Luận án Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút Beijing-1 để ứng dụng sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam

AINS CIRCULATING IN VIETNAM Nguyen Thi Ly1, Huynh Thi Phuong Lien2, Do Tuan Dat2, Nguyen Kim Bach1, Nguyen Hoang Tung1, Ha Thi Thu3, Dinh Duy Khang3, 1National Institute for Control of Vaccines and Biologicals (NICVB) 2Vaccine and Biological Products One Member Limited Company (VABIOTECH) 3Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) To whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected] Received: 13.8.2020 Accepted: 15.12.2020 SUMMARY Since 2006, the inactivated Japanese encephalitis vaccine has been studied and produced by the VABIOTECH company from the Beịing-1 strain on Vero cells. Vaccines produced from the materseed and working seed virus have been evaluated at laboratory and clinical scale in humans. The results showed that the vaccine was safe and created 100% protective antibodies after the booster dose. To officially put this vaccine into production and mass use, the master seed virus BV-MSV0210 and working seed virus BV-WSV-0310 with the reference standard strain JEV Beijing-Kanonji has been tested for genetic stability. By the method of Sanger sequencing and genetic analysis software, we have evaluated the similarity of nucleotide and proteinsequencesof the E antigenencoding gene. The results showed that the seed virus similarity of amino acids and nucleotides is 100% compared with the reference strain. Thus, it can be concluded, the seed virus has antigen stability. Nucleotide and amino acid gene sequences of E genomic regions of the two seed lots were compared with virus strains isolated from human, pig and mosquito in Vietnam. The results showed that the nucleotide similarity of seed virus compared with the JEV strains isolated from humans ranged from 86.67 to 97.54%; from pigs is 87.47 to 88.33%, and from mosquitoes is 86.05 to 99%. Meanwhile, the amino acid similarity of the seed virus with the JEV strains isolated from humans ranged from 96.73 to 99.02%; from pigs is 98.00 to98.40% and from mosquitoes 94.55 to 98.40%. The sequence of amino acids in the epitope producing neutralizing antibodies of the seed virus did not differ from that of the JEV strain circulating in humans isolated in 2014. Keywords: Beijing-1 strain, Master Seed Virus strain, Working Seed Virus strain, Envelope protein gene, nucleotide homology, amino acid similarity, neutralizing antibody-produce epitopes. INTRODUCTION Japanese Encephalitis virus has many strains (about 290 strains have been isolated in Asia), belonging to 5 genotypes. However, not all strains can be used to produce human vaccines. In order to be selected for the production of vaccines for human use, the virus strain needs to meet many criteria as prescribed by the World Health Organization. Currently, most strains used to produce vaccines belong to genotype 3 such as: Nakayama strain; Beijing -1; Beijing-3; SA-14-14-2 (Sharma et al., 2014; Huynh Phuong Lien et al., 2011). According to statistics, Japan is the first research country to produce the first inactivated JE vaccine with strains of Nakayama and/or Beijing-1. However, the actual clinical research results show that the Beijing-1 strain has superior immunity compared to the Nakayama strain. Therefore, since 1989, the production of the JE vaccine was officially switched to use the strain Beijing-1. After Japan, China also researched and produced vaccines using strains Beijing-3 and SA-14-14-2. Subsequently, Korea started using the Nakayama strain; India and Austria used the strain SA-14-14-2. In Vietnam, in 1989 Vabiotech company researchedand used the Nakayama strain to produce inactivated JE vaccine on mouse brains. The vaccine has been put into mass use since the early 1990s up to now with very good protection results. From 2006 up to now, Vabiotech company has researched and developed a technological process to produce inactivated JE vaccines on Vero cells from Beijing-1 strain to gradually replace vaccines produced in the brain of mice today. This new vaccine has gone through a number of stages such as the establishment of a Master Seed Bank with code BV-MSV-0210 and a Working Seed Bank with code BV-WSV-0310.The assessment and monitoring of the quality of the strains produced by the time of preservation and over the quality of 10 batches of finished vaccines at the laboratory scale and on the clinical scale in humans have been carried out from 2013-2018. The results showed that the vaccine was safe and created 100% protective antibodies after the booster injection. To officially put this vaccine into production and mass use, the evaluation of the E gene region stability (specific protective antibody-forming region) of these strains compared with the original strain and the similarity of nucleotides and amino acids with the JEV strains circulating in Vietnam is essential to confirm whether the vaccine using this batch of strains is really effective in preventing the disease from the JEV strains circulating in Vietnam. For that reason, we performed E gene sequencing and analysis of nucleotide and amino acid similarity of master seed virus (MSV) batch BV-MSV-0210 and working seed virus (WSV) batch BV-WSV-0310 with the original standard strain (Reference JEV Beijing-Kanonji) provided by Kanonji, Japan to assess genetic stability and compare with existing JEV strains in Vietnam to evaluate antigen similarity. In this study, we present some results on the E gene region similarity of 2 batches of Beijing1 strains being used in JE vaccine production with standard virus strains and JEV strains circulating in Viet Nam. MATERIALS AND METHODS The object of study is the seed bank of batch BV-MSV-0210 and the seed bank for production batch BV-WSV-0310. Reference JEV BeijingKanonji provided by Kanonji, Japan, is the strain used to produce 2 batches of seed strains used in research. Total RNA was extracted and purified from each sample using the QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen). E gene region was amplified by RT-PCR using OneStep PCR Kit (Qiagen) with primer pair: JEV-E-p1: 5’TTCAACTGTCTGGAATGG-3'; JEV- E-p2: 5’AGCATGCACATTGGTAGCT- A-3 'with the program: 50°C for30 minutes, 95°C for15 minutes; 30 cycles (94°C for 1 minute, 50°C for 1 minute, 72° C for 1 minute), 72°C for10minutes, hold at 4oC. PCR products were tested on the 1% agarose gel. The band containing the PCR product is eluted and purified using the QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) for sequencing. Gene sequencing was performed with Applied Biosystems™ Sanger Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) and ABI 3500 gene sequencing machine of the Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology. E gene sequences were analyzed using available software on the internet such as Blast, BioEdit, MEGA6.0 to evaluate the similarity and build phylogenetic trees based on regional sequence E gene of 2 strains Beijing-1 with standard strain and JEV strains isolated from humans, pigs, and mosquitoes in Vietnam from 1964 to 2014 (Table 1). Analysis of E region antigen epitopes was conducted according to the method of Luca et al. (2012). RESULTS Results of E gene amplification of master seed, working seed, and reference strains The gene encoding the E antigen of the master seed strain BV-MSV-0210, working seed strain BV-WSV-0310 and the reference standard strain of JEV Beijing-Kanonji were amplified by RT- PCR. The results showed that the PCR product is very specific, without byproducts, the size is equivalent to the length of E gene according to theoretical calculations (about1500 encoding E antigens of master seed and working seed strains PCR products were collected by gel eluted method, purified by QIAquick PCR Purification Kit, and sequenced by ABI 3500 gene sequencing machine. After sequencing, we used specialized software programs such as Blast, BioEdit, MEGA6.0 ... to analyze, evaluate the similarity and build phylogenetic trees based on bp). Results are shown in Figure 1. genes of analysis and of sequencing Results Figure 1 . Agarose gel 1% electrophoresis for testing RT - PCR products amplified gene encoding E antigens of strains: original strain BV - MSV - 0210 ( lane No. 1); production strain BV - WSV - lane No. 2); Standard 0310 ( strain reference original JEV Beijing - Kanonji lane No ( . . M: Farmentas 1 kb DNA ladder. 3) M 1 2 3 1500 bp - bp 1000 - the E region sequence of the master seed BV- MSV-0210and working seed BV- WSV0310strains. The results showed that the gene encoding E antigen has a length of 1500 bp, a G/C ratio of 52%, which encodes a protein with a length of 500 amino acids. The length and nucleotide and protein sequences of the gene coding for E- antigen the MSV, WSV and reference strain are completely identical. These strains have 100% similarity for both nucleotides and amino acids. However, when comparing the nucleotode and amino acid sequences of the seed strains with the gene sequences encoding E antigens of JEV strains isolated in Vietnam, the similarity percentage is very different (Table 1). Based on the results of comparing the nucleotide and protein sequences of the gene coding for E antigen of MSV and WSV strains compared with the reference strain (BeijingKanonji) and the JEV strains isolated in Vietnam from 1964 to 2014, we created a phylogenetic tree to evaluate the nucleotide and protein correlation between strains studied (Figures 2 and 3). The results determined the epitope positions of protein E of the WSV and MSV strains Comparing nucleotide sequence and E gene protein of the WSV strain and MSV strain with JEV strains isolated in Vietnam, especially strains isolated from human, the results show that this rate ranged from 86.67 to 97.53% for nucleotides and 96.73 to 99.00% for proteins. We have examined whether the epitopes crucial to the immune response for neutralized antibodies change or not. Using the method of Luca et al. (2012), we determined the positions of the epitopes and the positions of amino acids that determine the epitope for antigenic properties. The results are shown in Table 2. As results, (Table 2) the amino acids of the epitopes of the gene encoding the E antigen in the WSV strain, the reference strain, the SA1414-2 vaccine strain, and the JEV strain isolated from humans in Vietnam in 2014 did not change. Table 1. Nucleotide and protein sequence similarity ratio of E antigen-encoding gene of master seed strain (BVMSV-0210) and working seed strain (BV-WSV-0310) compared to E-gene sequence of JEV strainsisolated in Vietnam over different years and from different hosts. Nucleotide and protein sequence No. Accession in Years of Hosts similarity ratio (%) GenBank isolation Nucleotide Protein 1 LC000631 1964 Human 97.45 98.31 2 AY376461 1986 Human 96.40 99.00 3 AY376463 1989 Human 96.73 99.20 4 HQ009263 2004 Human 97.53 97.20 5 LC000634 2007 Human 87.45 96.73 6 KP876007 2014 Human 86.67 97.04 7 AY376464 2001 Pig 88.33 98.40 8 AY376465 2002 Pig 88.27 98.40 9 HQ009265 2005 Pig 87.47 98.00 10 JEU70420 1979 Mosquito 99.00 98.06 11 AB933311 1994 Mosquito 88.05 98.22 12 AY376468 2002 Mosquito 88.33 98.40 13 JN574431 2005 Mosquito 87.80 98.04 14 LC000635 2010 Mosquito 87.54 96.77 15 LC000637 2011 Mosquito 86.05 94.55 Figure 2. Phylogenetic tree based on E gene nucleotide sequence of the WSV strain (BV-WSV-0310), MSV (BV-MSV-0210), original reference strain (Beijing-Kanoji), and the JEV strains isolated in Vietnam from 1964 to 2014. Figure 3. Phylogenetic tree based on E gene protein sequence of the WSV strain (BV- WSV-0310), MSV (BVMSV- 0210), original reference strain (Beijing- Kanoji), and the JEV strains isolated in Vietnam from 1964 to 2014. Table 2. Position of epitopes and positions of amino acids determining antigens of epitope on protein E of the WSV strain (BV- WSV-3010), reference strain (Beijing- Kanonji), JEV strain isolated in humans 2014 and vaccine strain SA14- 14-2. Domain II-fusion loopprotein E Domain I-IIhinge Side chains of Domain I Side chains of Domain III Position ofneutralizing epitopes 104 AA of the strain SA14- 106 107 52 126 136 275 179 337 360 302 387 14-2 (Luca et al.) G AA of the strain BV- G L Q I K S K I F G R WSV-3010 G AA of the strain 2014 _KP876007_Human G L Q I K S K I F G R _ProE G G L Q I K S K I F G R AA of the strain Kanonji G G L Q I K S K I F G R DISCUSSION Japanese Encephalitis virus (JEV) is the leading cause of viral encephalitis globally. The envelope protein of the JEV (protein E) facilitates virus binding on the cell surface and membrane fusion, which is the primary target of antibodies that neutralize the virus (Luca et al., 2012). Therefore, the efficacy of JE vaccine depends on the ability to produce antibodies to neutralize E protein. Since 2006, inactivated Japanese encephalitis vaccine has been researched and produced by Vabiotech company from Beịing-1 on Vero cell. The results of clinical trials on humans showed that the vaccine was safe and created 100% protective antibodies after the booster injection. To officially put this vaccine into production and mass use, the evaluation of genetic stability and E- antigens similarity of the WSV strain and MSV strain compared with the JEV strains circulating in Vietnam are essential. The gene encoding the E antigen of the seed lots includes the Master Seed Bank BV-MSV-0210 and the Working Seed Bank BV-WSV-0310 with the reference standard strain JEV Beijing-Kanonji were sequenced and analyzed for similarity. The results showed that 2 batches of WSV have the similarity of amino acids and nucleotides of 100% compared with the reference strains. Thus, it can be concluded that the MSV strain and the WSV strain have genetic stability. However, the question that needs to be answered is, do the strains used in production have similar antigens to neutralizing antibodies against JEV strains circulating in Vietnam? To answer this question, the E gene region nucleotide sequences of the two strains were compared with the E gene region sequences of JEV strains isolated from humans, pigs and mosquitoes in Vietnam and submitted in GenBank from 1964 to 2014 (Table 1). The results showed that, the similarity of the nucleotide of the strain compared with the strains VNNB isolated from humans ranged from 86.67 to 97.54%; from pigs is 87.47 to 88.33% and from mosquitoes is 86.05 to 99%.Meanwhile, the amino acid similarity of the strain compared to the strains of JEV isolated from human ranged from 96.73 to 99.02%; from pigs is 98.00– 98.40% and from mosquitoes 94.55 to 98.40%. Looking closely at the variation of the nucleotide sequence as well as the protein sequence of the JEV strains in Table 1, we can see that the similarity level decreases over time. For example, the nucleotide similarity of JEV isolated from humans in 1989 was 96.73% and protein was 99.20, by 2014 this similarity level was only 86.67% for nucleotides and 97.04. % for protein. So, is it because the pressure when using JE vaccine since 1990 has created mutant strains to gradually evade the protective ability of the vaccine? According to Roy el al. (2020), when the structure of the neutralizing antibody epitopes changes, the JEV can evade the protective ability of the neutralizing antibody produced by vaccines.To be able to elucidate this problem, we have used the method of Luca et al. (2012) to compare the amino acid sequence in the neutralizing antibody epitope region of Domain I, II and III of MSV strain, WSV strain and reference strain with JEV strains circulating in human isolates in 2014. Results showed that, no change of amino acids determining the configuration of antigens belonging to these epitopesfound (Table 2). That partly explains that vaccines produced by the WSV strains derived from the MSV strains still create 100% protective antibodies. According toDo Tuan Datet al. (2017), the JECEVAX vaccine produced from the MSL BV- MSV-0210 and the WSL BV-WSV-0310 was safe and hadeffective protection100%after the third injection. The titer of antibodies to neutralize GMT using the PRNT method increased after 2 doses of 2.09 logs and 3.04 logs after 3 doses.This result is equivalent to the vaccine of the same type of Japan (CCJEV) and the Republic of Austria (IXIARO).The protective effect of this vaccine was even better than that of the control group using the JEVAX vaccine (the vaccine being used in the expanded vaccination program in Vietnam, produced on mouse brain with Nakayama strain) only reached 99%. Some other vaccines currently circulating in Vietnam are Imojev (live chimeric vaccine, strain SA14-14-2, produced by France) or JEEV vaccine (made in India) also has a protective effect of 95–98%. CONCLUSION With the results obtained above, it can be confirmed that 2 lots of Beijing-1strains (BVMSV-0210 and BV-WSV-0310) produced by Vabiotech company have high genetic stability with standard strains. The nucleotide sequence similarity of the gene encoding E antigen of the WSV strain compared to the JEV strains circulating in Vietnam from 1964 to 2014 is from 86.67 to 97.54% in humans; 87.47– 88.33% in pigs and 86.05–99% in mosquitoes. Meanwhile, the amino acid similarity of the WSV strain compared to the strains of JEV isolated from human ranged from 96.73 to 99.02%; from pigs is 98.00-98.40% and from mosquitoes 94.55 to 98.40%. When comparing the amino acid sequence in the neutralizing antibodyepitopes of the WSV strain and the MSV strains with the JEV strain circulating in humans in 2014, there was no change of amino acids that determine the conformation of the antigen. REFERENCES Do Tuan Dat, Vu Dinh Them, Tong Thien Anh, Nguyen Thi Ly (2017) Safety and immunogenicity of Japanese encephalitis vaccine produced on Vero cells (JECEVAX) in children (stage II)”. J Prevent Med 27(6): 53-61. European Pharmacy, 2017. Page 1508-1509. Huynh Phuong Lien, Nguyen Anh Tuan, Tran Hang Nga, Nguyen Que Anh et al. (2011) Research and development of Japanese Encephalitis inactivated vaccine on vero cells. J Prevent Med 4(103), 2009: 86- 91. Luca VC, AbiMansour J, Nelson CA, Fremont DH (2012) Crystal Structure of the Japanese Encephalitis Virus Envelope Protein. J Virol 86: 2337–2346. Nguyen Thi Ly, Huynh Phuong Lien, Do Tuan Dat, Doan HuuThien, Pham Van Hung, Nguyen Thi Mai Huong (2018) Quality of Japanese encephalitis inactivated vaccine produced on Vero cells in Vietnam. National Biotechnology Conference 2018, October 26, 2018. Natural Science and Technology Publishing House, 2018, page 512. Roy U (2020) Structural and molecular analyses of functional epitopes and escape mutants in Japanese encephalitis virus envelope protein domain III. Immunol Res 22: 1–9. Sharma P, Mittal V, Chhabra M, Singh P, Chauhan LS, Rai A (2014) An Update on JE Vaccine Development and Use. J Commun Dis 46: 109–118. WHO TRS No. 963, (2007) Annex 1. Recommendations for Japanese encephalitis vaccine (inactivated) for human use. ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG VỀ GEN VÀ PROTEIN CỦA CHỦNG SẢN XUẤT VACCINE BEIJING-1 SO VỚI CÁC CHỦNG VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN ĐANG LƯU HÀNH TẠI VIỆT NAM NguyễnThị Lý1, Huỳnh Thị Phương Liên2, ĐỗTuấn Đạt2, Nguyễn Kim Bách1, Nguyễn Hoàng Tùng1, Hà Thị Thu1, Đinh Duy Kháng3 1Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và sinh phẩm y tế (NICVB) 2Công ty TNHH MTV vắc xin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) người, lợn và muỗi ở Việt Nam. Kết quả cho thấy, sự tương đồng về nucleotide của chủng giống so với các chủng virus VNNB phân lập từ người dao động từ 86,67 đến 97,54%; từ lợn là 87,47 đến 88,33% và từ muỗi là 86,05 đến 99%. Trong khi đó, sự tương đồng về amino acid của chủng giống so với các chủng virus VNNB phân lập từ người dao động từ 96,73 đến 99,02%; từ lợn là 98,0098,40% và từ muỗi là 94,55 đến 98,40%. Trình tự amino acid trong vùng epitope sinh kháng thể trung hòa của chủng giống không có sự khác biệt so với chủng virus VNNB lưu hành trên người phân lập năm 2014. Từ khóa: Chủng Beijing-1, Chủng giống gốc, chủng giống sản xuất, gen mã hóa kháng nguyên E, sự tương đồng nucleotide, sự tương đồng amino acid, epitope sinh kháng thể trung hòa. 1 Viện Công nghệ sinh học (IBT), Viện Hàn Lâm KH&CN Việt Nam (VAST) TÓM TẮT Từ năm 2006, vaccine viêm não Nhật Bản bất hoạt đã được nghiên cứu sản xuất bởi công ty VABIOTECH từ chủng Beịing-1 trên tế bào Vero. Vaccine sản xuất từ các lô chủng giống gốc và giống sản xuất đã được đánh giá ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô lâm sàng trên người. Kết quả cho thấy, vaccineđạt an toàn và tạo kháng thể bảo vệ 100% sau mũi tăng cường. Để chính thức đưa vắc xin này vào sản xuất và sử dụng đại trà, các lô chủng giống gồm chủng giống gốc BV-MSV-0210 và chủng giống sản xuất BV-WSV-0310 cùng chủng chuẩn tham chiếu JEV Beijing-Kanonji do Nhật Bản cung cấp đã được kiểm tra về tính ổn định di truyền. Bằng phương pháp giải trình tự Sanger và phân tích gen với các chương trình phần mềm khác nhau, chúng tôi đã đánh giá sự tương đồng về trình tự nucleotde và protein của gen mã hóa kháng nguyên E. Kết quả cho thấy, 2 lô chủng giống có sự tương đồng về amino acid và nucleotide là 100% so với chủng tham chiếu. Như vậy, có thể kết luận, chủng giống gốc và chủng giống sản xuất có tính ổn định về kháng nguyên. Trình tự nucleotide và amino acid vùng gen E của 2 lô chủng giống đã được so sánh với các chủng virus phân lập từ Phụ lục 3. Một số hình ảnh kết quả thí nghiệm trong nghiên cứu Chủng virút Beijing-1 BV-MSV-0210 Chủng virút Beijing-1 BV-WSV-0310 1 2 Môi trường lỏng I: Ống số 1 là chứng âm (và mẫu nghiên cứu); ống số 2 là chứng dương khi có Mycoplasma 1 2 Môi trường lỏng II: Ống số 1 là chứng âm (và mẫu nghiên cứu); ống số 2 là chứng dương khi có Mycoplasma Hình ảnh Mycoplasma trên môi trường đặc Chuột sau tiêm não 21 ngày Chuột sau tiêm phúc mạc 21 ngày Chuột chứng (không tiêm) Tiêm phúc mạc chuột ổ 1-3 ngày tuổi Tiêm não chuột ổ 1-3 ngày tuổi Chuột ổ sau tiêm phúc mạc 14 ngày Chuột ổ sau tiêm não 14 ngày Chuột chứng sau theo dõi 14 ngày Hình ảnh chai tế bào trước gây nhiễm trên 3 dòng thế bào Hình ảnh chai tế bào sau gây nhiễm 3ml/chaihỗn dịch trung hòa (vi rút thử thách (CV) với kháng huyết thanh đặc hiệu): Hàng 1 là kiểm tra vi rút ngoại lai cho chủng MSV-0210; Hàng thứ 2 là là kiểm tra vi rút ngoại lai cho tế bào đối chứng; Hàng 3 là kiểm tra vi rút ngoại lai cho chủng MWS-0310. Hình ảnh plaque (đám hoại tử- đốm trắng) của chủng sản xuất BV-MSV- 0210 ở các độ pha 10-6; 10-7; 10-8 Hình ảnh plaque (đám hoại tử- đốm trắng) của chủng sản xuất BV-WSV- 0310 ở các độ pha 10-6; 10-7; 10-8 10-6 10-7 10-8 10 -6 10-7 10-8 Phụ lục 4. Phụ lục 5. Các quy trình kỹ thuật kiểm định THỬ NGHIỆM VÔ TRÙNG 1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH - Kiểm tra vô khuẩn phải được tiến hành trong phòng dành riêng cho thử nghiệm vô khuẩn. - Phương pháp: cấy trực tiếp. 1.1. Thể tích cấy - BTP và BTP cuối cùng: 1ml mẫu thử/1 ống môi trường. - Vắc xin thành phẩm: Tùy theo thể tích đóng trong mỗi lọ vắc xin mà lượng mẫu lấy để thử nghiệm có khác nhau. Cụ thể: Thể tích đóng ống (ml) Thể tích vắc xin lấy ra (ml) Thể tích cấy/ống MT (ml) < 1 Toàn bộ Toàn bộ Từ 1 đến < 2 1 1 > 4 2 1 1.2. Chuẩn bị - Ghi số loạt và đánh số ống môi trường. - Sát trùng các chai đựng BTP, BTP cuối cùng và các lọ vắc xin cần thử bằng dung dịch cồn 700. 1.3. Tiến hành - Mở lần lượt nắp các chai đựng BTP, BTP cuối cùng và các lọ vắc xin. - Mở lần lượt nút bông của các ống môi trường Thioglycolate và Soybean. - Dùng pipet vô trùng để lấy sinh phẩm từ trong mỗi chai (hoặc lọ), cấy trực tiếp bằng cách nhỏ từ từ mẫu thử vào tuýp môi trường. - Thể tích cấy: mục 6.1. - Sau khi cấy hơ miệng ống môi trường cẩn thận và đậy kín nút bông. - Đối với vắc xin đông khô, phải hồi chỉnh bằng nước hồi chỉnh. - Các thao tác cứ lặp đi lặp lại như vậy cho đến hết số chai (hoặc lọ) mẫu thử. 1.4. Cấy chuyển - Đối với vắc xin tả: (bao gồm cả bán thành phẩm và bán thành phẩm cuối cùng) phải cấy chuyển vào ngày thứ 7. - Số lượng môi trường: mục 4.3.3. - Thể tích cấy: 1ml/1 ống môi trường. - Không cấy chuyển các ống chứng môi trường. 1.5. Nhiệt độ nuôi cấy Sau khi các thao tác trong phòng vô trùng, các ống môi trường sẽ được xếp vào 2 giá và giữ ở hai nhiệt độ khác nhau.  BTP và BTP cuối cùng: - Môi trường Thioglycolate: yêu cầu nhiệt độ 32,5±2,50C - Môi trường Soybean: yêu cầu nhiệt độ 22,5±2,50C  Vắc xin thành phẩm: - Môi trường Thioglycolate: 2/3 ống môi trường: 32,5±2,50C và 1/3 ống: 22,5±2,50C - Môi trường Soybean: 22,5±2,50C 1.6. Thời gian nuôi cấy 14 ngày. 1.7. Theo dõi sau thử nghiệm - Cả hai loại môi trường đều được theo dõi hàng ngày và ghi kết quả theo dõi vào phiếu theo dõi thử nghiệm vô khuẩn vào các ngày 1, 3, 5, 7, 10 và 14. 2. KẾT QUẢ 2.1. Cách đọc kết quả - Không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm: Cả 2 loại môi trường đều trong, không bị vẩn đục. Môi trường Thioglycolate không bị mất lớp chỉ thị màu ở phía trên. - Có sự phát triển của vi khuẩn và nấm: Cả 2 loại môi trường đều bị vẩn đục. Môi trường Thioglycolate bị mất lớp chỉ thị màu ở phía trên. 2.2. Giá trị của thử nghiệm - Loạt môi trường sử dụng để kiểm tra vô khuẩn đạt yêu cầu về thử nghiệm kiểm tra chất lượng môi trường. 2.3. Tiêu chuẩn chấp thuận - Không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm sau 14 ngày theo dõi. 2.4. Hồ sơ - Kết quả kiểm tra được báo cáo ở Biểu mẫu đính kèm theo SOP#QC-BIO-01 đã được phê duyệt và lưu giữ ở bộ phận QA, phòng QM. 2.5. Thử nghiệm nhắc lại  Điều kiện nhắc lại Khi không đạt tiêu chuẩn ( mục 7.2 và 7.3). - Nếu có ống môi trường nuôi cấy bị nhiễm khuẩn: phải tiến hành phân lập và định danh vi sinh vật.  Thử nghiệm nhắc lại lần 1 - Thực hiện với số lượng mẫu và ống môi trường bằng lần thử đầu. - Thử nghiệm đạt yêu cầu khi đạt mục 7.2 và 7.3. - Nếu có sự phát triển của vi sinh vật trong bất kỳ ống môi trường nuôi cấy nào: phải phân lập và định danh vi sinh vật. So sánh kết quả với lần thử đầu: Nếu không có sự khác biệt, sản phẩm bị coi là không đạt vô khuẩn và phải hủy bỏ. Nếu có sự khác biệt, phải tiến hành thử nghiệm nhắc lại lần 2.  Thử nghiệm nhắc lại lần 2: - Thực hiện với số lượng mẫu và ống môi trường gấp đôi lần thử đầu. - Thử nghiệm đạt yêu cầu khi đạt mục 7.2 và 7.3. Nếu phát hiện dù chỉ 1 ống môi trường có bất kỳ loại vi khuẩn tạp nhiễm, loạt sản phẩm đó được kết luận là không đạt yêu cầu về tiêu chuẩn vô khuẩn, phải hủy bỏ. KIỂM TRA VI RÚT NGOẠI LAI TRÊN TẾ BÀO 1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 1.1. Kiểm tra virus ngoại lai trên tế bào chứng trong sản xuất vắc xin/sản xuất chủng 1.1.1. Theo dõi các chai tế bào chứng + Theo dõi sự hủy hoại tế bào (CPE) trong các chai tế bào vào ngày thứ 1, 3, 5, 7, 9, 11, 14 và ghi kết quả. + Ngày thứ 14 - sau khi quan sát không thấy có CPE, hộn nước nổi trong các chai tế bào, tiến hành kiểm tra virus ngoại lai gây hấp phụ hồng cầu + Nước nổi hộn trong các chai tế bào được tiến hành làm các thử nghiệm kiểm tra các tác nhân ngoại lai: - Thử nghiệm kiểm tra vô khuẩn - Thử nghiệm kiểm tra Mycoplasma - Thử nghiệm kiểm tra vi khuẩn lao (chỉ áp dụng với tế bào PMKc) - Kiểm tra các virus ngoại lai trên các dòng tế bào khác 1.1.2. Kiểm tra virus ngoại lai trên các dòng tế bào 3.1.2.1. Chuẩn bị tế bào: - Số lượng: 6 chai 25cm2 tế bào trong đó 5 chai tế bào/mẫu thử và 1 chai tế bào/mẫu - Tế bào kín đều một lớp, môi trường trong màu vàng cam. - Viết tên mẫu thử và ngày tiến hành kiểm tra trên các chai nuôi cấy tế bào. 3.1.2.2. Pha môi trường duy trì tế bào (MEM 2% FBS) theo công thức ở bảng. STT Thành phần Công thức pha 1000 ml 1 MEM(ml) 980 2 FBS(ml) 20 - Cách pha: Hút môi trường MEM và FBS vào chai thủy tinh. Lắc đều. 3.1.2.3. Kiểm tra trên tế bào - Loại bỏ môi trường nuôi cấy trong các chai tế bào. - Rửa tế bào trong dung dịch Hank’s: cho 3ml Hank’s vào mỗi chai, láng đều bề mặt tế bào, hút bỏ Hank’s. - Nuôi cấy trên tế bào: Mẫu chứng (1 chai tế bào): 3 ml môi trường duy trì MEM 2% FBS/chai. Mẫu thử (5 chai tế bào): 3 ml mẫu thử /chai. - Cho 9 ml môi trường duy trì MEM 2% FBS vào mỗi chai. 3.1.2.4. Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy - Nuôi cấy trong tủ ấm (36,5 ± 0,5)oC. - Thời gian nuôi cấy 14 ngày. - Theo dõi tế bào dưới kính hiển vi soi ngược và ghi kết quả vào ngày thứ 1, 4, 7, 11 và 14. 1.2. Kiểm tra virus ngoại lai trong ngân hàng tế bào (MCB, WCB) 1.2.1. Chuẩn bị mẫu thử - 10 ống tế bào MBC, WBC được lấy ra từ nitrogen lỏng, nuôi cấy. Sau 2-7 ngày tế bào kín một lớp, quan sát không thấy có CPE, hộn nước nổi trong các chai tế bào, tiến hành kiểm tra virus ngoại lai gây hấp phụ hồng cầu . - Số lượng chai tế bào: 10 chai tế bào. 1.2.2. Kiểm tra virus ngoại lai trên các dòng tế bào (thực hiện như mục 3.1.2) 1.3. Kiểm tra virus ngoại lai trong chủng virus (MSV, WSV) 1.3.1. Xử lý mẫu - Trung hòa chủng virus với kháng huyết thanh đặc hiệu trước khi tiến hành thử nghiệm kiểm tra VRNL. - Pha loãng huyết thanh bằng Hank’s ở độ pha thích hợp để trung hòa hết được với hỗn dịch virus. - Xử lý mẫu: Mẫu chứng: Trộn đều kháng huyết thanh với Hank’s theo tỉ lệ 1:1 Mẫu thử: Trộn đều chủng virus với kháng huyết thanh theo tỉ lệ 1:1. - Ủ trong bể ổn nhiệt 37oC trong thời gian 60 - 90 phút tùy thuộc vào phản ứng trung hòa của từng loại virus. 1.3.2. Kiểm tra virus ngoại lai gây CPE trong chủng virus trên tế bào 3.3.2.1. Chuẩn bị tế bào (thực hiện như mục 3.1.2). 3.3.2.2. Pha môi trường duy trì tế bào (MEM 2% FBS) thực hiện như mục 3.1.2.2) 3.3.2.3. Nuôi cấy trên tế bào: - Rửa tế bào trong dung dịch Hank’s: cho 3ml Hank’s vào mỗi chai, láng đều bề mặt tế bào, hút bỏ Hank’s. - Nuôi cấy trên tế bào: Mẫu chứng (1 chai tế bào): 3 ml (KHT + Hank’s)/chai. Mẫu thử (5 chai tế bào): 3 ml hỗn dịch chủng sau khi trung hòa/chai. - Hấp phụ: 2 giờ trong tủ ấm (36,5 ± 0,5)oC. - Hút bỏ nước nổi trong các chai, cho 09 ml môi trường duy trì MEM 2% FBS vào mỗi chai. 3.3.2.4. Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy - Nuôi cấy trong tủ ấm (36,5 ± 0,5)oC. - Thời gian nuôi cấy 14 ngày. - Theo dõi tế bào dưới kính hiển vi soi ngược và ghi kết quả vào ngày thứ 1, 4, 7, 11 và 14. 1.3.3. Kiểm tra virus hấp phụ hồng cầu + Kiểm tra virus hấp phụ hồng cầu trên tế bào đã gây nhiễm. - Loại bỏ môi trường nuôi cấy trong các chai tế bào sau 14 ngày theo dõi. - Kiểm tra virus hấp phụ hồng cầu trên các chai tế bào 2. KẾT QUẢ 2.1. Giá trị của thử nghiệm - Ít nhất 80% số chai tế bào của mẫu thử duy trì cho đến khi kết thúc thời gian quan sát. 2.2. Đọc kết quả - Kết quả dương tính (+), có virus ngoại lai: tế bào bị huỷ hoại, quan sát được CPE hoặc virus hấp phụ hồng cầu. - Kết quả âm tính (-), không có virus ngoại lai: tế bào không bị huỷ hoại và không có virus hấp phụ hồng cầu. 2.3. Tiêu chuẩn chấp thuận - Không có hủy hoại tế bào (CPE) trong các chai tế bào và không có virus hấp phụ hồng cầu. KIỂM TRA VI RÚT NGOẠI LAI TRÊN ĐỘNG VẬT 1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 1.1. Chuẩn bị mẫu thử - Tùy thuộc vào từng loại chủng virus, nếu cần sẽ tiến hành trung hòa chủng virus với kháng huyết thanh. - Chủng virus được trung hòa với kháng huyết thanh ở độ pha loãng phù hợp theo tỉ lệ 1:1 - Ủ trong bình ổn nhiệt 370C/90 phút. 1.2. Kiểm tra trên chuột ổ  Số lượng mẫu thử: 3ml  Số lượng chuột/ ổ: 10con/ ổ  Độ tuổi: 1 ngày tuổi  Số lượng chuột kiểm tra: 20 con/ đường tiêm não 20 con/ đường tiêm phúc mạc 10 con/ nhóm chứng  Liều tiêm: Đường tiêm não: 0,01ml/con Đường tiêm phúc mạc: 0,1ml/con Nhóm chứng: không tiêm  Theo dõi chuột: - Thời gian theo dõi động vật thí nghiệm là 14 ngày. - Ghi nhật ký tình trạng sức khỏe chuột vào các ngày 1,3,5,7,10,14. 1.3. Kiểm tra trên chuột nhắt trưởng thành  Số lượng mẫu thử: 7ml  Trọng lượng chuột: 15-20 gram/con  Số lượng chuột kiểm tra: 10 con/ đường tiêm não 10 con/ đường tiêm phúc mạc 10 con/ nhóm chứng  Liều tiêm: Đường tiêm não: 0,03ml/con Đường tiêm phúc mạc: 0,5ml/con Nhóm chứng không tiêm  Theo dõi chuột: - Thời gian theo dõi động vật thí nghiệm là 21 ngày. - Ghi nhật ký tình trạng sức khỏe chuột vào các ngày 1,3,5,7,10,14, 17, 21. 1.4. Kiểm tra trên chuột lang  Số lương mẫu: 28ml  Trọng lượng chuột: 350-450 gram/con  Số lượng chuột kiểm tra: 5 con/ đường tiêm phúc mạc 5 con/ nhóm chứng  Liều tiêm: Đường tiêm phúc mạc: 5ml/con Nhóm chứng không tiêm  Theo dõi chuột: - Thời gian theo dõi động vật thí nghiệm là 42 ngày. - Ghi nhật ký tình trạng sức khỏe chuột vào các ngày 1,3,5,7,10,14, 17, 21, 24, 28, 32, 35, 38, 42. 1.5. Trên thỏ trưởng thành (chỉ áp dụng đối với chủng virus được sản xuất từ tế bào thận khỉ tiên phát)  Số lượng mẫu: 20 ml  Trọng lượng: 1,8 - 2,5 kg/con  Số lượng thỏ kiểm tra: 5 con/ đường tiêm dưới da 5 con / đường tiêm trong da 2 con/ nhóm chứng  Liều tiêm: Đường tiêm dưới da: 2ml/con Đường tiêm trong da: 1ml/con Nhóm chứng: không tiêm  Theo thỏ sau tiêm: - Thời gian theo dõi động vật thí nghiệmlà 30 ngày. - Ghi nhật ký tình trạng sức khỏe chuột vào các ngày 1,3,5,7,10,14, 17, 21, 24, 28, 30. 1.6. Trên trứng gà có phôi(chỉ áp dụng đối với ngân hàng tế báo gốc, ngân hàng tế bào sản xuất)  Số lượng mẫu: 4ml  Độ tuổi phôi trứng gà: 9-11 ngày tuổi  Số lượng trứng gà có phôi kiểm tra: 10 quả/ đường tiêm túi noãn 5 quả/ nhóm chứng  Liều tiêm: Đường tiêm túi noãn: 0,2ml/quả Nhóm chứng không tiêm  Theo dõi trứng gà sau gây nhiễm: - Thời gian theo dõi là 5 ngày. - Ghi nhật ký tình trạng sống/chết của phôi trứng gà hàng ngày. - Sau 5 ngày theo dõi tiến hành lấy dịch niệu kiểm tra ngưng kết hồng cầu với hồng cầu gà.. 2. KẾT QUẢ 2.1. Đọc kết quả - Trên chuột ổ: đọc kết quả vào ngày 14. - Trên chuột nhắt trưởng thành: đọc kết quả vào ngày 21. - Trên chuột lang: đọc kết quả vào ngày 42. - Trên thỏ trưởng thành: đọc kết quả vào ngày 30. - Trên trứng gà có phôi: đọc kết quả vào ngày 5. 2.2. Tiêu chuẩn chấp thuận  Trên chuột ổ: ≥ 80% chuột sống khoẻ mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý.  Trên chuột nhắt trưởng thành: ≥ 80% chuột sống khoẻ mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý.  Trên chuột lang: - ≥ 80% chuột sống khoẻ mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý. - Các cơ quan nội tạng không có dấu hiệu bất thường.  Trên thỏ trưởng thành: - ≥ 80% thỏ sống khoẻ mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý.  Trên trứng gà có phôi: - ≥80% phôi trứng gà sống khoẻ mạnh. Dịch niệu: không có ngưng kết với hồng cầu gà HIỆU GIÁ VI RÚT TRÊN CHUỘT 1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 1.1. Chuẩn bị động vật thí nghiệm + Chuột được chuẩn bị trước ngày gây nhiễm 2 ngày và được chọn ngẫu nhiên với số lượng: - 10 con cho mỗi độ pha loãng x 5 độ pha + Chuột được đánh dấu và ghi nhãn mỗi lồng theo từng loại, từng độ pha loãng. Nhãn cho mỗi lồng chuột bao gồm các thông tin sau: tên sản phẩm, loạt số, màu đánh dấu chuột, ngày tiêm và ngày kết thúc thử nghiệm. 1.2. Pha loãng chủng vi rút Pha loãng mẫu thử bậc 10 bằng dung dịch pha loãng như sau: Tuýp số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Độ pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 Mẫu thử (ml) D2pha loãng (ml) 0,2 1,8 0,2 1,8 0,2 1,8 0,2 1,8 0,2 1,8 0,2 1,8 0,2 1,8 0,2 1,8 0,2 1,8 1.3. Tiêm chuột - Sử dụng các độ pha từ 10-5 đến 10-9 để tiêm chuột - Sát trùng vị trí tiêm. Dùng bơm tiêm 1ml lấy hỗn dịch vi rut đã pha loãng ở trên. - Liều tiêm: 0,03ml/1chuột. - Đường tiêm: Não. - Thay bơm tiêm khi tiêm với độ pha mới. 1.4. Theo dõi chuột - Theo dõi các dấu hiệu chuột bị nhiễm vi rút VNNB: liệt 1-2 chân trước; liệt 1-2 chân sau, liệt 1 chân trước 1 chân sau hoặc chết do bị liệt chân. - Thời gian theo dõi súc vật thí nghiệm là 14 ngày. - Theo dõi tình trạng nhiễm vi rút VNNB của chuột bắt đầu từ sau tiêm 3 ngày và ghi nhật ký tình trạng chuột hàng ngày trong thời gian theo dõi 14 ngày. 2. KẾT QUẢ 2.1 Tính kết quả: Tính kết quả theo công thức Reed and Muench Lg LD50 = Lg A - k x 50 - a b - a Trong đó: A: Độ pha loãng gây chết sát trên 50% tổng số chuột a: % số chuột chết sát dưới 50% b: % số chuột chết sát trên 50% k: log của độ pha loãng 2.2. Tiêu chuẩn chấp thuận Hiệu giá vi rút trong chủng gốc giống, chủng sản xuất VNNB≥10-6.0 HIỆU GIÁ VI RÚT TRÊN TẾ BÀO 1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 1.1 Pha loãng mẫu thử - Pha loãng mẫu thử bậc 10 trong tuýp Eppendorf, ví dụ như sau: Tuýp số 1 2 3 4 5 6 7 8 Độ pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 Mẫu thử (ml) Dung dịch LE+BA (ml) 0,1 0,9 0,1 0,9 0,1 0,9 0,1 0,9 0,1 0,9 0,1 0,9 0,1 0,9 0,1 0,9 1.2 Gây nhiễm trên tế bào + Gây nhiễm trên phiến tế bào 6 giếng: - Đánh dấu các độ pha trên các giếng. - Hút bỏ môi trường nuôi cấy trong giếng. - Cấy 200 l hỗn dịch virus đã pha loãng ở trên (03 độ pha cuối) vào mỗi giếng, mỗi độ pha 2 giếng. + Cho tất cả các phiến đã cấy vào tủ ấm CO2 (36,5oC ± 0,5oC; 4,5% ± 0,5% CO2) để ủ 90 phút. Cứ 30 phút láng 1 lần. 1.3 Phủ thạch và nhuộm cố định tế bào 1.3.1 Phủ thạch - Cho 3 ml môi trường phủ thạch MEM 1% Methylcelluse vào mỗi giếng. - Ủ các phiến 4 ngày trong tủ ấm CO2 (36,5oC ± 0,5oC; 4,5% ± 0,5% CO2). 1.3.2 Cố định và nhuộm tế bào - Hút bỏ môi trường nuôi cấy trong các giếng. - Cho 0,5 ml dung dịch nhuộm cố định vào và ủ 30 - 45 phút ở nhiệt độ phòng 20 – 25oC. - Rửa phiến dưới vòi nước chảy. Để khô và đọc kết quả. 2. KẾT QUẢ - Đếm số plaque có trong mỗi giếng: các plaque là những đốm trắng có thể nhìn thấy bằng mắt thường ở mặt đáy của các giếng. - Dùng bút dạ đánh dấu và đếm các plaque rồi ghi số plaque đọc được ở trên nắp mỗi giếng. - Tính kết quả trung bình của tất cả các giếng. 2.1.Tính kết quả - Công thức tính: Hiệu giá virus (PFU/ml) = a/b.c Trong đó: a: Số plaque trung bình; b: Độ pha loãng; c: số ml hỗn dịch virus cấy - Ví dụ: ở độ pha 10-5: Giếng 1: 167 plaques Giếng 2: 165 plaques Số plaque trung bình: 166 plaque Hiệu giá virus (PFU/ml) = 166 /(10-5x 0,2) = 8,3 x107 (PFU/ml) 2.2. Tiêu chuẩn chấp nhận - Hiệu giá virus trong bán thành phẩm thô vắc xin VNNB ≥ 107 (PFU/ml). - Hiệu giá virus trong chủng virus thử thách (CV) VNNB ≥ 105 (PFU/ml). - Hiệu giá virus trong chủng gốc giống, chủng sản xuất VNNB ≥ 106(PFU/ml). AN TOÀN CHUNG a. Chuẩn bị mẫu thử - Lấy đủ số lượng mẫu theo yêu cầu. - Mẫu dạng dung dịch: Hút đủ lượng mẫu theo yêu cầu của thử nghiệm và các bơm tiêm vô trùng. - Mẫu dạng đông khô: Hoàn nguyên với dung dịch nước hồi chỉnh rồi hút đủ lượng mẫu theo yêu cầu của thử nghiệm và các bơm tiêm vô trùng. - Trường hợp mẫu cần pha loãng: Pha loãng mẫu về nồng độ yêu cầu rồi hút đủ lượng mẫu theo yêu cầu của thử nghiệm và các bơm tiêm vô trùng. b. Chuẩn bị chuột - Chuột nhắt và chuột lang thí nghiệm được cho ăn, uống đầy đủ trước tiêm. - Chuột cần được kiểm tra trước khi tiêm để đảm bảo hoàn toàn bình thường. - Cân, ghi trọng lượng và đánh dấu từng con (bằng phẩm mầu) ngay trước lúc tiêm vào biểu mẫu ghi chép. c. Tiến hành tiêm - Sát trùng vùng bụng động vật thí nghiệm bằng bông cồn. - Tiêm vào phúc mạc từng chuột. d. Liều tiêm Nguyên tắc chung: Tiêm phúc mạc chuột lang ít nhất 1 liều tiêm cho người nhưng không quá 5ml/con và tiêm phúc mạc chuột nhắt ít nhất 1 liều tiêm cho người nhưng không quá 1ml/con; Chuột chứng không tiêm - trừ một số vắc xin và sinh phẩm đặc biệt sẽ thực hiện theo chuyên luận riêng cho từng vắc xin, sinh phẩm. e. Theo dõi động vật sau thí nghiệm - Hàng ngày theo dõi, cân trọng lượng vào một giờ nhất định. - Thời gian theo dõi: 7 - 14 ngày (tùy vắc xin, sinh phẩm). f. Đánh giá kết quả  Thử nghiệm được coi là có giá trị khi tuân thủ đúng qui trình; Chuột chứng khỏe mạnh lên cân bình thường.  Tiêu chuẩn đánh giá kết quả Vắc xin, sinh phẩm được coi là đạt yêu cầu nếu trong vòng 7 ngày theo dõi toàn bộ động vật thí nghiệm sống, khỏe mạnh, tăng cân và không có biểu hiện bệnh lý hoặc nhiễm độc (có trạng thái bất thường (*), giảm hoạt động, giảm cân hoặc chết do nhiễm độc). (*): Trạng thái bất thường: Là các trạng thái, dấu hiệu bệnh lý không giống các mô tả đặc trưng (thường gặp) của vắc xin, sinh phẩm thử nghiệm. Nếu nhóm chuột đối chứng khỏe mạnh lên cân bình thường, nhóm chuột tiêm vắc xin, sinh phẩm có ít nhất 1 chuột bị chết hay sút cân hoặc có biểu hiện bất thường trong quá trình theo dõi (7 ngày), phải tiến hành rà soát lại các yếu tố, điều kiện thử nghiệm kèm theo mổ chuột để xem tổn thương thực thể và lấy mẫu bệnh phẩmxác định nguyên nhân. CHẤT GÂY SỐT 1. Nguyên vật liệu, điều kiện tiến hành - Động vật thử nghiệm: lựa chọn thỏ khỏe mạnh, trưởng thành, đực hoặc cái (không mang thai). Trọng lượng 1.5 – 2.5kg được nuôi dưỡng bằng thức ăn không chứa chất kháng sinh, không tụt cân trong suốt 1 tuần trước khi thử nghiệm và không có biểu hiện bệnh lý. Cho thỏ nhịn ăn nhưng uống nước đầy đủ trong thời gian ít nhất 18 giờ (qua 1đêm) và không cho uống nước trong thời gian làm thử nghiệm. - Thử nghiệm được tiến hành trong phòng yên tĩnh, sạch sẽ, tránh mọi tiếng động và ánh sáng làm ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm và nhiệt độ phòng không chênh lệch quá 30C so với nơi ở cũ. 2. Quy trình thử nghiệm - Thử nghiệm thăm dò: 3 ngày trước khi tiến hành tiêm sinh phẩm cần kiểm tra tính nhạy cảm cho các thỏ thử nghiệm bằng cách tiêm vào tĩnh mạch tai thỏ 10ml/ kg trọng lượng dung dịch nước muối sinh lý 0.9% không chứa chất gây sốt đã được làm ấm lên khoảng 38.50C. Ghi nhiệt độ trước tiêm và tiếp tục trong vòng 3h sau tiêm dung dịch nước muối sinh lý. Nếu thỏ có nhiệt độ dao động >0.60C sẽ bị loại và không đưa vào thử nghiệm chính. Nhiệt độ dao động của mỗi thỏ là nhiệt độ tăng hoặc giảm sau tiêm so với nhiệt độ ban đầu. - Thử nghiệm chính: thỏ thí nghiệm là thỏ đạt yêu cầu ở thử nghiệm thăm dò, được để trong lồng chuyên dụng ít nhất 60 phút để ổn định. Sau đó tiến hành đo nhiệt độ thỏ 2 lần mỗi lần cách nhau 30 phút (nếu đo tay) hoặc theo chương trình cài đặt (nếu đo bằng thiết bị). Nhiệt độ ban đầu của thỏ là giá trị trung bình của các lần đo này. Tiêu chuẩn đưa thỏ vào thí nghiệm là những thỏ có nhiệt độ chênh lệch giữa các lần đo không quá 0.20C và nhiệt độ ban đầu nằm trong khoảng 380C đến 39.80C. Mỗi mẫu thử được tiêm cho 1 nhóm gồm 3 thỏ và nhiệt độ chênh lệch trong nhóm không quá 10C - Sau khi theo dõi, nhóm thỏ đạt yêu cầu sẽ được tiêm mẫu thử vào tĩnh mạch rìa tai thỏ. Thể tích được tiêm cho mỗi thỏ tương ứng với 1ml/kg cân nặng. Nên làm ấm dung dịch tới 38.50C trước khi tiêm. Đo nhiệt độ thỏ ở những khoảng thời gian tùy thuộc vào thiết bị sử dụng (nếu đo tay cứ 1giờ đo 1 lần, nếu dùng thiết bị tùy thuộc vào chương trình cài đặt). - Nhiệt độ tối đa là nhiệt độ cao nhất đo trong khoảng thời gian này 3. Đánh giá thử nghiệm - Đáp ứng của mỗi thỏ là hiệu số của nhiệt độ tối đa sau khi tiêm mẫu thử và nhiệt độ ban đầu. - Đáp ứng của thỏ bằng 0 nếu nhiệt độ tối đa sau tiêm bằng hoặc thấp hơn nhiệt độ ban đầu. - Mẫu thử đạt yêu cầu về chất gây sốt nếu nhiệt độ chênh lệch của mỗi thỏ ≤ 0.60C và tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ ≤ 1.30C. - Mẫu thử không đạt yêu cầu về chất gây sốt nếu tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ > 2.40C. - Nếu tổng nhiệt độ chênh lệch của 3 thỏ nằm trong khoảng từ lớn hơn 1.30C đến 2.40C thì thử nghiệm phải tiến hành trên 3 thỏ khác. Mẫu thử đạt yêu cầu về chất gây sốt khi tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) của cả 6 thỏ ≤ 30C. Nếu > 4.10C coi như không đạt yêu cầu. - Nếu tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) của cả 6 thỏ nằm trong khoảng từ lớn hơn 30C đến 4.10C làm thêm lần cuối trên 3 thỏ khác. Mẫu thử đạt yêu cầu về chất gây sốt khi tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) của cả 9 thỏ ≤ 4.90C. Nếu > 4.90C coi như không đạt yêu cầu. THỬ NGHIỆM CÔNG HIỆU Thử nghiệm công hiệu vắc xin Viêm não nhật bản bất hoạt được xác định dựa trên việc xác định hiệu giá kháng thể trung hòa sau khi tiêm miễn dịch trên chuột. Cụ thể: Huyết thanh sau tiêm được trung hòa với vi rút thử thách (CVS) sau đó gây nhiễm lên tế bào Vero hoặc BHK-21 hoặc dòng tế bào phù hợp khác. 1.1. Nguyên vật liệu, dụng cụ 1.1.1. Nguyên vật liệu - Môi trường pha loãng MEM 2% FBS (GIBCO/Sigma). - Môi trường phủ thạch MEM 1% Methylcellulose(GIBCO/Sigma). - Dung dịch PBS 0,02% gelatin, pH 7,4. - Dung dịch nhuộm cố định Crystal violet. - Huyết thanh chứng dương (Vabioteach). - Tế bào Vero hoặc BHK-21. - Chủng vi rút viêm não Nhật Bản làm việc giữ ở -700C. - Vắc xin chuẩn. - Vắc xin Viêm não Nhật Bản thử nghiệm. - Chuột trắng Swiss hoặc giống chuột phù hợp khác, 11-14g; khoẻ mạnh; 32 con (16 con cho vắc xin thử, 16 con cho vắc xin chuẩn) và 8 con làm chứng. 1.1.2. Dụng cụ và trang thiết bị - Phiến 24 giếng đáy bằng (Corning). - Cốc thuỷ tinh to (Schott Duran): 1L & 2L. - Giấy dán phiến. - Pipet nhựa vô trùng loại 10ml, 25 ml (Corning). - Tuýp nhựa 15 ml, 50 ml, tuýp eppendorf. - Bơm tiêm nhựa vô trùng 3ml (Việt Nam). - Pipet-aid, pipet-man loại 20 µl, 200µl, 1000µl (Eppendorf). - Chai lọ thuỷ tinh (Schott Duran) loại 50ml, 500ml, 1000ml vô trùng. - Hốt Laminar (Nuare ClassII) - Tủ ấm CO2(Sanyo-2172) - Bể ổn nhiệt(CHCL-Lab, No0301299) - Máy ly tâm lạnh (Marathol 2100R) - Kính hiển vi phản pha.(Olympus-CK2) - Máy lắc (IKA). 1.2. Các bước tiến hành 1.2.1. Pha vắc xin gây miễn dịch - Pha vắc xin chuẩn và vắc xin mẫu thử trong dung dịch PBS 0,02% gelatin để có độ pha 1/32. - Vắc xin đã pha phải bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC. 1.2.2. Tiêm miễn dịch - Mỗi mẫu vắc xin được tiêm phúc mạc cho một nhóm chuột gồm 16 con, mỗi con 0,5 ml bằng bơm tiêm nhựa vô khuẩn với 2 mũi, mỗi mũi cách nhau 7 ngày. - Một nhóm 8 chuột không tiêm dùng làm chứng âm. 1.2.3. Lấy máu chuột, tách huyết thanh - 7 ngày sau khi tiêm mũi thứ 2, toàn bộ chuột được lấy máu tim riêng rẽ. Máu được chứa trong các tuýp eppendorf. - Ủ các tuýp máu ở 37oC / 60 phút. - Để ở tủ lạnh 4oC qua đêm. - Ly tâm các mẫu máu ở 3000 vòng/ phút x 30 phút ở nhiệt độ 4oC. - Chắt lấy huyết thanh sang tuýp eppendorf mới, lượng huyết thanh cần lấy ở mỗi tuýp là 200µl. - Huyết thanh chuẩn được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm mỗi nhóm 8 tuýp, sau đó chúng được hộn chung vào tuýp và ký hiệu RA và RB. - Huyết thanh thử được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm mỗi nhóm 8 tuýp sau đó chúng được hộn chung vào tuýp ký hiệu VA và VB. - Huyết thanh của 8 chuột chứng được hộn chung thành 1 týp ký hiệu là CA (-). - Tất cả các huyết thanh được bất hoạt 56oC /30 phút. - Bảo quản ở - 20 oC cho đến khi làm thử nghiệm trung hoà. 1.2.4. Pha loãng huyết thanh - Huyết thanh chuẩn và huyết thanh thử được pha loãng trong môi trường MEM 2% FBS để có 3 độ pha là 1/80 1/160 và 1/320. - Pha huyết thanh chứng dương để có độ pha loãng 1/80 và 1/160. - Pha huyết thanh chứng âm để có độ pha loãng pha 1/10. - Pha loãng huyết thanh chứng âm 1/10:0,5 ml huyết thanh + 4,5 ml MEM 2%FBS. 1.2.5. Pha chủng vi rút viêm não thử thách có hiệu giá là: 100- 200PFU/ 200µl Ký hiệu chủng ở độ pha này là: CV. 1.2.6. Trung hoà huyết thanh và vi rút - Lấy 1 ml của mỗi độ pha huyết thanh được chuẩn bị tại mục 5.3.4 trộn với 1 ml chủng CV; 2 ml chủng CV trộn với 2 ml MEM 2% FBS. - Đặt vào bể ổn nhiệt 37oC / 90 phút. - Lấy ra, làm lạnh trong nước đá. 1.2.7. Gây nhiễm trên tế bào Vero hoặc BHK-21 - Tế bào đã được nuôi cấy 1 lớp trong phiến 6 giếng. - Hút bỏ môi trường nuôi cấy trong các giếng sao cho còn khoảng 0,5 ml/giếng. - Đánh dấu các độ pha trên các giếng. - Nhỏ 200µl hỗn dịch (huyết thanh + vi rút) vào mỗi giếng. Mỗi nồng độ cấy 2 giếng; Hỗn dịch CV- MEM 2% FBS nhỏ 10 giếng. - Để phiến trong tủ ấm 37OC, 5%CO2 trong 90 phút để vi rút tiếp xúc với tế bào. 1.2.8. Phủ thạch - Cho vào mỗi giếng 3 ml môi trường thạch MEM 1% Methylcellulose. - Ủ 37oC/5%CO2 trong 4-5 ngày. 1.2.9. Cố định và nhuộm tế bào - Ngày thứ 5 hút hết môi trường trong giếng. - Cho vào mỗi giếng 1 ml dung dịch nhuộm. - Để phiến ở nhiệt độ phòng 15-20 phút. - Rửa phiến dưới vòi nước. - Đếm plaque bằng mắt thường. 1.2.10. Đọc và tính kết quả Theo phần mềm hoặc công thức tính hiệu giá kháng thể trung hoà: * Tỉ lệ giảm đám hoại tử được tính theo công thức: S: số plaque trung bình của mỗi nồng độ huyết thanh pha. CV số plaque trung bình của CV/giếng. * Hiệu giá kháng thể trung hoà được tính theo công thức sau: Z: logarit của hiệu giá kháng thể trung hoà giảm 50% đám hoại tử Y: tỉ lệ giảm đám hoại tử của thử nghiệm. x: số nghịch đảo của độ pha loãng. 1.3. Đánh giá thử nghiệm Thử nghiệm có giá trị khi: - Không có dấu hiệu tế bào bị nhiễm khuẩn hay nấm mốc trên các giếng - Số plaque trung bình của 10 giếng chứng nằm trong khoảng 50-150. - Hiệu giá huyết thanh chứng dương ≥ 1,5. - Hiệu giá huyết thanh chứng âm ≤ 1. Phụ lục 6