Luận án Ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng lilium có khả năng chịu nóng

on JR, Owen JL (1994). Amplification of ADN markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple- sequence repeats. Theor Appl Genet, 89, 998-1006. 51. Haldimann P, Feller U (2004). Inhibition of photosynthesis by high temperature in oak (Quercus pubescens L.) leaves grown under natural conditions closely correlates with a reversible heat-dependent reduction of the activation state of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase. Plant Cell Environ, 27, 1169 -1183. 52. Haldimann P, Feller U (2005). Growth at moderately elevated temperature alters the physiological response of the photosynthetic apparatus to heat stress in pea (Pisum sativum L.) leaves. Plant Cell Environ, 28, 302-317. 53. Hall AE (1992). Breeding for heat tolerance. Plant Breed. Rev, 10, 129-168. 54. Hall AE (2001). Crop responses to environment. CRC Press, LLC, Boca Raton, Florida. 55. Hamilton EW, Heckathorn SA (2001). Mitochondrial adaptations to NaCl. Complex I is protected by anti-oxidants and small heat shock proteins,whereas complex II is protected by proline and betaine. Plant Physiol, 126, 1266-1274. 56. Havaux M (1996). Short-term responses of photosystem I to heat stress. Photosynth Res, 47, 85-97. 57. Havaux M (1998). Carotenoids as membrane stabilizers in chloroplasts. Trends Plant Sci, 3, 147-151. 58. Hayashi H, Alia, Mustardy L, Deshnium P, Ida M, Murata N (1997). Transformation of Arabidopsis thaliana with the codA gene for choline oxidase; accumulation of glycinebetaine and enhanced tolerance to salt and cold stress. Plant J, 12(1), 133-142. 101 59. Hayashi H, Alia, Sakamoto A, Nonaka H, Chen THH, Murata N (1998). Enhanced germination under high salt conditions of seeds of transgenic Arabidopsis with a bacterial gene (codA) for choline oxidase. J Plant Res 111, 357- 362. 60. He PM, Zhang DB, Liang WQ, Yao QH, Zhang RX (2001). Expression of Choline oxidase Gene (codA) Enhances Salt Tolerance of the Tobacco. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao, 33(5), 519-524. 61. Heslop-Harrison JS (1992). Cytological Techniques to Assess Pollen Quality. Sexual Plant Reproduction, 41-48. 62. Hoshi Y, Kondo M, Kobayashi H, Mori S, Nakano M (2005). Agrobacterium- mediated transformation of Lilium longiflorum. Acta Hort 673 (2), 542-547. 63. Hoshi Y, Kondo M, Mori S, Adachi Y, Nakano M, Kobayashi H (2004). Production of transgenic lily plants by Agrobacterium-mediated transformation. Plant Cell Rep, 22(6), 359-364. 64. Howarth CJ (2005). Genetic improvements of tolerance to high temperature. In: Ashraf, M., Harris, P.J.C , Abiotic Stresses: Plant Resistance Through Breeding and Molecular Approaches. New York: Howarth Press Inc. 65. Huang J, Hirji R, Adam L, Rozwadowski KL, Hammerlindl JK, Keller WA, Selvaraj G (2000). Genetic engineering of glycinebetaine production toward enhancing stress tolerance in plants: metabolic limitations. Plant Physiol, 122, 747-756. 66. Iba K (2002). Acclimative response to temperature stress in higher plants: approaches of gene engineering for temperature tolerance. Annu. Rev. Plant Biol, 53, 225-245. 67. Ikuta S, Mamura S, Misaki H, Horiuti Y (1977). Purification and characterization of choline oxidase from Arthrobacter globiformis. J Biochem 82: 1741–1749. 68. Jang M. Van Tuyl (1985). Effect of temperature on bulb growth capicity and sensitivity to summer sprouting in lilium longiflorum Thumb. Scientia Horticulture, 25: 177-187. 102 69. Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW (1987). GUS fusion: glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 6: 3901 - 3907. 70. Jiang Y, Haung B (2001). Plants and the environment. Effects of calcium on antioxidant activities and water relations associated with heat tolerance in two cool-season grasses. J. Exp. Bot, 52, 341-349. 71. Ki Byung Lim, VanTuyl JM (2006). Lily, Lilium hybrids. In: Flower breeding genetics: Issues, challenges and opportunities for the 21st century, . Springer Verlag 517-537 . 72. Kleinhenz MD, Palta JP (2002). Root zone calcium modulates the response of potato plants to heat stress. Physiol. Plant, 115, 111-118. 73. Kolupaev Y, Akinina G, Mokrousov A (2005). Induction of heat tolerance in wheat coleoptiles by calcium ions and its relation to oxidative stress. Russ.J. Plant Physiol, 52, 199-204. 74. Kumar S, Kashya M, Sharma DR (2005). In vitro regeneration and bulblet growth from lily bulb scale explants as affected by retardants, sucrose and irradiance. Biologia Plantarum, 49 (4), 629-632. 75. Kung-Ta Lee, Shih-Cheng Chen, Bor-Luen Chiang, Takashi Yamakawa (2007). Heat-inducible production of β-glucuronidase in tobacco hairy root cultures. Appl Microbiol Biotechnol, 73, 1047-1053. 76. Li Qiu-Hua, Hong Bo, Tong Zheng, Ma Chao, Guan Ai-Nong, Yu Jing-Juan, Jun- Ping Gao (2008b). Establishment of regeneration system and transformation of Zm401 gene in Lilium longiflorum × L. formosanum. Chinese Journal of Agricultural Biotechnology 5 (Issue 02 / AuGUSt ), 113 - 119. 77. Li S, Li F, Wang J, Zhang W, Meng Q, Chen T H, Yang Y (2011). Glycinebetaine enhances the tolerance of tomato plants to high temperature during germination of seeds and growth of seedlings. Plant Cell Environ, 34(11), 1931-1942. 103 78. Lim Ki Byung, VanTuyl MJ Lily, Lilium hybrids (2006). In: Flower breeding genetics: Issues, challenges and opportunities for the 21st century Springer Verlag 517-537 79. Liu J, Shono M (1999). Characterization of mitochondria-located small heat shock protein from tomato (Lycopersicon esculentum). Plant Cell Physiol, 40, 1297-1304. 80. Liu N, Ko S, Yeh KC, Charng Y (2006). Isolation and characterization of tomato Hsa32 encoding a novel heat-shock protein. Plant Sci, 170, 976-985. 81. Li S, Li F, Wang J, Zhang W, Meng Q, Chen, Tony H, Norio M, Yang X (2011). Glycinebetaine enhances the tolerance of tomato plants to high temperature during germination of seeds and growth of seedlings. Plant Cell Environ, 34(11), 1931-1942. 82. Machado S, Paulsen GM (2001). Combined effects of drought and high temperature on water relations of wheat and sorghum. Plant Soil, 233. 83. Maesato K, Sharada K, Fukui H, Hara T, Sarma KS (1994). In vitro bulblet regeneration from bulbscale explants of Lilium japonicum Thunb. Effect of plant growth regulators and culture L. longiflorum× L. formosanum. Chinese Journal of Agricultural Biotechnology, 5 (2), 113 - 119. 84. Maestri E, Klueva N, Perrotta C, Gulli M, Nguyen HT, Marmiroli N (2002). Molecular genetics of heat tolerance and heat shock proteins in cereals. Plant Mol. Biol, 48, 667-681. 85. Mark .S. Roh 1990. Effect of high temperature on bud blast in Asiatic hybrid lily. Acta Hortic. (ISHS) 266:141-146 86. Matsunaga E, Nanto K, Oishi M, Ebinuma H, Morishita Y, Sakurai N, Shimada T (2012). Agrobacterium-mediated transformation of Eucalyptus globulus using explants with shoot apex with introduction of bacterial choline oxidase gene to enhance salt tolerance. Plant Cell Rep, 31(1), 225-235. 104 87. Mazorra LM, Nunez M, Echerarria E, Coll F, S´anchez-Blanco MJ (2002). Influence of brassinosteriods and antioxidant enzymes activity in tomato under different temperatures. Plant Biol, 45, 593-596. 88. McCue KF, Hanson AD (1990). Drought and salt tolerance: Towards understanding and application. Trends in biotechnology, 8, 358-362. 89. Meyer W, Mitchell TG, Freedman EZ, Vilgays R (1993). Hybridization probes for conventional ADN fingerprinting used as single primers in the polymerase chain reaction to distinguish strains of Cryptococcusneoformans. J Clin Microbiol 31, 2274-2280. 90. Michikazu Hiramatshu, Kiyomi Yoshimura, Hiroshi Okubo, Chiwei Huang and kuang Liang Huang (2004). Seed germination response to temperature and salinity strees in L. longiflorum and L. formosanum. J Fac Agr Kyushu uni, 49(2), 301-305 91. Mohanty A, Kathuria H, Ferjani A, Sakamoto A, Mohanty P, Murata N, Tyagi AK (2002). Transgenics of an elite indica rice variety Pusa Basmati 1 harbouring the codA gene are highly tolerant to salt stress. Theor Appl Genet, 106(1), 51-57. 92. Morales D, Rodr´ıguez P, Dell’amico J, Nicol´as E, Torrecillas A, S´anchez- Blanco MJ (2003). High-temperature preconditioning and thermal shock imposition affects water relations, gas exchange and root hydraulic conduc- tivity in tomato. Biol. Plant, 47, 203-208. 93. Murakami Y, Tsuyama M, Kobayashi Y, Kodama H, Iba K (2000). Trienoic fatty acids and plant tolerance of high temperature. Science, 287, 476-479. 94. Murashige T, Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant 15, 473-479. 95. Ogaki, Furuichi Y (2008). Importance of co-cultivation medium pH for successful Agrobacterium-mediated transformation of Lilium x formolongi. Plant Cell Rep, 27, 699-705. 105 96. Okubo H (2014). History of lilium specices in Asia Acta Hort. (ISHS) 1027.11-26. 97. Ono K, Hibino T, Kohinata T, Suzuki S, Tanaka Y, Nakamura T, Takabe T (2001). Overexpression of ADNK from a halotolerant cyanobac-terium Aphanothece halophytica enhances the high-temperatue tolerance of tobacco during germination and early growth. Plant Sci, 160, 455-461. 98. Orlikowska T, Wiejacha K, Marasek A (2001). Identification of plant distant hybrids -methods review. Biuletyn Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Roslin (Bulletin of the Institute Plant Breeding and Acclimatization), 220, 3-21. 99. Park EJ, Jeknic Z, Sakamoto A, DeNoma J, Yuwansiri R, Murata N, Chen T (2004). Genetic engineering of glycine betaine synthesis in tomato protects seeds, plants, and flowers from chilling damage. Plant J, 40(4), 474-487. 100. Park EJ, Jeknic´ Z, Pino MT, Murata N, Chen THH (2007a). Glycinebetaine accumulation is more effective in chloroplasts than in the cytosol for protecting transgenic tomato plants against abiotic stress. Plant Cell Environ, 30, 994-1005. 101. Ploszai Beata (2007). RAPD - Molecular marker in detection of hybrid. Scientific works of the Lithuania institute of Horticulture ADN Lithuania University of Agriculture, 26(3), 246-250. 102. Prasad KVSK, Sharmila P, Kumar PA, Pardha Saradhi P (2000a). Transformation of Brassica juncea (L.) Czern with a bacterial codA gene enhances its tolerance to salt stress. Mol Breed 6, 489–499. 103. Quan R, Shang M, Zhang H, Zhao Y, Zhang J (2004). Engineering of enhanced glycine betaine synthesis improves drought tolerance in maize. Plant Biotech. J, 2, 477-486. 104. Queitsch C, Hong SW, Vierling E, Lindquest S (2000). Heat shock protein 101 plays a crucial role in thermotolerance in Arabidopsis. Plant Cell 12, 479- 492. 106 105. Rathinasbapathi B, Burnet M, Russell BL, Gage DA, Liao PC, Nye GJ, Scott P, Golbeck JH, Hanson AD (1997). Choline monooxygenase, an unusual ironsulfur enzyme catalyzing the first step of glycine betaine synthesis in plants: Prosthetic group characterization and cDNA cloning. Proc Natl Acad Sci USA 94: 3454–3458. 106. Rathinasbapathi B, Fouad WM, Sigua CA (2001). β-Alanine betaine synthesis in the Plumbaginaceae. Purification and haracterization of a trifunctional, S- adenosyl-L-methionine-dependent N-ethyltransferase from Limonium latifolium leaves. Plant Physiol 126: 1241–1249. 107. Rhodes D, Hanson AD (1993). Quaternary ammonium and tertiary sulfonium compounds in higher-plants, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. (44) ( pp. 357-384). 108. Rohlf FJ (1989). NTSYS-pc: Numerical taxonomy and multivariate analysis system, version 2.00. New York. Exeter Publication (Ed.) 109. Rohlf FJ (2000). NTSYS-pc: Numerical taxonomy and multivariate analysis system, version 2.2. Exeter Software 110. Rontein D, Basset G, Hanson AD (2002). Metabolic engineering of osmo- protectant accumulation in plants. Metab. Eng, 4, 49-56. 111. Sairam RK, Tyagi AE ( 2004). Physiology and molecular biology of salinity stress tolerance in plants. Curr. Sci, 86, 407-421. 112. Sakamoto A, Alia, Murata N (1998). Metabolic engineering of rice leading to biosynthesis of glycinebetaine and tolerance to salt and cold. Plant Mol Biol, 38(6), 1011-1019. 113. Sakamoto A, Valverde R, Alia, Chen T H, Murata N (2000). Transformation of Arabidopsis with the codA gene for choline oxidase enhances freezing tolerance of plants. Plant J, 22(5), 449-453. 114. Salvucci ME, Crafts-Brandner SJ (2004). Relationship between the heat tolerance of photosynthesis and the thermal stability of rubisco activase in plants from contrasting thermal environments. Plant Physiol, 134, 1460-1470. 107 115. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (2002). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 116. Sanmiya K, Suzuki K, Egawa Y, Shono M ( 2004). Mitochondrial small heat- shock protein enhances thermotolerance in tobacco plants. FEBS Lett, 557, 265-268. 117. Savchenko GE, Klyuchareva EA, Abrabchik LM, Serdyuchenko EV (2002). Effect of periodic heat shock on the membrane system of etioplasts. Russ. J. Plant Physiol, 49, 349-359. 118. Sayed OH (1996). Adaptational responses of Zygophyllum qatarense Hadidi to stress conditions in a desert environment. J. Arid Environ, 32, 445-452. 119. Scott JW, Bryan HH, Ramos LJ (1997). High temperature fruit setting ability of large-fruited, jointless pedicel tomato hybrids with various combinations of heat-tolerance. Proc. Fla. State Hortic. Soc, 110, 281-284. 120. Scott JW, Olson SM, Howe TK, Stoffella PJ, Bartz JA, Bryan HH (1995). ‘Equinox’ heat-telerant hybrid tomato. HortScience, 30, 647-648. 121. Scott JW, Volin RB, Bryan HH, Olson SM (1986). Use of hybrids to develop heat tolerant tomato cultivars. Proc. Fla. State Hortic. Soc, 99, 311-315. 122. Sharkey TD, Badger MR, Von-Caemmerer S, Andrews TJ (2001). Increased heat sensitivity of photosynthesis in tobacco plants with reduced Rubisco activase. Photosyn. Res, 67, 147-156. 123. Simmonds JA, Cumming BG (1976). Production of plantlets from bulb-scale callus cultures for increased propagation rates. Science Hortic 5, 161 - 170. 124. Simoes-Araujo JL, Rumjanek NG, Margis-Pinheiro M (2003). Small heat shock proteins genes are differentially expressed in distinct varieties of common bean. Braz. J. Plant Physiol, 15, 33-41. 125. Soares, Taliane Leila, Silva, Sebastio de Oliveira, Costa, Aria Angelica Pereira de Carvalho, Santos-Serejo, Janay Almeida dos, Souza, Antunio da Silva, Lino, Lucymeire Souza Morais, Nunes, Onildo (2008). In vitro germination ADN viability of pollen grains of banana diploids. Crop Breeding 108 ADN Applied Biotechnology 8- 2008. Brazilian Society of Plant Breeding 111-118. 126. Stanley RG, Linskens HF (1974). Pollen: Biology, Biochemistry ADN Management. Retrieved from. 127. Sulpice R, Tsukaya H, Nonaka H, Mustardy L, Chen TH, Murata N (2003). Enhanced formation of flowers in salt-stressed Arabidopsis after genetic engineering of the synthesis of glycine betaine. Plant J, 36(2), 165-176. 128. Suzuki K, Sukaguchi T, Takeda H, Egawa Y (2003). Water status of flower buds and leaves as affected by high temperature in heat tolerant and heat- sensitive cultivars of snap bean (Phaseolus vulgaris L.). Plant Prod. Sci, 6, 4-27. 129. Suzuki S, Nakano M (2002). Agrobacterium-mediated production of transgenic plants of Muscari armeniacum Leichtl. ex Bak. Plant Cell Rep, 20, 835-841. 130. Tewolde H, Fernandez CJ, Erickson CA (2006). Wheat cultivars adapted to post-heading high temperature stress. J. Agron. Crop Sci, 192, 111-120. 131. Topping JS (1998). Tobacco transformation. Vol 81: 365-37 2. 132. Van Tuyl JM, De Jeu MJ (1997). Methods for overcoming interspecific crossing barriers. 273-293. 133. Van Tuyl JM, Van Dien MP, Van Creij MGM, Van Kleinwee TCM, Franken J, Bino RJ (1991). Application of in vitro pollination, ovary culture, ovule culture and embryo rescue for overcoming incongruity barriers in interspecific Lilium crosses Plant Science 74, 115-126. 134. Van Tuyl JM, Jaap M, Mi-Young Chung, Jae-Dong Chung, Ki-Byung Lim (2003). Introgression with Lilium hybrids: Introgression studies with the GISH method on L. Longiflorum x Asiatic, L. longiflorum x L. rubellum and L. auratum x L. henryi.. The lily yearbook of the NALS 55 (2002): 17-22, 70-72. Veli-Pekka 61. Pelkonen (2005), Biotechnological approaches in lily (Lilium) production. PhD-Thesis. 109 135. Vasrshney A, Dahwan V, Srivastava PS (2000). A protocol for in vitro mass propagation of Asiatic hybrids of lily through liquid stationary culture. In vitro Cellular and Development Biology - Plant., 36 383 - 391. 136. Vierling E (1991). The role of heat shock proteins in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol, 42, 579-620. 137. Waditee R, Bhuiyan MN, Rai V, Aoki K, Tanaka Y, Hibino T (2005). Genes for direct methylation of glycine provide high levels of glycinebetaine and abiotic stress tolerance in Synechococcus and Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 102, 1318-1323. 138. Wahid A, Close TJ (2007). Expression of dehydrins under heat stress and their relationship with water relations of sugarcane leaves. Biol. Plant, 51, 104-109 139. Wahid A, Ghazanfar A E (2006). Possible involvement of some secondary metabolites in salt tolerance of sugarcane. J. Plant Physiol, 163, 723-730. 140. Wahid A, Shabbir A (2005). Induction of heat stress tolerance in barley seedlings by pre-sowing seed treatment with glycinebetaine. Plant Growth Reg, 46, 133-141. 141. Wang QB, Xu W, Xue Q, Su WA (2010). Transgenic Brassica chinensis plants expressing a bacterial codA gene exhibit enhanced tolerance to extreme temperature and high salinity. J Zhejiang Univ Sci B, 11(11), 851-861. 142. Weir BS (1996). Genetic Data Analysis II: Methods for Discrete Population Genetic Data. Sinauer Associates. Inc. Sunderland, MA. 143. Wise RR, Olson AJ, Schrader SM, Sharkey TD (2004). Electron transport is the functional limitation of photosynthesis in field-grown Pima cotton plants at high temperature. Plant Cell Environ, 27(717-724). 144. Wu K, Jones R, Eberger LD, Scolnik PA (1994). Detection of microsatellite polymorphisms without cloning. NucleicAcids Res, 22, 3257–3258. 145. Xi M, Sun L, Qiu S, Liu J, Xu J, Shi J (2012). In vitro mutagenesis and identification of mutants via ISSR in lily (Lilium longiflorum). Plant Cell Rep, 31(6), 1042 -1051. 110 146. Xu S, Li J, Zhang X, Wei H, Cui L (2006). Effects of heat acclima-tion pretreatment on changes of membrane lipid peroxidation, antioxidant metabolites, and ultrastructure of chloroplasts in two cool-season turfgrass species under heat stress. Environ. Exp. Bot, 56, 274-285. 147. Yamagishi Masumi, Abe Hiromi, Nakano Michiharu, Nakatsuka Akira (2002). PCR-based molecular markers in Asiatic hybrid lily. Scientia Horticulturae, 96(1–4), 225-234. 148. Yang KA, Lim CJ, Hong JK, Park CY, Cheong YH, Chung WS, Lim CO (2006). Identification of cell wall genes modified by a permissive high temperature in Chinese cabbage. Plant Sci, 171, 175-182 149. Yang X, Liang Z, Lu C (2005). Genetic engineering of the biosynthesis of glycinebetaine enhances photosynthesis against high temperature stress in transgenic tobacco plants. Plant Physiol 138, 2299-2309. 150. Yang X, Wen X, Gong H (2007). Genetic engineering of the biosynthesis of glycinebetaine enhances thermotolerance of photosystem II in tobacco plants. Planta 225, 719–733. 151. Yin H, Chen Q (2008). Effects of short-term heat stress on oxidative damage and responses of antioxidant system in Lilium longiflorum. Plant Growth Regul 54, 45-54. 152. Yin H, Chen Q, Yi M (2007). Effects of short-term heat stress on oxidative damage and responses of antioxidant system in Lilium longiflorum. Plant Growth Regulation. 153. Yu X, Kikuchi A, Matsunaga E, Morishita Y, Nanto K, Sakurai N, Watanabe KN (2009). Establishment of the evaluation system of salt tolerance on transgenic woody plants in the special netted-house. Plant Biotechnol, 26, 135-141. 111 154. Yue Wang, Bernadette van Kronenburg, Tila Menzel, Chris Maliepaard. Xiaohui Shen, Krens, Frans (2012). Regeneration and Agrobacterium- mediated transformation of multiple lily cultivars. Plant Cell Tiss Organ Cult, 111, 113 - 122. 155. Zhang HX, Hodson JN, Williams JP, Blumwald E (2001). Engineering salt tolerant Brassica plants: characterization of yield and seed oil quality in transgenic plants with increased vacuolar sodium accumulation. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 98, 12832-12836. 156. Zhang JH, Huang WD, Liu YP, Pan QH (2005). Effects of temperature acclimation pretreatment on the ultrastructure of mesophyll cells in young grape plants (Vitis vinifera L. cv. Jingxiu) under cross-temperature stresses. J. Integr. Plant Biol, 47, 959-970. 157. Zhao R, Fan JP, Zhang H, Liu YB, Yan GS (2014). Analysis on genetic relationships in lily hybrid based on ISSR molecular markers Acta Hort. (ISHS) 1035, 215-222. 158. Zidenga T (2005). Improving Stress Tolerance through Energy Homeostasis in Plants. Department of Plant Cellular and Molecular Biology. Ohio State University. 112 SUMMARY 1. Thesis title: "Application of plant cell technology and genetic engineering in evaluating, selecting and creating heat-tolerant Lilium" 2. Objectives: 2.1. General objectives: Embryo rescuse and genetic transformation methods were used in order to improve the heat tolerance in Lilium. Outcomes of this thesis provide scientific evidences for the feasibility of applying modern plant biotechnology to develop novel tree cultivars with improved abiotic stress tolerance. 2.2. Detailed objectives: (1) Establishing and optimizing reliable and reproducible transformation procedure into lily bulb scales via Agrobacteria tumefaciens. (2) Applying embryo rescuse techniques in vitro to get lily hybrids. (3) Evaluating heat tolerance of transgenic lily lines and hybrid lines in vitro. 3. Contents: (1) Evaluating genetic diversity, heat resistance and micropropagation ability of lilies. (2) Creating new lily lines with thermal resistance by hybridization and embryo rescue. (3) Creating new lily lines with thermal resistance by choline oxidase gene transformation into lily bulb scales slice mediated by A. tumefaciens. (4)Selecting heat tolerant lilies from transgenic lines and hybrid lines in vitro. 4. Contributions The thesis is the first work evaluating, selecting and creating heat tolerant lily lines by plant cell technology and genetic engineering in Vietnam and the world. The thesis presents methods of evaluation, selection and creation lily lines by breeding with embryo rescuse and gene transformation. The work, for the first time, 113 succesfully produced transgenic lily lines overexpressing codA gene coding Glycine betaine. Furthermore, some hybid lines also demonstrated the potential of their tolerance to heat treatment in vitro. The thesis also contributed theoretical basis and scientific practical application of tissue culture and genetic technology for developing in specific plant and lily, in particular with the withstand ability to high temperature conditions. 5. Results: 1) Thirteen lily cultivars were evaluated genetic relationships by using molecular markers, the ability to propagate and heat resistance in vitro. The result show that it is a high-diverse collection which is 73.1% pairs of them having low genetic similarity that they have been classified into 3 main groups. The genetic material of studied lily cultivars/species is diverse and genetic similarity coefficient of each pair is low (<0.5) which meet condition for breeding. The Yel, Bel, Sor, F, L and SP cultivars/species have the ability to propagate in vitro with the multiple rate is 1.1- 1.8 tubers per bulblet scales slice. Regeneration capacity of these in vitro lily bulblet scales demonstrated the potential application with it in creating new lily varieties. Most vitro lily bulbs were killed at 37 oC ± 1oC, 13 days or at 42 oC ±1oC, 4 days that is a test for choosing lily line with the heat tolerance. 2) Before breeding new lilies, pollens quality of some varieties such as Sor, F and L were checked for pollinating in nine hybrid combinations. After that, new lily hybrid plantlets are formed by ovary slice culture or embryo culture. LLK5, LLK11 and LL134 hybrid lines was initially confirmed by RAPD and ISSR markers. The hybrid lily lines were examined the possibility of survival of the bulblets and bulblet scale slices and ability of bulblets regenerations after heat shock in vitro. The information show that LL134 and LLK5 can survive and generate new small lily bulblets with the rate as approximately high as parental lines. 3) The procedure of lily transformation by Agrobacterium tumefaciens mediated was originally established with high efficiency not only in indicator gene (GUS) but also in codA genes. Results showed that 17 transgenic Sor lines obtained 114 with efficiency from 4.12% to 5.71%; 42 transgenic Yel lines created with the efficiency from 6.17% to 7.62% and 52 transgenic Bel lines created with the efficiency from 7.24% to 10.57%. Many transgenic survival lines in sub-threshold conditions were evaluated as heat tolerant lines and have the ability to regenerate roots at a rate of 24.54% - 50.24% for the Sor, 49.02%- 50.05% for the Yel; at the rate of 60.64% - 77.71% for the Bel varieties, especially). PHỤ LỤC Phụ lục 1. Khả năng phát sinh hình thái cảm ứng tạo củ từ lát cắt vảy củ in vitro của các giống sau 4 tuần nuôi cấy Giống Số mẫu nuôi cấy (mẫu) Số mẫu phát sinh hình thái (mẫu) Số mẫu phát sinh rế (mẫu) Số mẫu tạo củ (mẫu) Số củ hình thành (củ) Đặc điểm củ F 30 27 2 26 29 Củ to, vảy củ dày 30 27 3 27 29 30 26 1 27 30 L 30 15 1 15 17 củ lớn nhỏ không đều 30 17 1 16 18 30 20 1 19 22 Yel 30 28 10 28 45 củ to, vảy củ dày 30 27 11 27 42 30 25 8 25 38 Bel 30 25 23 25 39 Củ vừa,vảy củ mỏng 30 27 24 27 40 30 27 20 26 42 Sor 30 25 0 25 48 Củ nhỏ,vảy củ mỏng 30 22 0 22 44 30 21 0 21 37 SP 30 13 0 13 19 Củ nhỏ, vảy củ mỏng 30 10 1 10 20 30 8 3 8 15 củ to: đường kính củ ≥ 1 mm củ nhỏ: đường kính củ <1 mm. Phụ lục 2 Phụ lục 2.1. Sự đa hình ADN của các dòng con lai 134 so với dòng bố mẹ của tổ hợp Bel và Sor Tên mồi IS S R 4 IS S R 5 IS S R 6 IS S R 7 IS S R 8 IS S R 1 5 IS S R 5 1 IS S R 5 2 IS S R 5 3 IS S R 5 5 IS S R 5 6 IS S R 5 9 IS S r6 2 IS S R 6 9 ADN (bp) 6 0 0 8 0 0 4 0 0 4 5 0 9 0 0 5 0 0 5 5 0 1 0 0 0 0 * 3 5 0 7 0 0 5 0 0 7 0 0 3 5 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 * 7 0 0 9 0 0 9 0 0 5 0 0 5 5 0 Bel + + - + + + - - - + + - + + - + + - - + + - + Sor - - + - - - + + + - - + - - + - - + + - - + - 134 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Phụ lục 2.2. Sự đa hình ADN của con lai so với dòng bố, mẹ của tổ hợp Sor và L; F và L. T ên m ồ i IS S R 4 IS S R 5 IS S R 6 IS S R 7 IS S R 8 IS S R 1 5 IS S R 5 1 Băng ADN (bp) 4 5 0 5 5 0 8 0 0 7 5 0 4 5 0 6 0 0 7 5 0 9 0 0 6 0 0 9 0 0 1 1 0 0 1 4 0 0 3 5 0 4 0 0 5 5 0 7 5 0 1 1 0 0 3 0 0 5 0 0 6 5 0 7 5 0 9 0 0 3 5 0 4 0 0 7 0 0 7 5 0 Sor - - + + - - - + + + + + + + - + + - SL11 + + + + + + + + + + + + + + + + + + L + + - - + + + - - - - - + + - + + - + - - + - + - + I5 + + + + + + + + + + + + + I4 - - - + + - - - - - + - + F - - - + + - - - - - + - + T ên m ồ i IS S R 5 2 IS S R 5 3 IS S R 5 5 IS S R 5 6 IS S R 5 9 IS S R 6 2 IS S R 6 9 Băng ADN (bp) 5 0 0 8 0 0 1 0 5 0 2 5 0 6 5 0 7 0 0 9 0 0 9 5 0 6 0 0 9 0 0 9 5 0 1 2 0 0 5 0 0 6 0 0 7 5 0 8 0 0 3 0 0 4 5 0 5 0 0 6 5 0 1 2 0 0 3 5 0 5 0 0 6 5 0 5 5 0 8 0 0 Sor - + + + + - + + + + + + - + - SL11 + + + + + + + + + + + + + + + L + - - + - + - + + - + + + - + - - - - + - + - + + + I5 + + + + + + + + + + + + + + + + I4 + - - - - - - - - + - + - - - - F + - - - - - - - - + - + - - - - Ghi chú: (+): các băng ADN xuất hiện; (-): các băng ADN không xuất hiện, (*): không cho kết quả đa hình Phụ lục 3 Phụ lục 3.1. Tọa độ 2 chiều của các con lai về bố mẹ của tổ hợp lai Sor và L; tổ hợp F và L Phụ lục 3.2. Biểu đồ tọa độ 2 chiều của tổ hợp lai Bel x Sor và con lai 134 Phụ lục 4. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của dòng mang cấu trúc HSP promoter (HG2) với trình tự gen (mã X17295.1) của NCBI Ghi chú: Query: trình tự promoter HG2 thu được từ khuẩn lạc 1 Sbjct: trình tự gen HSP18.2 trên GenBank Hộp TATA được phủ màu vàng. Các trình tự HSE được gạch chân Phụ lục 5: Khả năng sinh trưởng của các dòng thuốc lá Cấu trúc chuyển gen Thí nghiệm Số mảnh lá thí nghiệm Số mảnh lá hình thành chồi Tổng số chồi cấy Số chồi ra rễ Số dòng dương tính Xgluc (*1) 1 30 30 60 36 15 2 79 76 54 28 11 3 28 28 68 31 12 (*2) 1 30 30 48 22 20 2 30 28 54 25 23 3 36 36 56 26 24 (*3) 1 21 17 30 20 16 2 21 16 32 23 15 3 33 18 28 22 18 WT1 1 22 0 - - - 2 18 0 - - - 3 22 0 - - - WT2 1 18 18 44 44 0 2 24 22 40 35 0 3 18 18 45 42 0 Ghi chú (*1): 35S/Hyg/35SpolyA/35S/codA-cmyc/Nos/ 35S-GUS-Nos (*2): 35S/Hyg/35SpolyA/35S/TP-codA-cmyc/Nos/ 35S-GUS-Nos (*3): 35S/Hyg/35SpolyA/HSP/TP-codA-cmyc/Nos/ 35S-GUS-Nos (ĐC1): Dòng thuốc lá không chuyển gen ở môi trường có kháng sinh chọn lọc (ĐC2): Dòng thuốc lá không chuyển gen ở môi trường không có kháng sinh chọn lọc Phụ lục 6: Khả năng chuyển gen của các chủng A. tumefaciens vào lily. Chủng thí nghiệm Lần TN Số mẫu biến nạp Số củ con hình thành (củ) Sổ củ sống sót sau chọn lọc (củ) Số dòng dương tính với (lát cắt) Xgluc (dòng) EHA 105 1 75 50 5 5 2 90 63 7 5 3 30 26 3 3 C58- 1 68 44 3 2 PMP90 2 60 40 2 2 3 30 29 2 2 C58- 1 60 47 4 2 pGV2260 2 94 57 5 3 3 30 22 2 1 LBA 404 1 70 57 5 4 2 90 55 5 5 3 25 20 2 2 Phụ lục 7: Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn tới khả năng chuyển gen vào lily OD600 Lần TN Số mẫu biến nạp Số củ Sổ củ sống sót sau chọn lọc (củ) Số dòng dương tính với Xgluc (dòng) (lát cắt) con hình thành (củ) 1 90 67 6 5 0,3 2 87 58 4 4 3 84 53 4 3 1 90 63 8 6 0,6 2 80 44 5 5 3 80 48 6 6 1 81 57 7 5 0,9 2 70 48 3 3 3 94 61 7 6 1 74 42 3 1 1,2 2 90 50 4 2 3 70 42 3 2 Phụ lục 8: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen vào lily Thời gian đồng nuôi cấy (ngày) Lần TN Số mẫu biến nạp (lát cắt) Số củ con hình thành (củ) Sổ củ sống sót sau chọn lọc (củ) Số dòng dương tính với Xgluc (dòng) 1 1 40 32 1 1 2 40 35 1 1 3 45 38 2 1 3 1 40 33 4 4 2 45 31 4 3 3 45 30 4 4 5 1 40 30 3 3 2 45 34 4 4 3 40 35 4 4 7 1 40 30 2 2 2 45 33 2 2 3 42 32 3 1 Phụ lục 9: Khả năng nhận các cấu trúc gen ở 3 giống lily nghiên cứu cấu trúc chuyển gen Giống Thí nghiệm Số mẫu biến nạp (lát cắt) Số củ con hình thành (củ) Số củ sống sót sau chọn lọc (củ) Số mẫu dương tính X-gluc (*1) Bel 1 55 45 5 5 2 65 40 6 5 3 91 42 5 5 Yel 1 78 85 7 6 2 80 73 5 5 3 65 65 5 4 Sor 1 63 45 5 2 2 58 45 6 3 3 50 30 4 2 (*2) Bel 1 65 55 9 8 2 65 50 8 7 3 81 42 8 7 Yel 1 70 75 7 5 2 65 64 5 6 3 115 111 9 4 Sor 1 35 15 3 2 2 30 17 2 2 3 21 11 2 1 (*3) Bel 1 50 36 5 4 2 75 40 6 5 3 85 50 6 6 Yel 1 67 55 8 7 2 46 52 5 4 3 27 33 1 1 Sor 1 35 23 3 3 2 32 18 3 2 3 24 4 0 0 (*1): 35S/Hyg/35SpolyA/35S/codA-cmyc/Nos/ 35S-GUS-Nos (*2): 35S/Hyg/35SpolyA/35S/TP-codA-cmyc/Nos/ 35S-GUS-Nos (*3):35S/Hyg/35SpolyA/HSP/TP-codA-cmyc/Nos/35S-GUS-Nos Phụ lục 10: Tỷ lệ sống sót của củ nhỏ in vitro của giống khi nuôi cấy ở nhiệt độ cao (37 ±1 oC) Giống TN Số mẫu đem sốc nhiệt (mô) Số mẫu sống sót của củ nhỏ sau ngày nuôi cấy ở nhiệt độ cao 37 ±1 oC (mô) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Bel 1 30 30 30 30 30 30 27 21 12 12 12 12 11 11 11 9 6 3 1 0 2 35 35 35 35 35 35 35 22 19 17 15 14 14 14 13 13 7 2 0 0 3 27 27 27 27 27 27 27 15 15 15 14 14 14 13 13 12 9 4 2 0 V 1 30 30 30 30 30 30 30 30 23 15 10 8 6 6 6 5 1 0 2 29 29 29 29 29 29 29 29 19 13 13 8 7 6 3 2 0 0 3 30 30 30 30 30 30 30 30 26 18 12 12 11 8 1 0 0 0 Sor 1 28 28 28 28 22 17 13 12 12 9 5 4 4 2 0 2 33 33 33 33 25 15 13 13 12 10 9 8 3 0 0 3 28 28 28 28 28 12 11 11 10 8 7 5 2 1 0 F 1 33 33 33 33 33 33 33 33 33 20 11 11 11 10 11 11 10 10 6 3 2 1 0 2 30 30 30 30 30 30 30 30 30 21 9 8 7 7 5 5 5 4 4 2 1 1 0 3 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 18 13 7 6 6 5 4 4 3 2 2 0 0 I4 1 27 27 27 27 27 27 27 27 27 27 23 9 9 9 5 5 4 2 2 1 1 0 0 2 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 15 7 6 6 5 5 4 3 1 1 1 1 0 3 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 12 8 6 6 6 4 4 1 1 0 0 0 0 I5 1 25 25 25 25 25 25 25 25 25 15 7 7 7 6 5 4 2 2 0 0 0 2 25 25 25 25 25 25 25 25 25 20 12 7 7 7 5 5 4 2 2 0 0 3 20 20 20 20 20 20 20 20 20 18 10 7 6 6 5 5 5 3 3 3 0 SP 1 27 27 27 27 27 27 27 23 15 13 12 7 5 2 0 2 30 30 30 30 30 30 30 25 17 14 10 6 4 3 0 3 25 25 25 25 25 25 25 22 18 13 7 6 4 2 0 Phụ lục 11. Tỷ lệ sống sót của củ nhỏ in vitro các giống lily khi nuôi cấy ở nhiệt độ 42 oC ± 1oC Giống TN Số mẫu sốc nhiệt (mô) Số mẫu sống sót sau ... ngày 0 ngày 0.5 ngày 1 ngày 1.5 ngày 2 ngày 2.5 ngày 3 ngày 3.5 ngày Bel 1 20 20 17 15 10 5 0 2 22 22 18 15 8 4 0 3 20 20 20 16 11 5 0 SP 1 22 22 16 10 5 0 2 25 25 17 13 4 0 3 20 20 18 12 4 0 Sor 1 20 20 12 7 0 2 20 20 13 5 0 3 22 22 15 8 0 L 1 24 24 19 15 10 7 4 0 2 22 22 18 13 9 5 4 0 3 22 22 18 14 9 6 3 0 F 1 20 20 19 15 13 10 7 3 0 2 20 20 20 17 14 11 6 2 0 3 20 20 18 16 14 10 7 2 0 Yel 1 25 25 20 12 6 0 2 25 25 18 11 3 0 3 25 25 20 14 4 0 Phụ lục 12. Khả năng sống sót của các dòng lily chuyển gen in vitro sau xử lý ở nhiệt độ 37 oC ± 1 oC, 13 ngày Cấu trúc gen chuyển Giống Tổng số dòng đem xử lý (dòng) Số dòng sống sót sau thử nhiệt (dòng) Số dòng sống sót sau phục hồi 10 ngày(dòng) Số dòng sống sót sau phục hồi 20 ngày(dòng) Số dòng sống sót sau phục hồi 30 ngày(dòng) (*1) Bel 16 15 14 14 13 16 14 13 13 13 15 13 13 12 12 Yel 17 12 12 12 12 16 14 13 13 13 16 13 13 13 12 Sor 15 11 10 5 3 14 12 10 6 3 14 12 9 6 4 (*2) Bel 25 22 20 18 18 25 23 20 19 18 24 24 20 19 19 Yel 21 17 13 10 9 21 17 12 9 10 20 18 12 9 9 Sor 7 5 5 2 2 7 6 5 3 3 7 5 5 4 3 (*3) Bel 17 15 15 13 13 16 15 14 13 13 15 16 13 13 12 Yel 14 12 10 9 9 13 13 13 10 9 13 13 12 11 9 Sor 6 5 5 4 3 6 4 4 4 2 6 5 4 3 3 126 Phụ lục 13. Khả năng sống sót và khả năng tạo củ của mô vảy củ của 8 dòng lily chuyển gen sau xử lý nhiệt 37 oC ±1 oC, 13 ngày Dòng Thí nghiệm Số mẫu sốc nhiệt (mô) Số mẫu sống sót sau sốc nhiệt ngày (mô) Số mẫu sống sót tạo củ (mô) Số củ được tạo ra (củ) 10 ngày 30 ngày Yel Hsp A6.1 1 21 18 15 12 17 2 20 17 14 11 18 3 22 18 15 11 16 Yel Cod A A1.4 1 17 12 12 8 15 2 15 11 10 7 15 3 15 12 12 8 13 Yel (ĐC) 1 21 3 3 2 2 2 23 4 2 2 2 3 25 4 2 1 2 Bel Hsp A5.1 1 20 18 16 14 17 2 17 15 13 13 20 3 15 14 13 13 18 Bel Cod A A2.1 1 16 14 13 12 15 2 15 13 13 13 21 3 15 11 11 10 17 Bel Sp A9.1 1 20 15 14 13 18 2 23 20 17 16 22 3 19 17 15 9 15 Bel (ĐC) 1 22 3 2 1 1 2 24 4 3 2 3 3 19 3 1 1 1 Sor Hsp A2.1 1 15 13 10 8 17 2 14 11 8 6 11 3 11 9 8 6 10 Sor Sp A2.8 1 17 14 7 6 9 2 15 13 5 4 7 3 15 13 6 4 6 Sor Cod A A3 1 17 14 5 5 8 2 17 13 5 3 5 3 18 15 6 5 7 Sor (ĐC) 1 30 3 2 1 1 2 28 1 0 0 0 3 27 1 0 0 0 127 Phụ lục 14. Khả năng sống sót và khả năng tái sinh củ của 3 dòng lily lai và các dòng bố mẹ của chúng sau xử lý nhiệt 37 ±1 oC, 13 ngày Dòng Thí Nghiệm Số mẫu sốc nhiệt (mô) Số mẫu sống sót sau sốc nhiệt ngày (mô) Số mẫu sống sót sau sốc nhiệt ngày (mô) Hệ số nhân củ 10 ngày 10 ngày I5 1 25 8 7 3 5 2 25 9 5 3 4 3 20 8 3 2 3 F 1 22 12 8 5 7 2 25 13 7 6 7 3 20 10 7 6 8 L 1 15 8 5 3 4 2 17 6 4 3 5 3 18 8 4 2 3 SL11 1 20 7 0 2 22 6 0 3 18 4 0 Sor 1 25 3 3 2 3 2 20 4 2 1 1 3 22 3 2 1 2 Bel 1 28 7 4 1 2 2 27 7 6 2 3 3 25 6 5 2 4 134 1 20 4 3 1 2 2 20 5 4 1 2 3 20 5 3 0 0 128 PHỤ LỤC 15 – MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN  Tách chiết và tinh sạch ADN plasmid (Sambrook et al., 2002). Phương pháp này sử dụng các dung dịch Sol I, Sol II, Sol III để tách plasmid từ tế bào vi khuẩn, dựa trên nguyên lý sau: sử dụng EDTA để hòa tan cặn tế bào vi khuẩn, sau đó, sử dụng SDS, NaOH để phá vỡ cấu trúc thành và làm biến tính các phân tử protein, kết tủa protein bằng cách thay đổi pH của dịch chiết tế bào; sau đó, ly tâm tốc độ cao để loại protein bị kết tủa. ADN plasmid được tủa lại bằng ethanol 100% hoặc isopropanol. Lượng ARN còn tồn tại trong dung dịch chứa ADN plasmid được loại bỏ bằng cách bổ sung ARNase. Quy trình tách chiết được tiến hành cụ thể như sau: - Lấy 2 ml dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf 2 ml và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 5 phút rồi thu cặn tế bào ở đáy ống. - Bổ sung vào cặn khuẩn 100 µl dung dịch Sol I lạnh (Tris HCl 50 mM, pH 8.0; EDTA 10 mM, pH 8.0); hòa tan hoàn toàn cặn tế bào bằng voltex. Bổ sung 200 µl dung dịch Sol II (200 mM NaOH + SDS 1 %), đảo nhẹ, ủ trên đá 3 phút. Bổ sung 150 µl dung dịch Sol III lạnh (Potassium acetat 3M; Acetic acid 11,5 %; H20), đảo nhẹ. Đặt trong đá 3 phút - 5 phút. Sau đó, tiến hành ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC; thu dịch nổi, bỏ cặn. - Bổ sung dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (24: 1) theo tỷ lệ 1: 1, đảo nhẹ và ly tâm hỗn hợp tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút rồi chuyển pha trên sang ống Eppendorf 1,5 ml mới. - Bổ sung isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1: 1, ủ ở - 20oC trong thời gian ít nhất là 30 phút; ly tâm ở 4oC, 13000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ dịch trong, thu kết tủa ADN. - Rửa kết tủa hai lần bằng 500 µl cồn 70 % lạnh; ly tâm ở 4oC, 13000 vòng/phút trong 5 phút rồi loại bỏ dịch phía trên và làm khô tủa. - Hoà tan tủa trong 50 µl nước khử ion vô trùng hoặc TE có bổ sung ARNase đến nồng độ cuối cùng là 30 µg/ml, để ở nhiệt độ phòng cho tan hoàn toàn. - Bảo quản plasmid trong tủ - 20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. 129 - Điện di kiểm tra trên gel agarose 1 %. * Thôi gen từ bản gel agarose bằng bộ KIT của hãng Fermentas, Mỹ. Cắt phần gel có chứa đoạn gen codA-cmyc vào ống eppendorf 2 ml. Cân đoạn gel vừa cắt được và xác định thể tích đoạn gel này theo quy ước 1 mg trọng lượng sẽ tương đương với 1 µl thể tích. Bổ sung dịch gắn kết ADN GB (Gel Binding) vào ống chứa mảnh gel theo tỉ lệ: Vmẫu : VGB = 1 : 3. Ủ hỗn hợp ở 60oC trong 10 phút và cứ 2 phút - 3 phút đảo nhẹ một lần cho đến khi gel tan hoàn toàn. Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết ADN (Binding column) và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Tiếp tục bổ sung 500 µl đệm rửa WB (Washing Buffer) lên cột liên kết ADN. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút thêm một lần nữa để loại bỏ hoàn toàn đệm rửa WB. Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml mới. Bổ sung 30 µl - 50 µl dung dịch hòa tan ADN (Elution Buffer) (hoặc nước khử ion đã khử trùng) vào chính giữa cột, để ở nhiệt độ phòng 1 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu ADN. Bỏ cột và bảo quản ADN vừa tinh sạch ở - 20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Sản phẩm thôi gel được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% . * Biến nạp vector tái tổ hợp vào A. tumefaciens bằng xung điện (Cohen et al., 1972). Phương pháp này dựa trên cơ sở là tạo ra các lỗ trên màng khi có tác dụng của các điện cực lớn, cho phép các phân tử ADN ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào theo điện trường. Các bước tiến hành như sau: Làm tan tế bào khả biến A. tumefaciens trong đá trong 10 phút - 15 phút. Bổ sung 5 µl vector tái tổ hợp vào ống chứa tế bào khả biến, trộn đều và đặt trong đá 15 phút. Dùng pipet chuyển dung dịch sang cuvette dùng trong máy xung điện đã được làm lạnh và khử trùng từ trước. Tiến hành xung điện ở 25 µF, 200, 2.5 kV, đặt ngay vào trong đá. 130 Bổ sung ngay 500 µl môi trường LB lỏng vào cuvette và chuyển sang ống eppendorf 2 ml, lắc 200 vòng/phút ở 28oC từ 1 giờ - 1,5 giờ để tế bào hồi phục. Cấy trải 100 µl dịch tế bào đã biến nạp trên môi trường chọn lọc LB đặc có bổ sung 50 mg/l rifamycin, 50 mg/l kanamycin. Nuôi đĩa vi khuẩn cấy trải ở 28oC, lắc 200 vòng/phút, từ 1 ngày - 2 ngày thu các khuẩn lạc riêng rẽ. * Kiểm tra sự biểu hiện của gen đích trong cây mô hình nhờ kỹ thuật chuyển gen gián tiếp qua vi khuẩn A. tumefaciens (Topping, 1998) Tạo nguyên liệu chuyển gen: Chọn các lá bánh tẻ, có kích thước vừa phải ở cây con khỏe mạnh 2 tuần tuổi. Dùng dao cắt bốn cạnh mép lá gây tổn thương, tạo thành các mảnh lá có kích thước khoảng 1 cm x 1 cm. Sau đó, các mảnh lá này được đặt trong môi trường ½ MS lỏng trước khi biến nạp để tránh bị khô. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy: Ngâm các mảnh lá vào dịch huyền phù vi khuẩn, OD600 = 0,7 trong 10 phút, có lắc nhẹ. Mẫu cấy được thấm khô bằng giấy thấm khử trùng và đặt lên môi trường đồng nuôi cấy trong tối 2 ngày - 3 ngày. Sau 2 ngày - 3 ngày đồng nuôi cấy, đặt các mảnh lá lên giấy thấm khô hết dịch khuẩn và chuyển lên môi trường tái sinh. Sau 3 tuần - 4 tuần, xuất hiện các cụm chồi nhỏ từ mép các mảnh lá, tách các cụm chồi, tiếp tục cấy lên môi trường ra rễ. Đến khi các chồi thật phát triển từ các cụm chồi thì tiến hành tách từng chồi riêng rẽ và cấy lên môi trường chọn lọc lần 2. *Tách chiết ARN: Thực hiện theo kit tách ARN của GenElute TM Total RNA Miniprep (hãng Sigma). + Giải phóng ARN từ các tế bào hoặc mô. - Nghiền mẫu trong nitơ lỏng. - Chuẩn bị hỗn hợp bao gồm Lysis + 2-mercaptoethanol (ME) (500µl dung dịch ly giải x số mẫu + 10µl ME x số mẫu); cho hỗn hợp dung dịch trên vào mẫu (có thể ly tâm nhẹ, hút phần dịch trong sang cột lọc màu xanh); sau đó ly tâm 13 000 vòng/ phút, 2 phút. 131 - Bỏ cột lọc màu xanh, thu lấy phần dịch trong phía dưới (dung dịch ly giải) và bổ sung ME vào dung dịch ly giải (10 µl 2ME/1ml dung dịch ly giải). Chuyển dung dịch ly giải sang cột lọc màu xanh. Ly tâm cột 13 000vòng/ phút, 2 phút. + Gắn ARN vào cột: Bổ sung thể tích tương đương của cồn ethanol 70% vào cột lọc màu xanh trộn đều sau đó chuyển 700 µl hỗn hợp dung dịch ly giải/ethanol sang cột màu đỏ để làm sạch cột bám; ghi lại tên ống và ly tâm 13000 vòng/ phút, 30 giây; loại bỏ dịch nước chảy qua và lặp lại nếu cần. + Rửa để loại bỏ tạp chất. Bổ sung 500 µl dung dịch ‘wash 1’ vào cột đỏ, ly tâm 15000 vòng/ phút, 1 phút; đổ bỏ dịch phía dưới, giữ lại cột; bổ sung 500 µl dung dịch ‘wash 2’ vào cột đỏ, ly tâm 13000 vòng/ phút, 1 phút. Đổ bỏ phần dịch phía dưới, giữ lại cột (lưu ý: Ethanol phải được bổ sung vào dung dịch ‘Wash 2’ để sử dụng); bổ sung lần hai 500 µl dung dịch ‘wash 2’ vào cột; ly tâm 13000 vòng/ phút, 2 phút để loại bỏ ethanol, bỏ dịch phía dưới, giữ lại cột; ly tâm không với cột, thấm khô với giấy phần ống dưới. + Rửa ARN đã tinh sạch Chuyển cột vào ống effendox mới, ghi lại tên ống; bổ sung 50 µl dung dịch ‘Elute’ vào ống và để yên 1 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/ phút, 1 phút (lặp lại nếu muốn thu lượng ARN nhiều hơn >100 µg). + Đo hàm lượng các mẫu ARN tách chiết bằng máy Nanodrop. + Pha loãng dung dịch chứa ARN đến nồng độ thích hợp để sử dụng, thường là 100 ng/µl. * Tổng hợp cDNA ARN sau khi tách chiết được dùng để tổng hợp cDNA theo kit First Strand cDNA synthesis của (hãng Fermentas) để chuẩn bị khuôn cho phản ứng PCR. 132 Bước 1: Chuẩn bị ‘working solution’ trong ống 0,2 ml hoặc 0,5 ml như sau: STT Thành phần Thể tích (µl) 1 ARN tổng số 5 2 Random Hexamer Primer 1 3 DEPC water 6 Ủ (working solution) 650C trong 5 phút (sử dụng máy PCR). Sau đó đặt ngay lập tức vào trong đá. Bước 2: Thêm các thành phần sau vào dung dịch đã chuẩn bị trên STT Thành phần Thể tích 1 Reaction buffer 5X 4 2 dNTP 10mlM 2 3 RiboLock ARNse Inhibitor 20 µ/µl 1 4 M-MuLV Reverse Transcriptase 200 µ/ µl 1 Bước 3: Tiến hành phản ứng PCR theo chu trình nhiệt sau Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 250C 5 phút 1 420C 60 phút 700C 5 phút 40C ∞ Bước 4: Kiểm tra sự thành công của quá trình tổng hợp cDNA: - cDNA sau khi được tổng hợp được kiểm tra bằng mồi actin theo kit GoTaq®FGreen Master Mix (của hãng Promega). 133 - Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra cây chuyển gen Thành phần Thể tích 1 phản ứng (µl) Master Mix (2X) 10 AND 3 Forward Primer 5pM 1 Reverse Primer 5pM 1 H2O 5 Tổng thể tích 20 - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR kiểm tra cây chuyển gen Giai đoạn Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ Khởi đầu 94 5 phút 1 Biến tính 94 30 giây 25 Gắn mồi 55 30 giây Kéo dài 72 30 giây 72 7 phút 1 Giữ 4 ∞ * Phản ứng PCR: được thực hiện theo kit GoTaq®Green Master Mix của hãng Promega. Thành phần của phản ứng RT-PCR kiểm tra sự có mặt của gen TP- codA-cmyc. Thành phần Thể tích phản ứng (µl) Master Mix (2X) 10 cDNA 3 Forward Primer 5 pM 1 Reverse Primer 5 pM 1 H2O 5 Tổng thê tích 20 134 Chu kỳ nhiệt của phản ứng RT-PCR kiểm tra sự có mặt của gen TP-codA-cmyc Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Khởi đầu 940C 3 phút 1 Biến tính 940C 1 phút 35 Gắn mồi 550C 50 giây Kéo dài 720C 1 phút 30 giây 720C 10 phút 1 Giữ 40C ∞ *Phương pháp lai Weston blot Tách chiết protein bằng PBS (Phosphate-buffered saline) 0,05% Tween 20 Tiến hành lấy mẫu, cân và nghiền mẫu (bằng cối chày hoặc bằng máy nghiền mẫu) sau đó bổ sung đệm PBS (Phosphate-buffered saline) 0,05% Tween 20 rồi để đông. Tiến hành ly tâm hỗn hợp trong ống ở tốc độ 13000 vòng/phút, 15 phút. Hút dịch nổi phía trên. Biến tính protein: bổ sung vào dịch vừa hút được bằng simple buffer 4X và ủ ở 95oC trong 10 phút bằng máy PCR. Kỹ thuật SDS-PAGE: Protein được phân tách bằng điện di biến tính trên gel acrylamide 12,5% và chuyển qua màng nitrocellulose. - Đổ bản gel 1,5 mm với các thành phần như dưới và điện di SDS ở 20 mA Thành phần Gel tách (9 ml) Gel cô (2ml) dH2O 1,1 ml 1,3 ml Tris HCl 2,25 ml (1,5 M; pH 8,8) 0,5 ml (0,5 M; pH 6,8) Glycerol 50% 1,8 ml Acrylamide 30% 3,78 ml 0,35 ml SDS 10% 90 µl 10 µl APS 10% 60 µl 20 µl Temed 6 µl 2 µl 135 Lai Western blot - Sau khi điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide-SDS, gel được ngâm trong đệm chuyển màng lạnh (chuẩn bị màng: ngâm giấy lọc và màng nitrocellulose trong đệm chuyển ít nhất 5 phút). - Bước chuyển màng được thực hiện trên máy Pierce G2 Fast Blotter ở chế độ 25 V, 1,3 mA trong 20 phút. - Tháo màng, tráng màng bằng nước deion trong 5 phút; màng chứa kháng nguyên được phủ bằng 5% sữa tách bơ pha trong dung dịch PBS 0,05% Tween để qua đêm. - Rửa màng bằng dung dịch PBST 3 lần, mỗi lần 5 phút. - Phủ kháng thể 1: ngâm màng trong 15 ml dung dịch sữa 5% có chứa kháng thể c-myc nồng độ 180 µg/ml với độ pha loãng 100 lần, lắc trong 3 giờ ở nhiệt độ phòng. - Rửa màng bằng dung dịch PBST 3 lần, mỗi lần 5 phút. - Phủ kháng thể 2: ngâm màng trong 15 ml dung dịch sữa tách bơ 5% có chứa kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP (Horseradish Peroxidase) với độ pha loãng 2 500 lần trong 2 giờ; rửa màng bằng dung dịch PBST 3 lần, mỗi lần 10 phút. - Hiện màu trong dung dịch hiện màu có chứa cơ chất DAB cho đến khi hiện băng màu nâu. * Định lượng Glycine betaine (Grieve và Grattan, 1983) Hóa chất: Chuẩn bị potassium triiodide: lấy 15,7 g iot và 20 g kali iot hòa tan trong 100 ml nước cất và bảo quản ở tủ 40C. Chuẩn bị axit sunfuric 2N (có thể thay thế bằng HCl 2N): lấy 55 ml axit sunfuric hòa tan vào nước cất và dâng lên thể tích tới 1 lít (H2SO4 98% - 18N, HCl 37% - 11N). Tiến trình: - Lấy 1 g lá khô ráo rồi nghiền trong nước cất và rồi lọc (hoặc thay bằng li tâm thu dịch chiết). Sau khi lọc, lấy 1 ml dịch chiết trộn với 1 ml HCl 2N. 136 - Hỗn hợp này được chuyển vào cốc thủy tinh và bổ sung vào đó 0,2 ml dung dịch potassium triiodide, toàn bộ thể tích này được làm mát trong đá khoảng 90 phút trong máy lắc. - Sau đó bổ sung 2 ml nước cất được làm mát trong đá và 20 ml 1-2- diclometan (được làm mát ở -100C) vào hỗn hợp trên khoảng 1 phút - 2 phút khi ống vẫn được để trong đá (40C). Bỏ lớp nước phía trên và xác định mật độ quang học của lớp chất hữu cơ phía dưới ở bước sóng 365 nm. * Nồng độ của glycine betaine được tính toán từ đường chuẩn: Y- nồng độ glycine betain ( µg/ml), X-OD365 nm (Hàm lượng glycine betain (mg/g) = Y(µg/ml).V(ml).df / 1000.w(g)) X: giá trị OD365 nm của mẫu; V: thể tích dịch chiết (= số ml 1,2 diclometan); df: hệ số pha loãng (trong trường hợp này là “80” là 40 ml dịch chiết đã pha loãng bằng H2SO4 2N/0,5 ml phân tích); w: khối lượng mẫu (= 0,5 g); 1000: hệ số chuyển đổi đơn vị µg/g sang mg/g mẫu). Nồng độ glycine betain được chuẩn bị ở 50 µg/ml đến 200 µg/ml trong axit H2SO4 1N để dựng đường chuẩn.