Đề tài nghiên cứu đã xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng của chủng (chủng
gốc và chủng sản xuất) vi rút Beijing-1 để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế
bào Vero tại Việt Nam gồm 9 chỉ tiêu chất lượng, phương pháp kiểm định và tiêu
chuẩn chất lượng cho từng chỉ tiêu phù hợp cho kiểm tra chất lượng chủng giống
gốc và chủng giống sản xuất có nguồn gốc từ chủng Beijing-1 sử dụng để sản xuất
vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt trên bào Vero:
1. Nhận dạng bằng phương pháp PCR (GTTG): % tương đồng gen E ≥ 95% so
với chủng chuẩn.
2. Nhận dạng bằng phương pháp ELISA: Mẫu chứa kháng nguyên vi rút
VNNB.
3. Kiểm tra vô trùng bằng phương pháp nuôi cấy: Không phát hiện có sự phát
triển của vi khuẩn và nấm trên 2 loại môi trường sau 14 ngày nuôi cấy.
4. Kiểm tra Mycoplasma bằng phương pháp nuôi cấy: Không phát hiện có sự
phát triển của Mycoplasma sau 21 ngày theo dõi.
5. Kiểm tra vi rút ngoại lai trên chuột nhắt: Ít nhất 80% chuột sống khỏe mạnh,
không có dấu hiệu bệnh lý.
6. Kiểm tra vi rút ngoại lai trên chuột ổ: Ít nhất 80% chuột sống khỏe mạnh,
không có dấu hiệu bệnh lý.
7. Kiểm tra vi rút ngoại lai trên chuột lang: Ít nhất 80% chuột sống khỏe mạnh,
các cơ quan nội tạng chuột bình thường, không có dấu hiệu bệnh lý.
8. Kiểm tra vi rút ngoại lai trên tế bào (Vero, MRC5 & BHK-21):Không có hủy
hoại tế bào (CPE) và không có vi rút hấp phụ hồng trong các chai tế bào gây
nhiễm mẫu thử, không có vi rút ngưng kết hồng cầu trong mẫu thử.
9. Hiệu giá vi rút trên tế bào BHK-21/Vero: ≥ 6 log PFU/ml (hoặc ≥
106 PFU/ml).
Ngoài ra, Đề tài cũng đạt được 1 số kết quả khác như:
- Đưa ra được dải nhiệt độ phù hợp để chủng Beijing-1 duy trì sự ổn định
về hiệu giá theo yêu cầu (≥ 6 log PFU/ml): Ở điều kiện bảo quản104
nitrogen lỏng ổn định ít nhất trong 10 năm; ở -20oC ổn định trong 3 tháng
và ở 2-8oC ổn định trong 3 ngày.
- Xác định được các tỷ lệ tương đồng về trình tự nucleotide và trình tự axit
amin vùng gen sinh tổng hợp kháng nguyên E của lô chủng gốc BV-MSV-
0210, chủng sản xuất BV-WSV-0310 với chủng chuẩn tham chiếu
Reference JEV Beijing-1 Kanonji và các chủng vi rút VNNB trên người,
muỗi và lợn tại Việt Nam ở các giai đoạn khác nhau. Đồng thời xác định
được mức độ bảo toàn về mặt di truyền của các vùng quyết định kháng
nguyên giữa chủng sử dụng để sản xuất vắc xin và chủng lưu hành ngoài
thực địa.
174 trang |
Chia sẻ: huydang97 | Ngày: 27/12/2022 | Lượt xem: 382 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút Beijing-1 để ứng dụng sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
AINS CIRCULATING IN VIETNAM
Nguyen Thi Ly1, Huynh Thi Phuong Lien2, Do Tuan Dat2, Nguyen Kim Bach1,
Nguyen Hoang
Tung1, Ha Thi Thu3, Dinh Duy Khang3,
1National Institute for Control of Vaccines and Biologicals (NICVB)
2Vaccine and Biological Products One Member Limited Company
(VABIOTECH) 3Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and
Technology (VAST)
To whom correspondence should be addressed. E-mail: khangvspt@ibt.ac.vn
Received: 13.8.2020
Accepted: 15.12.2020
SUMMARY
Since 2006, the inactivated Japanese encephalitis vaccine has been studied and produced by the
VABIOTECH company from the Beịing-1 strain on Vero cells. Vaccines produced from the
materseed and working seed virus have been evaluated at laboratory and clinical scale in humans.
The results showed that the vaccine was safe and created 100% protective antibodies after the booster
dose. To officially put this vaccine into production and mass use, the master seed virus BV-MSV0210
and working seed virus BV-WSV-0310 with the reference standard strain JEV Beijing-Kanonji has
been tested for genetic stability. By the method of Sanger sequencing and genetic analysis software,
we have evaluated the similarity of nucleotide and proteinsequencesof the E antigenencoding gene.
The results showed that the seed virus similarity of amino acids and nucleotides is 100% compared
with the reference strain. Thus, it can be concluded, the seed virus has antigen stability. Nucleotide
and amino acid gene sequences of E genomic regions of the two seed lots were compared with virus
strains isolated from human, pig and mosquito in Vietnam. The results showed that the nucleotide
similarity of seed virus compared with the JEV strains isolated from humans ranged from 86.67 to
97.54%; from pigs is 87.47 to 88.33%, and from mosquitoes is 86.05 to 99%. Meanwhile, the amino
acid similarity of the seed virus with the JEV strains isolated from humans ranged from 96.73 to
99.02%; from pigs is 98.00 to98.40% and from mosquitoes 94.55 to 98.40%. The sequence of amino
acids in the epitope producing neutralizing antibodies of the seed virus did not differ from that of the
JEV strain circulating in humans isolated in 2014.
Keywords: Beijing-1 strain, Master Seed Virus strain, Working Seed Virus strain, Envelope protein
gene, nucleotide homology, amino acid similarity, neutralizing antibody-produce epitopes.
INTRODUCTION
Japanese Encephalitis virus has many
strains (about 290 strains have been
isolated in Asia), belonging to 5
genotypes. However, not all strains can
be used to produce human vaccines. In
order to be selected for the production of
vaccines for human use, the virus strain
needs to meet many criteria as prescribed
by the World Health Organization.
Currently, most strains used to produce
vaccines belong to genotype 3 such as:
Nakayama strain; Beijing -1; Beijing-3;
SA-14-14-2 (Sharma et al., 2014; Huynh
Phuong Lien et al., 2011).
According to statistics, Japan is the first
research country to produce the first
inactivated JE vaccine with strains of
Nakayama and/or Beijing-1. However,
the actual clinical research results show
that the Beijing-1 strain has superior
immunity compared to the Nakayama
strain. Therefore, since 1989, the
production of the JE vaccine was
officially switched to use the strain
Beijing-1. After Japan, China also
researched and produced vaccines using
strains Beijing-3 and SA-14-14-2.
Subsequently, Korea started using the
Nakayama strain; India and Austria used
the strain SA-14-14-2.
In Vietnam, in 1989 Vabiotech company
researchedand used the Nakayama strain
to produce inactivated JE vaccine on
mouse brains. The vaccine has been put
into mass use since the early 1990s up to
now with very good protection results.
From 2006 up to now, Vabiotech
company has researched and developed a
technological process to produce
inactivated JE vaccines on Vero cells
from Beijing-1 strain to gradually replace
vaccines produced in the brain of mice
today. This new vaccine has gone through
a number of stages such as the
establishment of a Master Seed Bank with
code BV-MSV-0210 and a Working Seed
Bank with code BV-WSV-0310.The
assessment and monitoring of the quality
of the strains produced by the time of
preservation and over the quality of 10
batches of finished vaccines at the
laboratory scale and on the clinical scale
in humans have been carried out from
2013-2018. The results showed that the
vaccine was safe and created 100%
protective antibodies after the booster
injection. To officially put this vaccine
into production and mass use, the
evaluation of the E gene region stability
(specific protective antibody-forming
region) of these strains compared with the
original strain and the similarity of
nucleotides and amino acids with the JEV
strains circulating in Vietnam is essential
to confirm whether the vaccine using this
batch of strains is really effective in
preventing the disease from the JEV
strains circulating in Vietnam. For that
reason, we performed E gene sequencing
and analysis of nucleotide and amino acid
similarity of master seed virus (MSV)
batch BV-MSV-0210 and working seed
virus (WSV) batch BV-WSV-0310 with
the original standard strain (Reference
JEV Beijing-Kanonji) provided by
Kanonji, Japan to assess genetic stability
and compare with existing JEV strains in
Vietnam to evaluate antigen similarity.
In this study, we present some results on
the
E gene region similarity of 2 batches of
Beijing1 strains being used in JE vaccine
production with standard virus strains and
JEV strains circulating in Viet Nam.
MATERIALS AND METHODS
The object of study is the seed bank of
batch BV-MSV-0210 and the seed bank
for production batch BV-WSV-0310.
Reference JEV BeijingKanonji provided
by Kanonji, Japan, is the strain used to
produce 2 batches of seed strains used in
research. Total RNA was extracted and
purified from each sample using the
QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen). E
gene region was amplified by RT-PCR
using OneStep PCR Kit (Qiagen) with
primer pair: JEV-E-p1:
5’TTCAACTGTCTGGAATGG-3'; JEV-
E-p2: 5’AGCATGCACATTGGTAGCT-
A-3 'with the program: 50°C for30
minutes, 95°C for15 minutes; 30 cycles
(94°C for 1 minute, 50°C for
1 minute, 72° C for 1 minute), 72°C
for10minutes, hold at 4oC. PCR products
were tested on the 1% agarose gel. The
band containing the PCR product is
eluted and purified using the QIAquick
PCR Purification Kit (Qiagen) for
sequencing. Gene sequencing was
performed with Applied Biosystems™
Sanger Sequencing Kit (Thermo Fisher
Scientific) and ABI 3500 gene
sequencing machine of the Institute of
Biotechnology, Vietnam Academy of
Science and Technology. E gene
sequences were analyzed using available
software on the internet such as Blast,
BioEdit, MEGA6.0 to evaluate the
similarity and build phylogenetic trees
based on regional sequence E gene of 2
strains Beijing-1 with standard strain and
JEV strains isolated from humans, pigs,
and mosquitoes in Vietnam from 1964 to
2014 (Table 1). Analysis of E region
antigen epitopes was conducted
according to the method of Luca et al.
(2012).
RESULTS
Results of E gene amplification of
master seed, working seed, and
reference strains
The gene encoding the E antigen of the
master seed strain BV-MSV-0210,
working seed strain BV-WSV-0310 and
the reference standard strain of JEV
Beijing-Kanonji were amplified by RT-
PCR. The results showed that the PCR
product is very specific, without
byproducts, the size is equivalent to the
length of E gene according to theoretical
calculations (about1500
encoding E antigens of master seed
and working seed strains
PCR products were collected by gel
eluted method, purified by QIAquick
PCR Purification Kit, and sequenced by
ABI 3500 gene sequencing machine.
After sequencing, we used specialized
software programs such as Blast, BioEdit,
MEGA6.0 ... to analyze, evaluate the
similarity and build phylogenetic trees
based on
bp). Results are shown in Figure 1.
genes of analysis and of sequencing Results
Figure 1 . Agarose gel 1% electrophoresis for testing
RT - PCR products amplified gene encoding E antigens
of strains: original strain BV - MSV - 0210 ( lane No. 1);
production strain BV - WSV - lane No. 2); Standard 0310 (
strain reference original JEV Beijing - Kanonji lane No ( .
. M: Farmentas 1 kb DNA ladder. 3)
M 1 2 3
1500 bp -
bp 1000 -
the E region sequence of the master seed
BV-
MSV-0210and working seed BV-
WSV0310strains. The results showed that
the gene encoding E antigen has a length
of 1500 bp, a G/C ratio of 52%, which
encodes a protein with a length of 500
amino acids.
The length and nucleotide and protein
sequences of the gene coding for E-
antigen the MSV, WSV and reference
strain are completely identical. These
strains have 100% similarity for both
nucleotides and amino acids. However,
when comparing the nucleotode and
amino acid sequences of the seed strains
with the gene sequences encoding E
antigens of JEV strains isolated in
Vietnam, the similarity percentage is very
different (Table 1).
Based on the results of comparing the
nucleotide and protein sequences of the
gene coding for E antigen of MSV and
WSV strains compared with the reference
strain (BeijingKanonji) and the JEV
strains isolated in Vietnam from 1964 to
2014, we created a phylogenetic tree to
evaluate the nucleotide and protein
correlation between strains studied
(Figures 2 and 3).
The results determined the epitope
positions of protein E of the WSV and
MSV strains
Comparing nucleotide sequence and E
gene protein of the WSV strain and MSV
strain with JEV strains isolated in
Vietnam, especially strains isolated from
human, the results show that this rate
ranged from 86.67 to 97.53% for
nucleotides and 96.73 to 99.00% for
proteins. We have examined whether the
epitopes crucial to the immune response
for neutralized antibodies change or not.
Using the method of Luca et al. (2012),
we determined the positions of the
epitopes and the positions of amino acids
that determine the epitope for antigenic
properties. The results are shown in Table
2.
As results, (Table 2) the amino acids of
the epitopes of the gene encoding the E
antigen in the WSV strain, the reference
strain, the SA1414-2 vaccine strain, and the
JEV strain isolated from humans in
Vietnam in 2014 did not change.
Table 1. Nucleotide and protein sequence similarity ratio of E antigen-encoding gene of master seed strain
(BVMSV-0210) and working seed strain (BV-WSV-0310) compared to E-gene sequence of JEV strainsisolated
in Vietnam over different years and from different hosts.
Nucleotide and protein sequence
No. Accession in Years of Hosts similarity ratio (%)
GenBank isolation Nucleotide Protein
1 LC000631 1964 Human 97.45 98.31
2 AY376461 1986 Human 96.40 99.00
3 AY376463 1989 Human 96.73 99.20
4 HQ009263 2004 Human 97.53 97.20
5 LC000634 2007 Human 87.45 96.73
6 KP876007 2014 Human 86.67 97.04
7 AY376464 2001 Pig 88.33 98.40
8 AY376465 2002 Pig 88.27 98.40
9 HQ009265 2005 Pig 87.47 98.00
10 JEU70420 1979 Mosquito 99.00 98.06
11 AB933311 1994 Mosquito 88.05 98.22
12 AY376468 2002 Mosquito 88.33 98.40
13 JN574431 2005 Mosquito 87.80 98.04
14 LC000635 2010 Mosquito 87.54 96.77
15 LC000637 2011 Mosquito 86.05 94.55
Figure 2. Phylogenetic tree based on E gene nucleotide sequence of the WSV strain (BV-WSV-0310), MSV
(BV-MSV-0210), original reference strain (Beijing-Kanoji), and the JEV strains isolated in Vietnam from 1964 to
2014.
Figure 3. Phylogenetic
tree based on E gene
protein sequence of
the WSV strain (BV-
WSV-0310), MSV
(BVMSV- 0210),
original reference
strain (Beijing-
Kanoji), and the JEV
strains isolated in
Vietnam from 1964 to
2014.
Table 2. Position of
epitopes and positions of
amino acids determining
antigens of epitope on
protein E of the WSV
strain (BV- WSV-3010),
reference strain
(Beijing- Kanonji),
JEV strain isolated in
humans 2014 and
vaccine strain SA14-
14-2.
Domain II-fusion
loopprotein E
Domain I-IIhinge
Side
chains of
Domain I
Side chains of
Domain III
Position ofneutralizing
epitopes 104
AA of the strain SA14-
106 107 52 126 136 275 179 337 360 302 387
14-2 (Luca et al.) G
AA of the strain BV-
G L Q I K S K I F G R
WSV-3010 G
AA of the strain
2014 _KP876007_Human
G L Q I K S K I F G R
_ProE G G L Q I K S K I F G R
AA of the strain Kanonji G G L Q I K S K I F G R
DISCUSSION
Japanese Encephalitis virus (JEV) is the
leading cause of viral encephalitis
globally. The envelope protein of the JEV
(protein E) facilitates virus binding on the
cell surface and membrane fusion, which
is the primary target of antibodies that
neutralize the virus (Luca et al., 2012).
Therefore, the efficacy of JE vaccine
depends on the ability to produce
antibodies to neutralize E protein. Since
2006, inactivated Japanese encephalitis
vaccine has been researched and
produced by Vabiotech company from
Beịing-1 on Vero cell. The results of
clinical trials on humans showed that the
vaccine was safe and created 100%
protective antibodies after the booster
injection. To officially put this vaccine
into production and mass use, the
evaluation of genetic stability and E-
antigens similarity of the WSV strain and
MSV strain compared with the JEV
strains circulating in Vietnam are
essential. The gene encoding the E
antigen of the seed lots includes the
Master Seed Bank BV-MSV-0210 and
the Working Seed Bank BV-WSV-0310
with the reference standard strain JEV
Beijing-Kanonji were sequenced and
analyzed for similarity. The results
showed that 2 batches of WSV have the
similarity of amino acids and nucleotides
of 100% compared with the reference
strains. Thus, it can be concluded that the
MSV strain and the WSV strain have
genetic stability. However, the question
that needs to be answered is, do the strains
used in production have similar antigens
to neutralizing antibodies against JEV
strains circulating in Vietnam? To answer
this question, the E gene region
nucleotide sequences of the two strains
were compared with the E gene region
sequences of JEV strains isolated from
humans, pigs and mosquitoes in Vietnam
and submitted in GenBank from 1964 to
2014 (Table 1). The results showed that,
the similarity of the nucleotide of the
strain compared with the strains VNNB
isolated from humans ranged from 86.67
to 97.54%; from pigs is 87.47 to 88.33%
and from mosquitoes is 86.05 to
99%.Meanwhile, the amino acid
similarity of the strain compared to the
strains of JEV isolated from human
ranged from 96.73 to 99.02%; from pigs
is 98.00– 98.40% and from mosquitoes
94.55 to 98.40%. Looking closely at the
variation of the nucleotide sequence as
well as the protein sequence of the JEV
strains in Table 1, we can see that the
similarity level decreases over time. For
example, the nucleotide similarity of JEV
isolated from humans in 1989 was
96.73% and protein was 99.20, by 2014
this similarity level was only 86.67% for
nucleotides and 97.04. % for protein. So,
is it because the pressure when using JE
vaccine since 1990 has created mutant
strains to gradually evade the protective
ability of the vaccine? According to Roy
el al. (2020), when the structure of the
neutralizing antibody epitopes changes,
the JEV can evade the protective ability
of the neutralizing antibody produced by
vaccines.To be able to elucidate this
problem, we have used the method of
Luca et al. (2012) to compare the amino
acid sequence in the neutralizing antibody
epitope region of Domain I, II and III of
MSV strain, WSV strain and reference
strain with JEV strains circulating in
human isolates in 2014. Results showed
that, no change of amino acids
determining the configuration of antigens
belonging to these epitopesfound (Table
2). That partly explains that vaccines
produced by the WSV strains derived
from the MSV strains still create 100%
protective antibodies. According toDo
Tuan Datet al. (2017), the JECEVAX
vaccine produced from the MSL BV-
MSV-0210 and the WSL BV-WSV-0310
was safe and hadeffective
protection100%after the third injection.
The titer of antibodies to neutralize GMT
using the PRNT method increased after 2
doses of 2.09 logs and 3.04 logs after 3
doses.This result is equivalent to the
vaccine of the same type of Japan
(CCJEV) and the Republic of Austria
(IXIARO).The protective effect of this
vaccine was even better than that of the
control group using the JEVAX vaccine
(the vaccine being used in the expanded
vaccination program in Vietnam,
produced on mouse brain with Nakayama
strain) only reached 99%. Some other
vaccines currently circulating in Vietnam
are Imojev (live chimeric vaccine, strain
SA14-14-2, produced by France) or
JEEV vaccine (made in India) also has a
protective effect of 95–98%.
CONCLUSION
With the results obtained above, it can be
confirmed that 2 lots of Beijing-1strains
(BVMSV-0210 and BV-WSV-0310)
produced by Vabiotech company have
high genetic stability with standard
strains. The nucleotide sequence
similarity of the gene encoding E antigen
of the WSV strain compared to the JEV
strains circulating in Vietnam from 1964
to 2014 is from
86.67 to 97.54% in humans; 87.47–
88.33% in pigs and 86.05–99% in
mosquitoes. Meanwhile, the amino acid
similarity of the WSV strain compared to
the strains of JEV isolated from human
ranged from 96.73 to 99.02%; from pigs
is 98.00-98.40% and from mosquitoes
94.55 to 98.40%. When comparing the
amino acid sequence in the neutralizing
antibodyepitopes of the WSV strain and
the MSV strains with the JEV strain
circulating in humans in 2014, there was
no change of amino acids that determine
the conformation of the antigen.
REFERENCES
Do Tuan Dat, Vu Dinh Them, Tong Thien Anh,
Nguyen Thi Ly (2017) Safety and immunogenicity of
Japanese encephalitis vaccine produced on Vero cells
(JECEVAX) in children (stage II)”. J Prevent Med
27(6): 53-61.
European Pharmacy, 2017. Page 1508-1509.
Huynh Phuong Lien, Nguyen Anh Tuan, Tran Hang
Nga, Nguyen Que Anh et al. (2011) Research and
development of Japanese Encephalitis inactivated
vaccine on vero cells. J Prevent Med 4(103), 2009: 86-
91.
Luca VC, AbiMansour J, Nelson CA, Fremont DH
(2012) Crystal Structure of the Japanese Encephalitis
Virus Envelope Protein. J Virol 86: 2337–2346.
Nguyen Thi Ly, Huynh Phuong Lien, Do Tuan Dat,
Doan HuuThien, Pham Van Hung, Nguyen Thi Mai
Huong (2018) Quality of Japanese encephalitis
inactivated vaccine produced on Vero cells in
Vietnam. National Biotechnology Conference 2018,
October 26, 2018. Natural Science and Technology
Publishing House, 2018, page 512.
Roy U (2020) Structural and molecular analyses of
functional epitopes and escape mutants in Japanese
encephalitis virus envelope protein domain III.
Immunol Res 22: 1–9.
Sharma P, Mittal V, Chhabra M, Singh P, Chauhan
LS, Rai A (2014) An Update on JE Vaccine
Development and Use. J Commun Dis 46: 109–118.
WHO TRS No. 963, (2007) Annex 1.
Recommendations for Japanese encephalitis vaccine
(inactivated) for human use.
ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG VỀ GEN VÀ PROTEIN CỦA CHỦNG SẢN XUẤT
VACCINE BEIJING-1 SO VỚI CÁC CHỦNG VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN
ĐANG
LƯU HÀNH TẠI VIỆT NAM
NguyễnThị Lý1, Huỳnh Thị Phương Liên2, ĐỗTuấn Đạt2, Nguyễn Kim Bách1,
Nguyễn Hoàng
Tùng1, Hà Thị Thu1, Đinh Duy Kháng3
1Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và sinh phẩm y tế (NICVB)
2Công ty TNHH MTV vắc xin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH)
người, lợn và muỗi ở Việt Nam. Kết quả cho thấy, sự tương đồng về nucleotide của chủng giống so
với các chủng virus VNNB phân lập từ người dao động từ 86,67 đến 97,54%; từ lợn là 87,47 đến
88,33% và từ muỗi là 86,05 đến 99%. Trong khi đó, sự tương đồng về amino acid của chủng giống
so với các chủng virus VNNB phân lập từ người dao động từ 96,73 đến 99,02%; từ lợn là
98,0098,40% và từ muỗi là 94,55 đến 98,40%. Trình tự amino acid trong vùng epitope sinh kháng
thể trung hòa của chủng giống không có sự khác biệt so với chủng virus VNNB lưu hành trên người
phân lập năm 2014.
Từ khóa: Chủng Beijing-1, Chủng giống gốc, chủng giống sản xuất, gen mã hóa kháng nguyên E, sự tương
đồng nucleotide, sự tương đồng amino acid, epitope sinh kháng thể trung hòa.
1
Viện Công nghệ sinh học (IBT), Viện Hàn Lâm KH&CN Việt Nam (VAST)
TÓM TẮT
Từ năm 2006, vaccine viêm não Nhật Bản bất hoạt đã được nghiên cứu sản xuất bởi công ty
VABIOTECH từ chủng Beịing-1 trên tế bào Vero. Vaccine sản xuất từ các lô chủng giống gốc và
giống sản xuất đã được đánh giá ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô lâm sàng trên người. Kết quả
cho thấy, vaccineđạt an toàn và tạo kháng thể bảo vệ 100% sau mũi tăng cường. Để chính thức đưa
vắc xin này vào sản xuất và sử dụng đại trà, các lô chủng giống gồm chủng giống gốc BV-MSV-0210
và chủng giống sản xuất BV-WSV-0310 cùng chủng chuẩn tham chiếu JEV Beijing-Kanonji do Nhật
Bản cung cấp đã được kiểm tra về tính ổn định di truyền. Bằng phương pháp giải trình tự Sanger và
phân tích gen với các chương trình phần mềm khác nhau, chúng tôi đã đánh giá sự tương đồng về
trình tự nucleotde và protein của gen mã hóa kháng nguyên E. Kết quả cho thấy, 2 lô chủng giống có
sự tương đồng về amino acid và nucleotide là 100% so với chủng tham chiếu. Như vậy, có thể kết
luận, chủng giống gốc và chủng giống sản xuất có tính ổn định về kháng nguyên. Trình tự nucleotide
và amino acid vùng gen E của 2 lô chủng giống đã được so sánh với các chủng virus phân lập từ
Phụ lục 3. Một số hình ảnh kết quả thí nghiệm trong nghiên cứu
Chủng virút Beijing-1 BV-MSV-0210 Chủng virút Beijing-1 BV-WSV-0310
1 2
Môi trường lỏng I:
Ống số 1 là chứng
âm (và mẫu nghiên
cứu); ống số 2 là
chứng dương khi có
Mycoplasma
1 2
Môi trường lỏng II:
Ống số 1 là chứng
âm (và mẫu nghiên
cứu); ống số 2 là
chứng dương khi có
Mycoplasma
Hình ảnh Mycoplasma trên môi
trường đặc
Chuột sau tiêm não 21 ngày Chuột sau tiêm phúc mạc 21 ngày
Chuột chứng (không tiêm)
Tiêm phúc mạc chuột ổ 1-3 ngày tuổi Tiêm não chuột ổ 1-3 ngày tuổi
Chuột ổ sau tiêm phúc mạc 14 ngày Chuột ổ sau tiêm não 14 ngày
Chuột chứng sau theo dõi 14 ngày
Hình ảnh chai tế bào trước gây nhiễm trên 3 dòng thế bào
Hình ảnh chai tế bào sau gây nhiễm 3ml/chaihỗn dịch trung hòa (vi rút thử thách
(CV) với kháng huyết thanh đặc hiệu):
Hàng 1 là kiểm tra vi rút ngoại lai cho chủng MSV-0210;
Hàng thứ 2 là là kiểm tra vi rút ngoại lai cho tế bào đối chứng;
Hàng 3 là kiểm tra vi rút ngoại lai cho chủng MWS-0310.
Hình ảnh plaque (đám hoại tử- đốm
trắng) của chủng sản xuất BV-MSV-
0210 ở các độ pha 10-6; 10-7; 10-8
Hình ảnh plaque (đám hoại tử- đốm
trắng) của chủng sản xuất BV-WSV-
0310 ở các độ pha 10-6; 10-7; 10-8
10-6 10-7 10-8 10
-6
10-7 10-8
Phụ lục 4.
Phụ lục 5. Các quy trình kỹ thuật kiểm định
THỬ NGHIỆM VÔ TRÙNG
1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
- Kiểm tra vô khuẩn phải được tiến hành trong phòng dành riêng cho thử nghiệm
vô khuẩn.
- Phương pháp: cấy trực tiếp.
1.1. Thể tích cấy
- BTP và BTP cuối cùng: 1ml mẫu thử/1 ống môi trường.
- Vắc xin thành phẩm: Tùy theo thể tích đóng trong mỗi lọ vắc xin mà lượng mẫu
lấy để thử nghiệm có khác nhau. Cụ thể:
Thể tích đóng ống (ml) Thể tích vắc xin lấy ra (ml) Thể tích cấy/ống MT (ml)
< 1 Toàn bộ Toàn bộ
Từ 1 đến < 2 1 1
> 4 2 1
1.2. Chuẩn bị
- Ghi số loạt và đánh số ống môi trường.
- Sát trùng các chai đựng BTP, BTP cuối cùng và các lọ vắc xin cần thử bằng dung
dịch cồn 700.
1.3. Tiến hành
- Mở lần lượt nắp các chai đựng BTP, BTP cuối cùng và các lọ vắc xin.
- Mở lần lượt nút bông của các ống môi trường Thioglycolate và Soybean.
- Dùng pipet vô trùng để lấy sinh phẩm từ trong mỗi chai (hoặc lọ), cấy trực tiếp
bằng cách nhỏ từ từ mẫu thử vào tuýp môi trường.
- Thể tích cấy: mục 6.1.
- Sau khi cấy hơ miệng ống môi trường cẩn thận và đậy kín nút bông.
- Đối với vắc xin đông khô, phải hồi chỉnh bằng nước hồi chỉnh.
- Các thao tác cứ lặp đi lặp lại như vậy cho đến hết số chai (hoặc lọ) mẫu thử.
1.4. Cấy chuyển
- Đối với vắc xin tả: (bao gồm cả bán thành phẩm và bán thành phẩm cuối cùng)
phải cấy chuyển vào ngày thứ 7.
- Số lượng môi trường: mục 4.3.3.
- Thể tích cấy: 1ml/1 ống môi trường.
- Không cấy chuyển các ống chứng môi trường.
1.5. Nhiệt độ nuôi cấy
Sau khi các thao tác trong phòng vô trùng, các ống môi trường sẽ được xếp vào 2 giá
và giữ ở hai nhiệt độ khác nhau.
BTP và BTP cuối cùng:
- Môi trường Thioglycolate: yêu cầu nhiệt độ 32,5±2,50C
- Môi trường Soybean: yêu cầu nhiệt độ 22,5±2,50C
Vắc xin thành phẩm:
- Môi trường Thioglycolate: 2/3 ống môi trường: 32,5±2,50C và 1/3 ống:
22,5±2,50C
- Môi trường Soybean: 22,5±2,50C
1.6. Thời gian nuôi cấy 14 ngày.
1.7. Theo dõi sau thử nghiệm
- Cả hai loại môi trường đều được theo dõi hàng ngày và ghi kết quả theo dõi vào
phiếu theo dõi thử nghiệm vô khuẩn vào các ngày 1, 3, 5, 7, 10 và 14.
2. KẾT QUẢ
2.1. Cách đọc kết quả
- Không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm: Cả 2 loại môi trường đều trong,
không bị vẩn đục. Môi trường Thioglycolate không bị mất lớp chỉ thị màu ở phía
trên.
- Có sự phát triển của vi khuẩn và nấm: Cả 2 loại môi trường đều bị vẩn đục. Môi
trường Thioglycolate bị mất lớp chỉ thị màu ở phía trên.
2.2. Giá trị của thử nghiệm
- Loạt môi trường sử dụng để kiểm tra vô khuẩn đạt yêu cầu về thử nghiệm kiểm
tra chất lượng môi trường.
2.3. Tiêu chuẩn chấp thuận
- Không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm sau 14 ngày theo dõi.
2.4. Hồ sơ
- Kết quả kiểm tra được báo cáo ở Biểu mẫu đính kèm theo SOP#QC-BIO-01 đã
được phê duyệt và lưu giữ ở bộ phận QA, phòng QM.
2.5. Thử nghiệm nhắc lại
Điều kiện nhắc lại Khi không đạt tiêu chuẩn ( mục 7.2 và 7.3).
- Nếu có ống môi trường nuôi cấy bị nhiễm khuẩn: phải tiến hành phân lập và định danh
vi sinh vật.
Thử nghiệm nhắc lại lần 1
- Thực hiện với số lượng mẫu và ống môi trường bằng lần thử đầu.
- Thử nghiệm đạt yêu cầu khi đạt mục 7.2 và 7.3.
- Nếu có sự phát triển của vi sinh vật trong bất kỳ ống môi trường nuôi cấy nào:
phải phân lập và định danh vi sinh vật.
So sánh kết quả với lần thử đầu: Nếu không có sự khác biệt, sản phẩm bị coi là
không đạt vô khuẩn và phải hủy bỏ. Nếu có sự khác biệt, phải tiến hành thử
nghiệm nhắc lại lần 2.
Thử nghiệm nhắc lại lần 2:
- Thực hiện với số lượng mẫu và ống môi trường gấp đôi lần thử đầu.
- Thử nghiệm đạt yêu cầu khi đạt mục 7.2 và 7.3.
Nếu phát hiện dù chỉ 1 ống môi trường có bất kỳ loại vi khuẩn tạp nhiễm, loạt sản
phẩm đó được kết luận là không đạt yêu cầu về tiêu chuẩn vô khuẩn, phải hủy bỏ.
KIỂM TRA VI RÚT NGOẠI LAI TRÊN TẾ BÀO
1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1.1. Kiểm tra virus ngoại lai trên tế bào chứng trong sản xuất vắc xin/sản xuất
chủng
1.1.1. Theo dõi các chai tế bào chứng
+ Theo dõi sự hủy hoại tế bào (CPE) trong các chai tế bào vào ngày thứ 1, 3, 5, 7,
9, 11, 14 và ghi kết quả.
+ Ngày thứ 14 - sau khi quan sát không thấy có CPE, hộn nước nổi trong các chai
tế bào, tiến hành kiểm tra virus ngoại lai gây hấp phụ hồng cầu
+ Nước nổi hộn trong các chai tế bào được tiến hành làm các thử nghiệm kiểm tra
các tác nhân ngoại lai: - Thử nghiệm kiểm tra vô khuẩn
- Thử nghiệm kiểm tra Mycoplasma
- Thử nghiệm kiểm tra vi khuẩn lao (chỉ áp dụng với tế bào PMKc)
- Kiểm tra các virus ngoại lai trên các dòng tế bào khác
1.1.2. Kiểm tra virus ngoại lai trên các dòng tế bào
3.1.2.1. Chuẩn bị tế bào:
- Số lượng: 6 chai 25cm2 tế bào trong đó 5 chai tế bào/mẫu thử và 1 chai tế bào/mẫu
- Tế bào kín đều một lớp, môi trường trong màu vàng cam.
- Viết tên mẫu thử và ngày tiến hành kiểm tra trên các chai nuôi cấy tế bào.
3.1.2.2. Pha môi trường duy trì tế bào (MEM 2% FBS) theo công thức ở bảng.
STT Thành phần Công thức pha 1000 ml
1 MEM(ml) 980
2 FBS(ml) 20
- Cách pha: Hút môi trường MEM và FBS vào chai thủy tinh. Lắc đều.
3.1.2.3. Kiểm tra trên tế bào
- Loại bỏ môi trường nuôi cấy trong các chai tế bào.
- Rửa tế bào trong dung dịch Hank’s: cho 3ml Hank’s vào mỗi chai, láng đều bề
mặt tế bào, hút bỏ Hank’s.
- Nuôi cấy trên tế bào:
Mẫu chứng (1 chai tế bào): 3 ml môi trường duy trì MEM 2% FBS/chai.
Mẫu thử (5 chai tế bào): 3 ml mẫu thử /chai.
- Cho 9 ml môi trường duy trì MEM 2% FBS vào mỗi chai.
3.1.2.4. Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy
- Nuôi cấy trong tủ ấm (36,5 ± 0,5)oC.
- Thời gian nuôi cấy 14 ngày.
- Theo dõi tế bào dưới kính hiển vi soi ngược và ghi kết quả vào ngày thứ 1, 4, 7,
11 và 14.
1.2. Kiểm tra virus ngoại lai trong ngân hàng tế bào (MCB, WCB)
1.2.1. Chuẩn bị mẫu thử
- 10 ống tế bào MBC, WBC được lấy ra từ nitrogen lỏng, nuôi cấy. Sau 2-7 ngày tế
bào kín một lớp, quan sát không thấy có CPE, hộn nước nổi trong các chai tế bào,
tiến hành kiểm tra virus ngoại lai gây hấp phụ hồng cầu .
- Số lượng chai tế bào: 10 chai tế bào.
1.2.2. Kiểm tra virus ngoại lai trên các dòng tế bào (thực hiện như mục 3.1.2)
1.3. Kiểm tra virus ngoại lai trong chủng virus (MSV, WSV)
1.3.1. Xử lý mẫu
- Trung hòa chủng virus với kháng huyết thanh đặc hiệu trước khi tiến hành thử
nghiệm kiểm tra VRNL.
- Pha loãng huyết thanh bằng Hank’s ở độ pha thích hợp để trung hòa hết được với
hỗn dịch virus.
- Xử lý mẫu: Mẫu chứng: Trộn đều kháng huyết thanh với Hank’s theo tỉ lệ 1:1
Mẫu thử: Trộn đều chủng virus với kháng huyết thanh theo tỉ lệ 1:1.
- Ủ trong bể ổn nhiệt 37oC trong thời gian 60 - 90 phút tùy thuộc vào phản ứng
trung hòa của từng loại virus.
1.3.2. Kiểm tra virus ngoại lai gây CPE trong chủng virus trên tế bào
3.3.2.1. Chuẩn bị tế bào (thực hiện như mục 3.1.2).
3.3.2.2. Pha môi trường duy trì tế bào (MEM 2% FBS) thực hiện như mục 3.1.2.2)
3.3.2.3. Nuôi cấy trên tế bào:
- Rửa tế bào trong dung dịch Hank’s: cho 3ml Hank’s vào mỗi chai, láng đều bề
mặt tế bào, hút bỏ Hank’s.
- Nuôi cấy trên tế bào:
Mẫu chứng (1 chai tế bào): 3 ml (KHT + Hank’s)/chai.
Mẫu thử (5 chai tế bào): 3 ml hỗn dịch chủng sau khi trung hòa/chai.
- Hấp phụ: 2 giờ trong tủ ấm (36,5 ± 0,5)oC.
- Hút bỏ nước nổi trong các chai, cho 09 ml môi trường duy trì MEM 2% FBS vào
mỗi chai.
3.3.2.4. Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy
- Nuôi cấy trong tủ ấm (36,5 ± 0,5)oC.
- Thời gian nuôi cấy 14 ngày.
- Theo dõi tế bào dưới kính hiển vi soi ngược và ghi kết quả vào ngày thứ 1, 4, 7,
11 và 14.
1.3.3. Kiểm tra virus hấp phụ hồng cầu
+ Kiểm tra virus hấp phụ hồng cầu trên tế bào đã gây nhiễm.
- Loại bỏ môi trường nuôi cấy trong các chai tế bào sau 14 ngày theo dõi.
- Kiểm tra virus hấp phụ hồng cầu trên các chai tế bào
2. KẾT QUẢ
2.1. Giá trị của thử nghiệm
- Ít nhất 80% số chai tế bào của mẫu thử duy trì cho đến khi kết thúc thời gian quan
sát.
2.2. Đọc kết quả
- Kết quả dương tính (+), có virus ngoại lai: tế bào bị huỷ hoại, quan sát được CPE
hoặc virus hấp phụ hồng cầu.
- Kết quả âm tính (-), không có virus ngoại lai: tế bào không bị huỷ hoại và không
có virus hấp phụ hồng cầu.
2.3. Tiêu chuẩn chấp thuận
- Không có hủy hoại tế bào (CPE) trong các chai tế bào và không có virus hấp phụ
hồng cầu.
KIỂM TRA VI RÚT NGOẠI LAI TRÊN ĐỘNG VẬT
1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1.1. Chuẩn bị mẫu thử
- Tùy thuộc vào từng loại chủng virus, nếu cần sẽ tiến hành trung hòa chủng virus
với kháng huyết thanh.
- Chủng virus được trung hòa với kháng huyết thanh ở độ pha loãng phù hợp theo
tỉ lệ 1:1
- Ủ trong bình ổn nhiệt 370C/90 phút.
1.2. Kiểm tra trên chuột ổ
Số lượng mẫu thử: 3ml
Số lượng chuột/ ổ: 10con/ ổ
Độ tuổi: 1 ngày tuổi
Số lượng chuột kiểm tra: 20 con/ đường tiêm não
20 con/ đường tiêm phúc mạc
10 con/ nhóm chứng
Liều tiêm: Đường tiêm não: 0,01ml/con
Đường tiêm phúc mạc: 0,1ml/con
Nhóm chứng: không tiêm
Theo dõi chuột:
- Thời gian theo dõi động vật thí nghiệm là 14 ngày.
- Ghi nhật ký tình trạng sức khỏe chuột vào các ngày 1,3,5,7,10,14.
1.3. Kiểm tra trên chuột nhắt trưởng thành
Số lượng mẫu thử: 7ml
Trọng lượng chuột: 15-20 gram/con
Số lượng chuột kiểm tra: 10 con/ đường tiêm não
10 con/ đường tiêm phúc mạc
10 con/ nhóm chứng
Liều tiêm: Đường tiêm não: 0,03ml/con
Đường tiêm phúc mạc: 0,5ml/con
Nhóm chứng không tiêm
Theo dõi chuột:
- Thời gian theo dõi động vật thí nghiệm là 21 ngày.
- Ghi nhật ký tình trạng sức khỏe chuột vào các ngày 1,3,5,7,10,14, 17, 21.
1.4. Kiểm tra trên chuột lang
Số lương mẫu: 28ml
Trọng lượng chuột: 350-450 gram/con
Số lượng chuột kiểm tra: 5 con/ đường tiêm phúc mạc
5 con/ nhóm chứng
Liều tiêm: Đường tiêm phúc mạc: 5ml/con
Nhóm chứng không tiêm
Theo dõi chuột:
- Thời gian theo dõi động vật thí nghiệm là 42 ngày.
- Ghi nhật ký tình trạng sức khỏe chuột vào các ngày 1,3,5,7,10,14, 17, 21, 24,
28, 32, 35, 38, 42.
1.5. Trên thỏ trưởng thành (chỉ áp dụng đối với chủng virus được sản xuất từ tế
bào thận khỉ tiên phát)
Số lượng mẫu: 20 ml
Trọng lượng: 1,8 - 2,5 kg/con
Số lượng thỏ kiểm tra: 5 con/ đường tiêm dưới da
5 con / đường tiêm trong da
2 con/ nhóm chứng
Liều tiêm: Đường tiêm dưới da: 2ml/con
Đường tiêm trong da: 1ml/con
Nhóm chứng: không tiêm
Theo thỏ sau tiêm:
- Thời gian theo dõi động vật thí nghiệmlà 30 ngày.
- Ghi nhật ký tình trạng sức khỏe chuột vào các ngày 1,3,5,7,10,14, 17, 21, 24,
28, 30.
1.6. Trên trứng gà có phôi(chỉ áp dụng đối với ngân hàng tế báo gốc, ngân hàng
tế bào sản xuất)
Số lượng mẫu: 4ml
Độ tuổi phôi trứng gà: 9-11 ngày tuổi
Số lượng trứng gà có phôi kiểm tra: 10 quả/ đường tiêm túi noãn
5 quả/ nhóm chứng
Liều tiêm: Đường tiêm túi noãn: 0,2ml/quả
Nhóm chứng không tiêm
Theo dõi trứng gà sau gây nhiễm:
- Thời gian theo dõi là 5 ngày.
- Ghi nhật ký tình trạng sống/chết của phôi trứng gà hàng ngày.
- Sau 5 ngày theo dõi tiến hành lấy dịch niệu kiểm tra ngưng kết hồng cầu với
hồng cầu gà..
2. KẾT QUẢ
2.1. Đọc kết quả
- Trên chuột ổ: đọc kết quả vào ngày 14.
- Trên chuột nhắt trưởng thành: đọc kết quả vào ngày 21.
- Trên chuột lang: đọc kết quả vào ngày 42.
- Trên thỏ trưởng thành: đọc kết quả vào ngày 30.
- Trên trứng gà có phôi: đọc kết quả vào ngày 5.
2.2. Tiêu chuẩn chấp thuận
Trên chuột ổ: ≥ 80% chuột sống khoẻ mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý.
Trên chuột nhắt trưởng thành: ≥ 80% chuột sống khoẻ mạnh, không có dấu hiệu
bệnh lý.
Trên chuột lang:
- ≥ 80% chuột sống khoẻ mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý.
- Các cơ quan nội tạng không có dấu hiệu bất thường.
Trên thỏ trưởng thành:
- ≥ 80% thỏ sống khoẻ mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý.
Trên trứng gà có phôi:
- ≥80% phôi trứng gà sống khoẻ mạnh.
Dịch niệu: không có ngưng kết với hồng cầu gà
HIỆU GIÁ VI RÚT TRÊN CHUỘT
1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1.1. Chuẩn bị động vật thí nghiệm
+ Chuột được chuẩn bị trước ngày gây nhiễm 2 ngày và được chọn ngẫu nhiên với
số lượng:
- 10 con cho mỗi độ pha loãng x 5 độ pha
+ Chuột được đánh dấu và ghi nhãn mỗi lồng theo từng loại, từng độ pha loãng.
Nhãn cho mỗi lồng chuột bao gồm các thông tin sau: tên sản phẩm, loạt số, màu
đánh dấu chuột, ngày tiêm và ngày kết thúc thử nghiệm.
1.2. Pha loãng chủng vi rút
Pha loãng mẫu thử bậc 10 bằng dung dịch pha loãng như sau:
Tuýp
số
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Độ
pha
loãng
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6 10-7 10-8
10-9
Mẫu
thử
(ml)
D2pha
loãng
(ml)
0,2
1,8
0,2
1,8
0,2
1,8
0,2
1,8
0,2
1,8
0,2
1,8
0,2
1,8
0,2
1,8
0,2
1,8
1.3. Tiêm chuột
- Sử dụng các độ pha từ 10-5 đến 10-9 để tiêm chuột
- Sát trùng vị trí tiêm. Dùng bơm tiêm 1ml lấy hỗn dịch vi rut đã pha loãng ở trên.
- Liều tiêm: 0,03ml/1chuột.
- Đường tiêm: Não.
- Thay bơm tiêm khi tiêm với độ pha mới.
1.4. Theo dõi chuột
- Theo dõi các dấu hiệu chuột bị nhiễm vi rút VNNB: liệt 1-2 chân trước; liệt 1-2
chân sau, liệt 1 chân trước 1 chân sau hoặc chết do bị liệt chân.
- Thời gian theo dõi súc vật thí nghiệm là 14 ngày.
- Theo dõi tình trạng nhiễm vi rút VNNB của chuột bắt đầu từ sau tiêm 3 ngày và
ghi nhật ký tình trạng chuột hàng ngày trong thời gian theo dõi 14 ngày.
2. KẾT QUẢ
2.1 Tính kết quả: Tính kết quả theo công thức Reed and Muench
Lg LD50 = Lg A - k x
50 - a
b - a
Trong đó: A: Độ pha loãng gây chết sát trên 50% tổng số chuột
a: % số chuột chết sát dưới 50%
b: % số chuột chết sát trên 50%
k: log của độ pha loãng
2.2. Tiêu chuẩn chấp thuận
Hiệu giá vi rút trong chủng gốc giống, chủng sản xuất VNNB≥10-6.0
HIỆU GIÁ VI RÚT TRÊN TẾ BÀO
1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1.1 Pha loãng mẫu thử
- Pha loãng mẫu thử bậc 10 trong tuýp Eppendorf, ví dụ như sau:
Tuýp số 1 2 3 4 5 6 7 8
Độ pha
loãng 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
Mẫu thử
(ml)
Dung dịch
LE+BA
(ml)
0,1
0,9
0,1
0,9
0,1
0,9
0,1
0,9
0,1
0,9
0,1
0,9
0,1
0,9
0,1
0,9
1.2 Gây nhiễm trên tế bào
+ Gây nhiễm trên phiến tế bào 6 giếng:
- Đánh dấu các độ pha trên các giếng.
- Hút bỏ môi trường nuôi cấy trong giếng.
- Cấy 200 l hỗn dịch virus đã pha loãng ở trên (03 độ pha cuối) vào mỗi giếng,
mỗi độ pha 2 giếng.
+ Cho tất cả các phiến đã cấy vào tủ ấm CO2 (36,5oC ± 0,5oC; 4,5% ± 0,5% CO2)
để ủ 90 phút. Cứ 30 phút láng 1 lần.
1.3 Phủ thạch và nhuộm cố định tế bào
1.3.1 Phủ thạch
- Cho 3 ml môi trường phủ thạch MEM 1% Methylcelluse vào mỗi giếng.
- Ủ các phiến 4 ngày trong tủ ấm CO2 (36,5oC ± 0,5oC; 4,5% ± 0,5% CO2).
1.3.2 Cố định và nhuộm tế bào
- Hút bỏ môi trường nuôi cấy trong các giếng.
- Cho 0,5 ml dung dịch nhuộm cố định vào và ủ 30 - 45 phút ở nhiệt độ phòng 20 –
25oC.
- Rửa phiến dưới vòi nước chảy. Để khô và đọc kết quả.
2. KẾT QUẢ
- Đếm số plaque có trong mỗi giếng: các plaque là những đốm trắng có thể nhìn
thấy bằng mắt thường ở mặt đáy của các giếng.
- Dùng bút dạ đánh dấu và đếm các plaque rồi ghi số plaque đọc được ở trên nắp
mỗi giếng.
- Tính kết quả trung bình của tất cả các giếng.
2.1.Tính kết quả
- Công thức tính:
Hiệu giá virus (PFU/ml) = a/b.c
Trong đó:
a: Số plaque trung bình;
b: Độ pha loãng;
c: số ml hỗn dịch virus cấy
- Ví dụ: ở độ pha 10-5: Giếng 1: 167 plaques
Giếng 2: 165 plaques
Số plaque trung bình: 166 plaque
Hiệu giá virus (PFU/ml) = 166 /(10-5x 0,2) = 8,3 x107 (PFU/ml)
2.2. Tiêu chuẩn chấp nhận
- Hiệu giá virus trong bán thành phẩm thô vắc xin VNNB ≥ 107 (PFU/ml).
- Hiệu giá virus trong chủng virus thử thách (CV) VNNB ≥ 105 (PFU/ml).
- Hiệu giá virus trong chủng gốc giống, chủng sản xuất VNNB ≥ 106(PFU/ml).
AN TOÀN CHUNG
a. Chuẩn bị mẫu thử
- Lấy đủ số lượng mẫu theo yêu cầu.
- Mẫu dạng dung dịch: Hút đủ lượng mẫu theo yêu cầu của thử nghiệm và các
bơm tiêm vô trùng.
- Mẫu dạng đông khô: Hoàn nguyên với dung dịch nước hồi chỉnh rồi hút đủ
lượng mẫu theo yêu cầu của thử nghiệm và các bơm tiêm vô trùng.
- Trường hợp mẫu cần pha loãng: Pha loãng mẫu về nồng độ yêu cầu rồi hút đủ
lượng mẫu theo yêu cầu của thử nghiệm và các bơm tiêm vô trùng.
b. Chuẩn bị chuột
- Chuột nhắt và chuột lang thí nghiệm được cho ăn, uống đầy đủ trước tiêm.
- Chuột cần được kiểm tra trước khi tiêm để đảm bảo hoàn toàn bình thường.
- Cân, ghi trọng lượng và đánh dấu từng con (bằng phẩm mầu) ngay trước lúc
tiêm vào biểu mẫu ghi chép.
c. Tiến hành tiêm
- Sát trùng vùng bụng động vật thí nghiệm bằng bông cồn.
- Tiêm vào phúc mạc từng chuột.
d. Liều tiêm
Nguyên tắc chung:
Tiêm phúc mạc chuột lang ít nhất 1 liều tiêm cho người nhưng không quá
5ml/con và tiêm phúc mạc chuột nhắt ít nhất 1 liều tiêm cho người nhưng không quá
1ml/con; Chuột chứng không tiêm - trừ một số vắc xin và sinh phẩm đặc biệt sẽ thực
hiện theo chuyên luận riêng cho từng vắc xin, sinh phẩm.
e. Theo dõi động vật sau thí nghiệm
- Hàng ngày theo dõi, cân trọng lượng vào một giờ nhất định.
- Thời gian theo dõi: 7 - 14 ngày (tùy vắc xin, sinh phẩm).
f. Đánh giá kết quả
Thử nghiệm được coi là có giá trị khi tuân thủ đúng qui trình; Chuột chứng khỏe
mạnh lên cân bình thường.
Tiêu chuẩn đánh giá kết quả
Vắc xin, sinh phẩm được coi là đạt yêu cầu nếu trong vòng 7 ngày theo dõi toàn
bộ động vật thí nghiệm sống, khỏe mạnh, tăng cân và không có biểu hiện bệnh lý
hoặc nhiễm độc (có trạng thái bất thường (*), giảm hoạt động, giảm cân hoặc chết do
nhiễm độc).
(*): Trạng thái bất thường: Là các trạng thái, dấu hiệu bệnh lý không giống các
mô tả đặc trưng (thường gặp) của vắc xin, sinh phẩm thử nghiệm.
Nếu nhóm chuột đối chứng khỏe mạnh lên cân bình thường, nhóm chuột tiêm
vắc xin, sinh phẩm có ít nhất 1 chuột bị chết hay sút cân hoặc có biểu hiện bất thường
trong quá trình theo dõi (7 ngày), phải tiến hành rà soát lại các yếu tố, điều kiện thử
nghiệm kèm theo mổ chuột để xem tổn thương thực thể và lấy mẫu bệnh phẩmxác
định nguyên nhân.
CHẤT GÂY SỐT
1. Nguyên vật liệu, điều kiện tiến hành
- Động vật thử nghiệm: lựa chọn thỏ khỏe mạnh, trưởng thành, đực hoặc cái
(không mang thai). Trọng lượng 1.5 – 2.5kg được nuôi dưỡng bằng thức ăn không
chứa chất kháng sinh, không tụt cân trong suốt 1 tuần trước khi thử nghiệm và
không có biểu hiện bệnh lý. Cho thỏ nhịn ăn nhưng uống nước đầy đủ trong thời
gian ít nhất 18 giờ (qua 1đêm) và không cho uống nước trong thời gian làm thử
nghiệm.
- Thử nghiệm được tiến hành trong phòng yên tĩnh, sạch sẽ, tránh mọi tiếng
động và ánh sáng làm ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm và nhiệt độ phòng không
chênh lệch quá 30C so với nơi ở cũ.
2. Quy trình thử nghiệm
- Thử nghiệm thăm dò: 3 ngày trước khi tiến hành tiêm sinh phẩm cần kiểm tra
tính nhạy cảm cho các thỏ thử nghiệm bằng cách tiêm vào tĩnh mạch tai thỏ 10ml/ kg
trọng lượng dung dịch nước muối sinh lý 0.9% không chứa chất gây sốt đã được làm
ấm lên khoảng 38.50C. Ghi nhiệt độ trước tiêm và tiếp tục trong vòng 3h sau tiêm
dung dịch nước muối sinh lý. Nếu thỏ có nhiệt độ dao động >0.60C sẽ bị loại và không
đưa vào thử nghiệm chính. Nhiệt độ dao động của mỗi thỏ là nhiệt độ tăng hoặc giảm
sau tiêm so với nhiệt độ ban đầu.
- Thử nghiệm chính: thỏ thí nghiệm là thỏ đạt yêu cầu ở thử nghiệm thăm dò,
được để trong lồng chuyên dụng ít nhất 60 phút để ổn định. Sau đó tiến hành đo nhiệt
độ thỏ 2 lần mỗi lần cách nhau 30 phút (nếu đo tay) hoặc theo chương trình cài đặt
(nếu đo bằng thiết bị). Nhiệt độ ban đầu của thỏ là giá trị trung bình của các lần đo
này. Tiêu chuẩn đưa thỏ vào thí nghiệm là những thỏ có nhiệt độ chênh lệch giữa các
lần đo không quá 0.20C và nhiệt độ ban đầu nằm trong khoảng 380C đến 39.80C. Mỗi
mẫu thử được tiêm cho 1 nhóm gồm 3 thỏ và nhiệt độ chênh lệch trong nhóm không
quá 10C
- Sau khi theo dõi, nhóm thỏ đạt yêu cầu sẽ được tiêm mẫu thử vào tĩnh mạch
rìa tai thỏ. Thể tích được tiêm cho mỗi thỏ tương ứng với 1ml/kg cân nặng. Nên làm
ấm dung dịch tới 38.50C trước khi tiêm. Đo nhiệt độ thỏ ở những khoảng thời gian
tùy thuộc vào thiết bị sử dụng (nếu đo tay cứ 1giờ đo 1 lần, nếu dùng thiết bị tùy
thuộc vào chương trình cài đặt).
- Nhiệt độ tối đa là nhiệt độ cao nhất đo trong khoảng thời gian này
3. Đánh giá thử nghiệm
- Đáp ứng của mỗi thỏ là hiệu số của nhiệt độ tối đa sau khi tiêm mẫu thử và
nhiệt độ ban đầu.
- Đáp ứng của thỏ bằng 0 nếu nhiệt độ tối đa sau tiêm bằng hoặc thấp hơn nhiệt
độ ban đầu.
- Mẫu thử đạt yêu cầu về chất gây sốt nếu nhiệt độ chênh lệch của mỗi thỏ ≤
0.60C và tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ ≤ 1.30C.
- Mẫu thử không đạt yêu cầu về chất gây sốt nếu tổng nhiệt độ chênh lệch của
3 thỏ > 2.40C.
- Nếu tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ nằm trong khoảng từ lớn hơn 1.30C đến
2.40C thì thử nghiệm phải tiến hành trên 3 thỏ khác. Mẫu thử đạt yêu cầu về chất gây
sốt khi tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) của cả 6 thỏ ≤ 30C. Nếu > 4.10C coi như
không đạt yêu cầu.
- Nếu tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) của cả 6 thỏ nằm trong khoảng từ lớn hơn
30C đến 4.10C làm thêm lần cuối trên 3 thỏ khác. Mẫu thử đạt yêu cầu về chất gây
sốt khi tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) của cả 9 thỏ ≤ 4.90C. Nếu > 4.90C coi
như không đạt yêu cầu.
THỬ NGHIỆM CÔNG HIỆU
Thử nghiệm công hiệu vắc xin Viêm não nhật bản bất hoạt được xác định dựa
trên việc xác định hiệu giá kháng thể trung hòa sau khi tiêm miễn dịch trên chuột. Cụ
thể: Huyết thanh sau tiêm được trung hòa với vi rút thử thách (CVS) sau đó gây nhiễm
lên tế bào Vero hoặc BHK-21 hoặc dòng tế bào phù hợp khác.
1.1. Nguyên vật liệu, dụng cụ
1.1.1. Nguyên vật liệu
- Môi trường pha loãng MEM 2% FBS (GIBCO/Sigma).
- Môi trường phủ thạch MEM 1% Methylcellulose(GIBCO/Sigma).
- Dung dịch PBS 0,02% gelatin, pH 7,4.
- Dung dịch nhuộm cố định Crystal violet.
- Huyết thanh chứng dương (Vabioteach).
- Tế bào Vero hoặc BHK-21.
- Chủng vi rút viêm não Nhật Bản làm việc giữ ở -700C.
- Vắc xin chuẩn.
- Vắc xin Viêm não Nhật Bản thử nghiệm.
- Chuột trắng Swiss hoặc giống chuột phù hợp khác, 11-14g; khoẻ mạnh; 32
con (16 con cho vắc xin thử, 16 con cho vắc xin chuẩn) và 8 con làm chứng.
1.1.2. Dụng cụ và trang thiết bị
- Phiến 24 giếng đáy bằng (Corning).
- Cốc thuỷ tinh to (Schott Duran): 1L & 2L.
- Giấy dán phiến.
- Pipet nhựa vô trùng loại 10ml, 25 ml (Corning).
- Tuýp nhựa 15 ml, 50 ml, tuýp eppendorf.
- Bơm tiêm nhựa vô trùng 3ml (Việt Nam).
- Pipet-aid, pipet-man loại 20 µl, 200µl, 1000µl (Eppendorf).
- Chai lọ thuỷ tinh (Schott Duran) loại 50ml, 500ml, 1000ml vô trùng.
- Hốt Laminar (Nuare ClassII)
- Tủ ấm CO2(Sanyo-2172)
- Bể ổn nhiệt(CHCL-Lab, No0301299)
- Máy ly tâm lạnh (Marathol 2100R)
- Kính hiển vi phản pha.(Olympus-CK2)
- Máy lắc (IKA).
1.2. Các bước tiến hành
1.2.1. Pha vắc xin gây miễn dịch
- Pha vắc xin chuẩn và vắc xin mẫu thử trong dung dịch PBS 0,02% gelatin để có
độ pha 1/32.
- Vắc xin đã pha phải bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC.
1.2.2. Tiêm miễn dịch
- Mỗi mẫu vắc xin được tiêm phúc mạc cho một nhóm chuột gồm 16 con,
mỗi con 0,5 ml bằng bơm tiêm nhựa vô khuẩn với 2 mũi, mỗi mũi cách nhau 7
ngày.
- Một nhóm 8 chuột không tiêm dùng làm chứng âm.
1.2.3. Lấy máu chuột, tách huyết thanh
- 7 ngày sau khi tiêm mũi thứ 2, toàn bộ chuột được lấy máu tim riêng rẽ. Máu
được chứa trong các tuýp eppendorf.
- Ủ các tuýp máu ở 37oC / 60 phút.
- Để ở tủ lạnh 4oC qua đêm.
- Ly tâm các mẫu máu ở 3000 vòng/ phút x 30 phút ở nhiệt độ 4oC.
- Chắt lấy huyết thanh sang tuýp eppendorf mới, lượng huyết thanh cần lấy ở
mỗi tuýp là 200µl.
- Huyết thanh chuẩn được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm mỗi nhóm 8 tuýp, sau
đó chúng được hộn chung vào tuýp và ký hiệu RA và RB.
- Huyết thanh thử được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm mỗi nhóm 8 tuýp sau đó
chúng được hộn chung vào tuýp ký hiệu VA và VB.
- Huyết thanh của 8 chuột chứng được hộn chung thành 1 týp ký hiệu là CA (-).
- Tất cả các huyết thanh được bất hoạt 56oC /30 phút.
- Bảo quản ở - 20 oC cho đến khi làm thử nghiệm trung hoà.
1.2.4. Pha loãng huyết thanh
- Huyết thanh chuẩn và huyết thanh thử được pha loãng trong môi trường MEM
2% FBS để có 3 độ pha là 1/80 1/160 và 1/320.
- Pha huyết thanh chứng dương để có độ pha loãng 1/80 và 1/160.
- Pha huyết thanh chứng âm để có độ pha loãng pha 1/10.
- Pha loãng huyết thanh chứng âm 1/10:0,5 ml huyết thanh + 4,5 ml MEM
2%FBS.
1.2.5. Pha chủng vi rút viêm não thử thách có hiệu giá là: 100- 200PFU/ 200µl
Ký hiệu chủng ở độ pha này là: CV.
1.2.6. Trung hoà huyết thanh và vi rút
- Lấy 1 ml của mỗi độ pha huyết thanh được chuẩn bị tại mục 5.3.4 trộn với 1 ml
chủng CV; 2 ml chủng CV trộn với 2 ml MEM 2% FBS.
- Đặt vào bể ổn nhiệt 37oC / 90 phút.
- Lấy ra, làm lạnh trong nước đá.
1.2.7. Gây nhiễm trên tế bào Vero hoặc BHK-21
- Tế bào đã được nuôi cấy 1 lớp trong phiến 6 giếng.
- Hút bỏ môi trường nuôi cấy trong các giếng sao cho còn khoảng 0,5
ml/giếng.
- Đánh dấu các độ pha trên các giếng.
- Nhỏ 200µl hỗn dịch (huyết thanh + vi rút) vào mỗi giếng. Mỗi nồng độ cấy 2
giếng; Hỗn dịch CV- MEM 2% FBS nhỏ 10 giếng.
- Để phiến trong tủ ấm 37OC, 5%CO2 trong 90 phút để vi rút tiếp xúc với tế bào.
1.2.8. Phủ thạch
- Cho vào mỗi giếng 3 ml môi trường thạch MEM 1% Methylcellulose.
- Ủ 37oC/5%CO2 trong 4-5 ngày.
1.2.9. Cố định và nhuộm tế bào
- Ngày thứ 5 hút hết môi trường trong giếng.
- Cho vào mỗi giếng 1 ml dung dịch nhuộm.
- Để phiến ở nhiệt độ phòng 15-20 phút.
- Rửa phiến dưới vòi nước.
- Đếm plaque bằng mắt thường.
1.2.10. Đọc và tính kết quả
Theo phần mềm hoặc công thức tính hiệu giá kháng thể trung hoà:
* Tỉ lệ giảm đám hoại tử được tính theo công thức:
S: số plaque trung bình của mỗi nồng độ huyết thanh pha.
CV số plaque trung bình của CV/giếng.
* Hiệu giá kháng thể trung hoà được tính theo công thức sau:
Z: logarit của hiệu giá kháng thể trung hoà giảm 50% đám hoại tử
Y: tỉ lệ giảm đám hoại tử của thử nghiệm.
x: số nghịch đảo của độ pha loãng.
1.3. Đánh giá thử nghiệm
Thử nghiệm có giá trị khi:
- Không có dấu hiệu tế bào bị nhiễm khuẩn hay nấm mốc trên các giếng
- Số plaque trung bình của 10 giếng chứng nằm trong khoảng 50-150.
- Hiệu giá huyết thanh chứng dương ≥ 1,5.
- Hiệu giá huyết thanh chứng âm ≤ 1.
Phụ lục 6