S, Mahmood K, Guilet D, Litaudon M, Awang K, Hadi AHA, Le Ray AM, Richomme P, Bioguided fractionation and isolation of natural inhibitiors of advanced glycation end-products (AGEs) from Calophyllum flavoramulum, phytochemistry, 2012, 78, 98-106. 148 118. H. K. Kim, K. H. Son, H. W. Chang, S. S. Kang, and H. P. Kim, Amentoflavone, a plant biflavone: A new potential anti-inflammatory agent, Arch. Pharm. Res, , 1998, 21(4), 406-410. 119. Cholbi M. R., Paya M. and Alcaraz M. J., Inhibitory effects of phenolic compounds on CCl4-induced microsomal lipid peroxidation, Experientia, 1991, 47, 195-199. 120. P-H. Yeh, Y-D. Shieh, L-C. Hsu, L-M. Y. Kuo, J-H. Lin, C-C. Liaw, and Y- H. Kuo, Naturally occurring cytotoxic [3’8”] Biflavonoids from Podocarpus nakaii, J Tradit complementMed., 2012, 2(3), 220-226. 121. C-M. Sun,totoxic W-J. Syu, Y-T. Huang, C-C. Chen, and J-C. Ou, Selective cyctotoxic of Ginkgetin from Selaginella moellendorffii, J. Nat. Prod., 1997, 60, 382-384. 122. S.-T. Chang, S-Y Wang, C-L.Wu, Y-C Su, and Y-H Kuo, Antifungal compounds in the ethyl acetate Soluble Fraction of the extractives of Taiwania ( Taiwania cryptomerioides Hayata) Heartwood, Hlzforschung, 1999, 53, 487-490. 123. H. Saijoa , H. Kofujitaa , K. Takahashiab and T. Ashitan, Antioxidant activity and mechanism of the abietane-type diterpene ferruginol, Natural Product Research, 2015, 29 (18), 1739-1743 124. M. Rozalskia, Ł. Kuz´mab , U. Krajewskaa , and H. Wysokin´ska, Cytotoxic and Proapoptotic Activity of Diterpenoids from in vitro Cultivated Salvia sclarea Roots. Studies on the Leukemia Cell Lines, Z. Naturforsch., 2006, 61 c, 483-488 125. H. M. Chang, K. P. Cheng, T. F. Choang, H. F. Chow, K. Y. Chui, P. M. Hon, F. W. L. Tan, Y. Yang, and Z. P. Zhong, Structure Elucidation and total synthesis of New Tanshinones isolated from Salvia miltiorrhiza Bunge (Danshen), J. Org. chem., 1990, 55, 3537-3543. 126. Y. Hayashi, T. Matsumoto, M. Uemura, Carbon-13 NMR studies of the biologically active nor-diterpenoid dilactones from Podocarpus plants, 149 Organic Magnetic Resonance, 1980, 14, 86-92. 127. Y. Hayshi, S. Takahashi, H. Ona, T. Sakan, Structures of Nagilacton A, B, C and D, novel nor- and bisnorditerpenoids, Tetrahedron Letters, 1968, 17, 2071-2076. 128. Yaming X., Shengding F., The chemical constituents from Podocarpus fleuryi Hickle, Acta Botanica Sinica, 1990, 32(4), 302-306. 129. S. Saiedina, A. Manayi, A. R. Gohari, M. Abdollahi, The Story of β- sitosterol-A review, European Journal of Medicinal Plants, 2014, 4 (5), 590- 609. 130. Đinh Thị Phòng (chủ nhiệm), Nghiên cứu tính đa dạng nguồn gen di truyền và thành phần hóa học một số loài lá kim ở Tây Nguyên, đề xuất giải pháp bảo tồn, sử dụng và phát triển bền vững mã số TN3/T15, 2016, Hà nội.