Nghiên cứu sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn Pseudomonas SPP. trong môi trường ao nuôi cá tra (pangasianodon hypophthalmus ) ở tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ

Mỹ gốc Nga) phát hiện ra Streptomycine và nhận giải Nobel vào năm 1952. Tiếp theo, hàng loạt chất kháng sinh quan trọng khác đã được phát hiện và ứng dụng như: Bacitracin (1945), chloramphenicol (1947), polimixin (1947), chlortetracyclin (1948), cephalosporin (Brotzu, 1948), neomycin (1949), eritromicine (1952), validacine (1970)…(được trích dẫn bởi Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2002). 2.3.2 Hiện tượng kháng thuốc ở vi khuẩn Theo Bùi Thị Tho (2003), sự kháng thuốc của vi khuẩn được chia thành 2 loại: Một là kháng thuốc tự nhiên: Bản thân vi khuẩn bình thường đã có sẵn những men hay một chất x nào đó có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh. Hoặc có thể loại vi khuẩn đó không vị trí công kích, điểm tác động của chất kháng sinh. Ví dụ: Các vi khuẩn Gram âm không chịu tác dụng của Penicilin. Hai là kháng thuốc thu được: Vi khuẩn thu được những yếu tố kháng thuốc trong quá trình sống do sự đột biến ngẫu nhiên hoặc do tiếp xúc (Nicholas F. N, 1987). Khi có được các yếu tố kháng thuốc – plasmid, factor R, hay episome, nó có khả năng truyền ngang các yếu tố kháng này giữa các chủng cùng loài và giữa các loài với nhau. Theo Clowes (1973), Cohen (1965,1982), Johnson (1994)… có 3 phương thức mà vi khuẩn có thể truyền gen kháng thuốc theo chiều ngang là sự biến nạp, tải nạp và tiếp hợp (được Bùi Thị Tho trích dẫn, 2003). Theo Từ Thanh Dung và ctv. (2005), nguyên nhân dẫn đến hiện tượng kháng thuốc bao gồm: Một là sự kháng thuốc kháng sinh do sử dụng không đúng loại, liều lượng sẽ dẫn đến việc tạo các dòng vi khuẩn kháng thuốc, đây cũng là nguyên nhân chính gây ra sự thất bại về sản lượng thu hoạch tôm Đài Loan năm 1989; Hai là việc sử dụng thuốc kháng sinh ban đầu có thể sẽ mang lại tỉ lệ sống cao hơn nhưng lại sẽ tạo ra những dòng vi khuẩn kháng thuốc khó trị. Sự quay vòng trong việc sử dụng thuốc kháng sinh cũng góp phần tạo ra những dòng vi khuẩn kháng nhiều loại thuốc (đa kháng). Sự kháng thuốc có thể là do sự phát sinh ra cơ chế miễn dịch trong hệ di truyền của vi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 7 khuẩn. Do đó, sự kháng thuốc có thể được chuyển từ loại vi khuẩn này sang vi khuẩn khác. Để hạn chế khắc phục những nguyên nhân trên cần phải: Chuẩn đoán đúng bệnh để cho đúng thuốc và sử dụng đúng liều lượng thuốc, đúng thời gian qui định. Hạn chế sử dụng thuốc bừa bãi, tùy tiện khi chưa xác định được tác nhân gây bệnh. Không sử dụng đồng thời hai loại thuốc có tác dụng đối kháng nhau. Để kìm hãm sự phát sinh của các dòng vi khuẩn kháng thuốc, nên diệt khuẩn với liều lượng hữu hiệu. Nếu dùng thuốc với nồng độ thấp hơn qui định chúng có thể bình phục và sản sinh ra những dòng kháng thuốc cao hơn. Mặc khác, sự trao đổi của vi khuẩn gây bệnh giữa con người và động vật với nuôi thủy sản bằng nhiều con đường khác nhau (Hình 2.1), do đó sự kháng thuốc của vi khuẩn trên động vật thủy sản sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe và việc điều trị bệnh của con người. 2.3.3 Sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn Pseudomonas Theo Aoki (1988), các loài vi khuẩn gây bệnh trên cá như: Aeromonas salmonicida, A. hydrophila, Edwardsiella tarda, Pasteurella piscicida, CON NGƯỜI Bệnh viện, thành phố, nông thôn ĐỘNG VẬT TRÊN CẠN Cừu, Ngựa, Heo, Gia Cầm, Bò Sông, suối Thịt Chế biến Nước uống UỐNG HỆ THỰC VẬT Rau Cây ăn quả Nước uống Nước Bơi lội Thức ăn gia súc Biển MÔI TRƯỜNG NUÔI THUỶ SẢN (cá và giáp xác) Lò mổ Tiếp xúc trực tiếp Chuẩn bị, nấu, nướng.. Vật nuôi trong nhà Phế phẩm Nguồn nước, chất thải của nông trại Hình 2.1 Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật và con người (Prescott et al., 2000) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 8 Pseudomonas fluorescens và Vibrio anguillarum có chứa plasmid kháng thuốc kháng sinh. Cụ thể là: A. salmonicida có chứa plasmid R kháng chloramphenicol, sulfonamide, streptomycin (ở Nhật Bản) và với sulfonamide, streptomycin, spectinomycin, trimethoprim và tetracycline (ở Ireland) (Aoki, 1997) (được trích dẫn bởi Alderman, 2000). Theo nghiên cứu của Akinbowale et al. (2005) về sự kháng thuốc của vi khuẩn được phân lập từ các nguồn thủy sản ở Úc (100 giống vi khuẩn gram âm và 4 gram dương) với 19 loại kháng sinh (amoxycillin, ampicillin, cefazolin, cefotaxime, cefoperazone, ceftiofur, nalidixic acid, oxolinic acid, ciprofloxacin, chloramphenicol, florfenicol, gentamicin, kanamycin, erythromycin, tetracycline, oxytetracycline, sulfamethoxazole, trimethoprim and potentiated sulfonamide). Tác giả cho rằng: - Tần số xuất hiện sự kháng thuốc khác nhau ở các giống vi khuẩn. Hầu hết đều kháng với penicillins và một vài loài kháng với cephalosporins cũng như erythromycin. - Trong tổng số chủng vi khuẩn có 54,8% kháng với ampicillin and amoxicillin, 41,4% kháng với cefotaxime, 23,1% kháng cefazolin, 5,8% kháng ceftiofur và 1,9% kháng cefoperazone. Trong khi đó 47,1% kháng erythromycin, 16,4% kháng tetracycline và với oxytetracycline là 19,2%. - Kháng với gentamicin và kanamycin lần lượt 2,9% và 5,8%; 13,5% kháng acid nalidixic và 8,7% với acid oxolinic, kháng chloramphenicol và florfenicol là 6,7% và 8,7%. - Phân lập được 4,8% các loài kháng trimethoprim và 15,4% kháng sulfamethoxazol. Tìm thấy 3,9% kháng trimethoprim + sulfamethoxazole. Đặc biệt là tất cả các loài đều nhạy cảm ciprofloxacin. - Cả 4 chủng Pseudomonas spp. đều nhạy với ciprofloxacin, gentamicin and kanamycin. Trong đó: Một chủng nhạy với tất cả kháng sinh (19 loại). Ba chủng còn lại kháng cefotaxime, 2 chủng kháng với ampicillin và amoxycillin, 2 chủng kháng cefazolin. Kháng với ceftiofur ở 3 chủng và 2 chủng kháng với cefoperazone, chloramphenicol, florfenicol, trimethoprim, sulfamethoxazole và trimethoprim-sulfamethoxazole. Kháng với acid nalidixic and erythromycin ở 3 chủng. Tuy nhiên, chỉ có 1 chủng kháng acid oxolinic, 1 chủng kháng tetracycline và oxytetracycline. Le et al. (2005) nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn trong mô hình nuôi tôm- đước ở Việt Nam, tác giả thấy tác hại việc sử dụng thuốc kháng sinh phổ biến trong nuôi thủy sản làm cho tồn lưu kháng sinh trong PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 9 nước, trong bùn và tạo sự kháng thuốc của vi khuẩn trong môi trường. Kiểm tra sự kháng thuốc của vi khuẩn được phân lập từ 4 địa điểm nuôi tôm – đước khác nhau ở Việt Nam với norfloxacin (NOR), oxolinic acid (OXLA), trimethoprim (TMP) và sulfamethoxazole (SMX). Trong đó, vi khuẩn kháng với TMP và SMX. Trong mẫu bùn phân lập được chủ yếu vi khuẩn Baccillus và Vibrio kháng với với thuốc kháng sinh. Theo nghiên cứu về sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn trong ao nuôi cá da trơn. Chọn ngẫu nhiên 3 trại nuôi cá da trơn khác nhau, phân lập được 92 chủng vi khuẩn từ môi trường ao nuôi. Trong đó, tổng số chủng vi khuẩn thuộc họ: Enterobacteriaceae chiếm 49,1%, Pseudomonads chiếm 35,2%, Vibrionaceae chiếm 15,7%. Kiểm tra sự kháng thuốc của các chủng vi khuẩn phân lập được với 6 loại thuốc kháng sinh: oxytetracyline (OTC), chloramphenicol (CHL), trimethoprim - sulphamethoxazol (SXT), nitrofurantoin (NF), nalidixic acid (NA) và ampicillin (AM). Thấy phần lớn các chủng vi khuẩn đa kháng với AM-OTC-SXT-NA chiếm 17,8%, với OTC- SXT-NA chiếm 15,1%, với AM-C-FT-SXT-NA chiếm 13,7%, với AM-FT- OTC chiếm 9,6% và kháng với AM-C-FT-OTC-SXT-NA chiếm 8,2%, tiêu biểu là có 6 chủng P. pseudomallei và 1 chủng P. cepacia kháng với AM- OTC-SXT-NA, 10 chủng P. cepacia kháng với AM-C-FT-SXT-NA. Từ kết quả cho thấy, sự kháng thuốc trong thuỷ sản đang ở mức cao. Những kết quả này cho thấy khả năng kháng thuốc kháng sinh trong các loài vi khuẩn cá bản địa là một mối quan tâm lớn trong nghề nuôi cá da trơn ở vùng ĐBSCL (Sarter et al., 2007). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 10 Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện: từ 1/2009 - 5/2009. Địa điểm thực hiện: - Thu mẫu nước và mẫu bùn tại tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ. - Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thuỷ Sản - Khoa Thuỷ Sản - Trường Đại Học Cần Thơ. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ Phiếu ghi nhận thông tin khi thu mẫu (Phụ lục 1), que cấy, giấy vệ sinh, bao tay, giấy nhôm, giấy làm dấu, bọc nylon, dây thun, thùng trữ lạnh, hộp quẹt,… Chai nút mài 100 ml, ống nghiệm 10ml, đĩa petri, đèn cồn, que trãi thuỷ tinh, bình xịt cồn, cốc thủy tinh 250 ml, hộp đầu col pipet 0,5ml và 1ml, pipet 100-1000ml, lame, lamelle. Cân điện tử, máy trộn mẫu nước (vortex), máy khuấy từ, nồi khử trùng áp suất, tủ sấy khô, tủ ấm, tủ lạnh, tủ vô trùng. 3.2.2 Môi trường, hoá chất và vật liệu nghiên cứu Hoá chất: NaCl, cồn 96o, cồn 70o, glycerol, nước cất, các loại hoá chất nhuộm Gram,… Thuốc kháng sinh (12 loại): trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT/ 1,25 µg - 23,75 µg), tetracyline (TE/30 µg), cefazolin (CEZ/30 µg), norfloxacin (NOR/5µg), nitrofurantoin (NF/300 µg), rifampicin (RA/30 µg), ampicillin (AM/10 µg), streptomycin (SM/10 µg), chloramphenicol (CHL/30 µg), neomycin (NM/30 µg), flumequin (FM/30 µg), doxycycline (DO/30µg). Hầu hết, những thuốc kháng sinh này của Bio-Rad, riêng cefazolin và norfloxacin của Oxoid. Thuốc kháng sinh tinh dùng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu: Oxytetracycline hydrochloride, chloramphenicol, streptomycin. Môi trường chung: Trypton soy agar (TSA), nutrient broth (NB), brain heard in broth (BHIB), mueller hinton agar (MHA). Môi trường chọn lọc: Glutamate starch phenol red agar (GSP Agar), Pseudomonas isolation agar. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 11 Nguồn vi khuẩn: 30 chủng Pseudomonas spp. phân lập được từ môi trường ao nuôi cá tra ở 3 tỉnh Trà Vinh, Cần Thơ và Bến Tre. Hai chủng vi khuẩn tham khảo Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Địa điểm thu mẫu Chọn số ao nuôi cá thâm canh ở 3 tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ. 3.3.2 Mẫu vi khuẩn Tổng số ao được thu là: 30 ao (30 mẫu nước + 30 mẫu bùn). Mỗi tỉnh tiến hành thu 10 ao. 3.3.3 Phương pháp thu mẫu Thu hai đợt trong chu kỳ nuôi: Một đợt trong tháng đầu và một đợt vào tháng cuối của vụ nuôi và thu mẫu khi có bệnh xảy ra đột xuất. Mẫu nước và bùn được thu ở ba điểm khác nhau ở trong ao: điểm cấp nước vào, giữa ao và điểm thoát nước. Phương pháp thu mẫu nước và bùn theo tài liệu của Le et al. (2005). Đối với mẫu nước: tại mỗi điểm thu 100 ml bằng chai nút mài tiệt trùng và thu cách mặt nước 0-20 cm. Đối với mẫu bùn: tại mỗi điểm thu 10 ml bằng dụng cụ chuyên biệt (drivers) và thu ở lớp mặt 1 cm, sau đó cho mẫu vào chai đã tiệt trùng. Tất cả mẫu thu được trữ lạnh ở 4oC và chuyển về phòng thí nghiệm phân tích trong vòng 24 giờ. 3.3.4 Phương pháp phân tích vi khuẩn trong mẫu nước và bùn a. Mẫu nước Các chai nước được lấy ra khỏi thùng và điều chỉnh về nhiệt độ phòng. Sau đó rút bỏ một ít nước trong mỗi chai sao cho có thể đảo đều mẫu nước trong chai. Ở mỗi chai hút 30ml cho vào một chai rỗng đã được khử trùng. Trộn đều mẫu nước và tiến hành phân tích theo phương pháp của (Le et al., 2005). Pha loãng 1 ml mẫu nước ban đầu thành 10ml trong nước muối sinh lý đã được tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Mẫu được pha loãng đến 10-4. Rút 0,1ml từ những mẫu pha loãng trãi đều trên môi trường GSP Agar sau đó đem ủ trong điều kiện hiếu khí ở 28oC và đọc kết quả khi mẫu được ủ sau 24 giờ. Tất cả các thao tác đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng. b. Mẫu bùn PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 12 Các chai bùn được lấy ra khỏi thùng và điều chỉnh về nhiệt độ phòng. Sau đó, cho tất cả bùn từ 3 chai được thu tại 3 điểm trong ao vào cùng một chai đã tiệt trùng và đảo đều mẫu sau đó tiến hành phân tích theo phương pháp của Le et al. (2005). Pha loãng 1g mẫu bùn với 10ml trong nước muối sinh lý đã được tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Mẫu được pha loãng đến 10-4. Lấy 0.1ml từ những mẫu pha loãng trãi đều trên môi trường GSP Agar sau đó đem ủ trong điều kiện hiếu khí ở 28oC và đọc kết quả khi mẫu được ủ sau 24 giờ. Tất cả các thao tác đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng. c. Chọn vi khuẩn Theo như chỉ dẫn của nhà sản xuất, chọn khuẩn lạc rời, tạo sắc tố đỏ trên đĩa môi trường GSP ở mẫu nước và mẫu bùn. Sau đó tiến hành tách ròng sang đĩa mới đến khi thuần thì trữ lại. 3.3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn Xác định các đặc điểm về hình thái, sinh-hóa: kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản (primary test). Vi khuẩn được định danh theo phương pháp của Frerichs và Millar (1993) và sử dụng dòng vi khuẩn tham khảo là: P.aeruginosa. 3.3.5.1 Xác định các chỉ tiêu cơ bản (Theo cẩm nang Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993)) Quan sát tính di động. Nhuộm Gram. Phản ứng oxidase. Phản ứng catalase. Khả năng lên men và oxy hoá đường glucose (Fermentation/oxidation: O/F). 3.3.5.2 Phương pháp sử dụng bộ kit API 20E (Biomerieus® SA I’Etoile - France) 3.3.6 Phương pháp lập kháng sinh đồ (Theo phương pháp của Kirby Bauer) Phương pháp xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ. Vi khuẩn sau khi được phục hồi, kiểm tra tính thuần thì tiến hành làm kháng sinh đồ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 13 Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng. Trộn đều và tiến hành xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm và điều chỉnh để xác định mật số vi khuẩn đạt 108 cfu/ml (OD = 0,1 ± 0.02). Sau khi xác định mật số vi khuẩn thì tiến hành trãi dung dịch vi khuẩn lên môi trường thạch. Dùng tăm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn, quét đều trên môi trường thạch MHA. Sau đó để yên khoảng 1 phút rồi dùng pel tiệt trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa petri sau cho khoảng cách giữa 2 tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa petri 10-15mm. Mỗi đĩa petri (đường kính 100 mm) môi trường đặt tối đa 6 đĩa kháng sinh. Sau khi hoàn tất việc dán đĩa thuốc kháng sinh, đặt đĩa petri vào tủ ấm ở điều kiện 280C. Sau 24 giờ tiến hành đọc kết quả. Ghi chú: - Phải lắc đều vi khuẩn và được lặp lại 3 lần. - Sử dụng chủng tham khảo E. coli. Đọc kết quả Đo đường kính vòng vô trùng (mm) dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng của nhà sản xuất để xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình nhạy và kháng. Kết quả đường kính vòng vô trùng của 2 trong 3 lần lặp lại sai khác không đáng kể thì ghi nhận kết quả của 2 lần lặp lại đó hoặc kết quả trung bình của 3 lần lặp lại đó. 3.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Qua việc sàn lọc kết quả kháng sinh đồ, chọn 4 chủng vi khuẩn Pseudomonas spp. (PTV083, PCT0914, PTV0923, PBT0925) để xác định giá trị MIC đối với 3 loại thuốc kháng sinh (oxytetracycline, streptomycin, chloramphenicol), thực hiện cùng 2 chủng tham khảo P. aeruginosa và E. coli. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn dựa trên phương pháp (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006b). v Các bước tiến hành: Ø Chuẩn bị hóa chất - môi trường PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 14 Vi khuẩn được lấy từ tủ đong -80oC sau khi rã đông thì được cấy lên môi trường TSA, ủ trong tủ ấm từ 28oC sau 24 giờ. Riêng với vi khuẩn đối chứng E. coli, ủ ở 37oC. Kiểm tra và ghi nhận các đặc điểm hình thái của vi khuẩn, hình dạng, kích thước màu sắc khuẩn lạc và nhuộm Gram để xác định tính thuần. Nếu vi khuẩn chưa thuần thì tiếp tục tách ròng cho đến khi đạt được đĩa cấy thuần. Khi vi khuẩn đã thuần, lấy một ít khuẩn lạc trên đĩa TSA cho vào ống nghiệm chứa 5 ml BHIB, ủ ở 28oC, trong 18-20 giờ. Ø Chuẩn bị dung dịch thuốc Chuẩn bị dung dịch thuốc gốc: Chuẩn bị 2 chai (50 ml) dung dịch thuốc gốc có nồng độ 1024 và 256 µg/ml bằng dung môi thích hợp. Pha loãng 2 lần các nồng độ: 0,5; 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 512; 1024 µg/ml. Pha loãng bằng nước muối sinh lý (Bảng phụ lục 3). Chú ý: Ống nghiệm có nồng độ thuốc 512 và 256 µg/ml sẽ được pha loãng từ dung dịch thuốc gốc 1024 µg/ml. Những ống nghiệm thuốc còn lại 128; 64; 32;…; 0,5 µg/ml được pha loãng từ dung dịch thuốc gốc 256 µg/ml. Cần lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng các dung dịch thuốc tiếp theo. Nồng độ thuốc sẽ giảm đi một nữa khi cho dung dịch vi khuẩn vào. Ghi tên thuốc và nồng độ trước khi bắt đầu thí nghiệm. Ø Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn Xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm và điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường NB (không dùng nước cất) ở điểm OD = 0,1±0,02 (mật số vi khuẩn khoảng 108 CFU/ml), pha loãng để đạt được mật số vi khuẩn 105 cfu/ml. Sau đó, mỗi chủng vi khuẩn đều được cấy trên môi trường TSA để kiểm tra sự thuần chủng vi khuẩn và được ủ trong điều kiện với các ống MIC. Cho 3 ml dung dịch vi khuẩn vào từng ống nghiệm có chứa 3 ml dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau: 0,5; 1; 2;…; 512 µg/ml (cần lắc đều). Thí nghiệm có 2 đối chứng: Đối chứng âm: (3 ml BHIB + 3 ml nước muối sinh lý). Đối chứng dương: (3 ml dung dịch vi khuẩn + 3 ml nước muối sinh lý). Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28oC, trong 24 giờ (đến khi thấy vi khuẩn trong đối chứng dương phát triển). Ø Đọc kết quả PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 15 Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn, nếu có tạp khuẩn thì loại bỏ kết quả hoặc loạt ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển không liên tục thì làm lại thí nghiệm. Đọc kết quả bằng cách so sánh độ đục của ống MIC với ống đối chứng âm và dương. Giá trị nồng độ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của thuốc kháng sinh, ở đó không có vi khuẩn phát triển. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 16 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn Sau 3 đợt thu mẫu ở Trà Vinh, Cần Thơ và Bến Tre, phân lập được 80 chủng vi khuẩn trong môi trường ao nuôi cá tra thâm canh (Phụ lục 4). Tất cả các chủng vi khuẩn này có khả năng tạo sắc tố đỏ trên môi trường GSP agar ( môi trường chọn lọc Aeromonas spp. và Pseudomonas spp.) (Hình 4.1) Chọn ngẫu nhiên 30 chủng vi khuẩn từ 80 chủng phân lập được, trong đó có 10 chủng từ mẫu nước, 20 chủng từ mẫu bùn. Tiến hành kiểm tra các chi tiêu cơ bản. Qua kết quả kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản (Phụ lục 6) thấy hầu hết các chủng vi khuẩn Gram âm, hình que (Hình 4.2), di động được, oxidase và catalase dương tính, trừ một vài chủng oxidase âm tính, đa số các chủng không cho phản ứng oxidation/fermentation (O/F) (Hình 4.3), ch ỉ có một số cho phản ứng oxidation (O) (Hình 4.3). Sau khi kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản cho phép định danh 30 chủng vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas. Giống vi khuẩn này phân bố khắp nơi trong môi trường, trong đất và nước. Sazakli et al. (2005) phân lập được 160 chủng Pseudomonas spp. từ nhiều nguồn nước khác nhau ở Greece gồm có Hình 4.1 Vi khuẩn trên môi trường GSP Hình 4.3 Kết quả test O/F Hình 4.2 Kết quả nhuộm Gram (100X) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 17 P. aeruginosa, P. stutzeri, P. alcaligenes, P. putida, P. fluorescens, P. mendocina… 4.2 Kết quả lập kháng sinh đồ Sử dụng kháng sinh để phòng và trị bệnh trong nuôi thủy sản, là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự hình thành các mầm bệnh vi khuẩn kháng kháng sinh, gây khó khăn cho việc điều trị bệnh động vật thủy sản, ảnh hưởng đến động vật nuôi và con người. Sự kháng kháng sinh của các chủng Pseudomonas spp. phân lập từ môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) ở 3 tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ đã được xác định, 30 chủng Pseudomonas spp. thử nghiệm với 6 kháng sinh (tetracyline, chloramphenicol, doxycycline, flumequin, streptomycin, trimethoprim-sulfamethoxazole) và chọn ra 12 chủng thử thêm với 6 loại kháng sinh (norfloxacin, cefazolin, rifampicin, ampicillin, neomycin, nitrofurantoin). Bảng 4.1 Tính kháng thuốc của 30 chủng Pseudomonas spp. với kháng sinh Kháng sinh Kháng Trung bình Nhạy Tổng số chủng Số chủng % Số chủng % Số chủng % TE 6 20 4 13 20 67 30 CHL 18 60 5 17 7 23 30 DO 2 6.7 10 33 18 60 30 FM 12 40 1 3.3 17 57 30 SM 20 66,7 9 30 1 3,3 30 SXT 13 43.3 10 33.3 7 23,3 30 NOR 5 42 1 8.3 6 50 12 CFZ 12 100 0 0 0 0 12 RA 11 91.7 1 8.33 0 0 12 AM 12 100 0 0 0 0 12 NM 4 33.3 4 33.3 4 33,3 12 NF 11 91.7 0 0 1 8,3 12 Ghi chú: Tetracyline (TE/30 µg), chloramphenicol (CHL/30 µg), doxycycline (DO/30µg), flumequin (FM/30 µg), streptomycin (SM/10 µg), trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT/ 1,25 µg - 23,75 µg), norfloxacin (NOR/5µg), cefazolin (CEZ/30 µg), rifampicin (RA/30 µg), ampicillin (AM/10 µg), neomycin (NM/30 µg), nitrofurantoin (FT/300 µg). Qua Bảng 4.1, thấy đa số các chủng Pseudomonas spp. thí nghiệm kháng với các kháng sinh, mỗi loại kháng sinh đều có chủng vi khuẩn kháng , tương tự như nghiên cứu của Sokarid et al. (1988) về sự kháng thuốc của vi khuẩn thuộc nhóm coliform và Pseudomonas spp. trong môi trường nước ở Port Harcourt, Nigeria: Tất cả 157 chủng Pseudomonas spp. phân lập được đều kháng một trong 10 loại thuốc kháng sinh thử nghiệm và có đến 151 chủng kháng từ 2 loại thuốc trở lên. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 18 4.2.1 Sự kháng thuốc của 30 chủng Pseudomonas spp. với 6 kháng sinh 7 18 17 1 7 4 5 10 1 9 10 6 18 2 12 20 20 13 0 3 6 9 12 15 18 21 TE CHL DO FM SM SXT Đối với doxycyclin (DO) và tetracycline (TE), thuộc nhóm tetracycline, hơn phân nửa chủng vi khuẩn nhạy với 2 kháng sinh này (Hình 4.4). Tuy nhiên, có đến 6 chủng kháng với TE còn kháng DO thì chỉ có 2 chủng, vì thế DO nhạy với Pseudomonas spp. hơn TE, theo Lê Thị Kim Liên và ctv. (2008), xét về mặt dược lí, chia nhóm kháng sinh này làm 2 thế hệ: Thế hệ I và II, trong đó TE, oxytetracycline… thuộc thế hệ I có thời gian tác động ngắn còn DO, minocyclin thuộc thế hệ II được tổng hợp gần đây có thời gian tác động dài. Xét về mặt hiệu lực xếp theo thứ tự giảm dần minocyclin mạnh nhất rồi đến DO, TE, oxytetracycline. Nhóm tetracycline được sử dụng trong nuôi thủy sản bằng cách trộn vào thức ăn hoặc tắm (trích dẫn của Từ Thanh Dung, 2008) mà theo Bùi Thị Tho (2003), DO hấp thu tốt ở đường tiêu hóa. Tương tự, flumequin (FM) thuộc thế hệ I của nhóm Fluroquinolon, có 12 chủng kháng với FM (Hình 4.4), theo Bùi Thị Tho (2003) nhóm này Hình 4.5 Kết quả kháng sinh đồ chủng PTV085 chủng vi khuẩn kháng sinh Hình 4.4 Sự kháng thuốc của 30 chủng Pseudomonas spp. với kháng sinh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 19 thường có phổ tác dụng rộng, có tác dụng rất tốt trên vi khuẩn thuộc họ đường ruột (trực khuẩn Gram âm khó tính bao gồm cả Pseudomonas…). Theo Bùi kim Tùng (2001), streptomycin (SM) cùng nhóm aminosid không hấp thu qua ruột nên không dùng không uống mà sử dụng phương pháp tiêm, ở người SM chủ yếu trị bệnh lao, nhưng tỉ lệ kháng (66,7%) cao hơn NM. Trong thí nghiệm này, SM có tỷ lệ kháng cao với 30 chủng thì có đến 20 chủng kháng SM (Hình 4.4), chỉ có 1 chủng nhạy. Sokari et al. (2005) xác định trong 157 chủng Pseudomonas spp. thì có 56 chủng kháng (35,67%). Trong 30 chủng thí nghiệm thì có 13 chủng kháng với trimethoprim- sulfamethoxazole (SXT), tỉ lệ kháng (43,3%) chưa đến 50%, còn với chloramphenicol (CHL) tỉ lệ kháng cao đến 60% (Bảng 4.1). So với nghiên cứu của Akinbowale et al. (2007) tỉ lệ kháng với SXT và CHL đều là 50%, thì các chủng vi khuẩn kháng với SXT thấp hơn và kháng với CHL cao hơn. Theo điều tra của Mai Văn Tài và ctv. (2004), có ít nhất 373 loại hoá chất và CPSH được sử dụng trong nuôi thủy sản thì có 5 loại bị cấm sử dụng trong đó có CHL. 4.2.2 Sự kháng thuốc của 12 chủng Pseudomonas spp. với 6 kháng sinh 6 4 11 1 4 5 12 11 12 4 11 0 2 4 6 8 10 12 14 NOR CEZ RA AM NM NF Norloxcin (NOR) thế hệ II của nhóm fluroquinolon, theo Bùi Kim Tùng (2001) nhóm kháng sinh này có khả năng ức chế hoạt động của enzym AND gyrase, enzyme này can thiệp vào việc sao chép và đảo trình tự các nucleotid trong quá trình sao chép AND, vì thế nếu lạm dụng fluroquinolon sẽ tạo ra những chủng vi khuẩn kháng thuốc vĩnh viễn do đột biến. Kết quả nghiên cứu này, thấy có đến 5 chủng Pseudomonas spp. kháng với NOR (42% chủng vi khuẩn). Newaj-Fyzul et al. (2008) xác định được 1 chủng trong 8 chủng vi khuẩn kháng sinh Hình 4.6 Sự kháng thuốc của 12 chủng Pseudomonas spp. với kháng sinh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 20 chủng Pseudomonas spp. phân lập được từ nước ao nuôi kháng với NOR (12,5%). Mặc khác, Nguyễn Thị Tiên (2007), nhóm Pseudomonas spp. phân lập từ ao nuôi tôm bệnh phân trắng kháng với NOR 25%. Đặc biệt với kháng sinh neomycin (NM) có tỉ lệ nhạy, nhạy trung bình, kháng đều là 33.3% (Bảng 4.1), Wooley et al. (2004) xác định P. aeruginosa kháng NM với giá trị MIC là 90 µg/ml. Kết quả kháng sinh đồ cho thấy 12 chủng Pseudomonas spp. thử nghiệm đều kháng với ampicillin (Hình 4.6), giống với nghiên cứu của Newaj - Fyzul et al. (2008), phân lập được 8 chủng Pseudomonas spp. trong mẫu nước ao nuôi cá rô phi ở Trinidad đều kháng với ampicillin (100%). Mặc khác, theo khảo sát của Trần Thanh Nguyên (2004), có 43,3% số hộ nuôi cá tra công nghiệp ở Thốt Nốt- Cần Thơ sử dụng ampicillin để điều trị bệnh. Tương tự, 100% chủng Pseudomonas spp. kháng với cefazolin (CEZ), kế đến là rifampicin (RA), nitrofurantoin (NF) có 11 chủng kháng trong số 12 chủng thí nghiệm. CEZ chủ yếu để trị bệnh mật ở người, bài xuất hoàn toàn qua thận trong 24h, ít uống chủ yếu dùng phương pháp tiêm. NF thuộc nhóm Nitrofuran, hầu hết các chất của nhóm này không hấp thu qua màng ruột, riêng NF hấp thu qua ruột, sau khi uống NF có nồng độ trong nước tiểu nên chủ trị bệnh nhiễm trùng đương tiểu ở người và bài xuất chủ yếu qua thận, không tác dụng với Pseudomonas (theo Bùi Kim Tùng, 2001). Nhìn chung, sự kháng thuốc của các chủng Pseudomonas spp. cao, trong 30 chủng thử nghiệm chỉ 5 chủng không kháng (Phụ lục 7), tuy nhiên 5 chủng này chỉ thử với 6 loại kháng sinh, có 13 chủng kháng từ 3 loại thuốc trở lên. Nếu những chủng vi khuẩn này là chủng gây bệnh thì sẽ gây khó khăn cho việc điều trị. Theo Nguyễn Đức Hiền (2008), cho rằng một trong những nguyên nhân làm cho hiệu điều trị bệnh ngày càng kém hiệu quả là do sự kháng thuốc của vi khuẩn. Với kết quả nghiên cứu kháng sinh đồ thực hiện trên cá tra bệnh gan thận mủ và xuất huyết nuôi tại các trang trại thuộc các địa phương như Cần Thơ, An Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, Hậu giang và Bến tre cho thấy mức độ nhạy của thuốc trên vi khuẩn (Edwardsiella ictaluri, Pseudomonas spp. và Aeromonas spp.) gây bệnh ngày càng giảm dần. Kết quả nghiên cứu kháng sinh đồ từ 1/2006–3/2008 với các kháng sinh (doxycilin, florfenicol, norfloxacin, enrofloxacin, amoxicilline) cho thấy độ nhạy của đa số kháng sinh được khảo sát ngày càng giảm dần chứng tỏ vi khuẩn gây bệnh ngày càng kháng thuốc nên dẫn đến tỉ lệ thành công trong điều trị càng thấp. Theo nghiên cứu của Sarter et al. (2007) về sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn trong ao nuôi cá da trơn ở 3 trại nuôi cá da trơn khác nhau, kiểm PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 21 tra sự kháng thuốc của các chủng vi khuẩn phân lập được với 6 loại thuốc kháng sinh: oxytetracyline (OTC), chloramphenicol (CHL), trimethoprim- sulphamethoxazol (SXT), nitrofurantoin (NF), nalidixic acid (NA) và ampicillin (AM). Thấy phần lớn các chủng vi khuẩn đa kháng, trong đó đã tìm thấy P. pseudomallei, P. cepacia kháng với AM-OTC-SXT-NA, 10 chủng P. cepacia kháng với AM-CHL-NF-SXT-NA. Còn trong thí nghiệm này, kháng từ 3 loại kháng sinh trở lên chiếm 43%, trong đó có chủng PCT0914 kháng đến 11 kháng sinh. Từ kết quả cho thấy, sự kháng thuốc của Pseudomonas spp. trong thí nghiệm đang ở mức cao. 4.3 Kết quả làm MIC Sau khi làm kháng sinh đồ chọn ngẫu nhiên 4 chủng Pseudomonas spp. (PTV083, PCT0914, PTV0923, PBT0925) làm MIC kết hợp 2 chủng tham khảo P. aeruginosa và E. coli Kết quả giá trị MIC của các chủng 2 chủng đối chứng phù hợp với giá trị MIC của những kháng sinh có trong tài liệu CLSI M49-A. Kết quả giá trị MIC của 4 chủng Pseudomonas spp. được trình bày ở Bảng 4.2 Bảng 4.2: Kết quả giá trị MIC của 4 chủng Pseudomonas spp. với 3 kháng sinh chloramphenicol, oxytetracycline, streptomycin. Chủng vi khuẩn Giá trị MIC (µg/ml) Chloramphenicol Oxytetracycline Streptomycin PTV083 32 8 4 PCT0914 >256 128 >256 PTV0923 128 12 >256 PBT0925 64 8 >256 Qua bảng số liệu cho thấy giá trị MIC của các chủng thấp nhất là 4 µg/ml và giá trị MIC cao nhất là ≥256 µg/ml. Nồng độ ức chế của chloramphenicol (CHL) với Pseudomonas spp. trải dài từ 32 đến ≥ 256 µg/ml , phù hợp với kết quả kháng sinh đồ (Phụ lục 7). Cả 4 chủng PBT0825; PTV083; PTV0923; PCT0914 đều kháng với CHL nhưng ở mức độ khác nhau, với giá trị MIC lần lượt là 32; 64; 128; ≥256 µg/ml. Theo Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv. (2005) được nồng độ ức chế của các chủng kháng với (CHL) lên đến ≥512 µg/ml. Thuốc kháng sinh này là một trong những loại thuốc nằm trong danh mục thuốc cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản (Phụ lục 8) do độc tính cao gây thoái hóa tủy xương, còi cọc, chậm lớn (Lê Thị Kim Liên và ctv., 2008). Vì thế việc xác định giá trị MIC PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 22 của các chủng Pseudomonas spp. trong thí nghiệm này chỉ mang ý nghĩa nghiên cứu, Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv.(2004) sưu tập được 10 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường ISA có bổ sung 256 µg/ml CHL để sử dụng cho mục đích khám phá gen qui định khả năng thích ứng của vi khuẩn với hàm lượng CHL cao trong môi trường, không nên áp dụng vào thực tiễn trong việc điều trị bệnh trong nuôi thủy sản. Chú thích: 1: Ống đối chứng (+); 2: Ống nồng độ 4µg/ml; 3: Ống nồng độ 8µg/ml 4: Ống nồng độ 16µg/ml; 5: Ống nồng độ 32µg/ml; 6: Ống nồng độ 64µg/ml 7: Ống nồng độ 128µg/ml; 8: Ống đối chứng (-). Đối với kháng sinh oxytetracycline, do cùng nhóm với tetracycline (TE) nên sẽ đối chiếu với kết quả kháng sinh đồ của TE, giá trị MIC của các chủng PTV083; PCT0914; PTV0923; PBT0925 lần lượt là 8; 128; 16; 8 µg/ml (Bảng 4.2). Kết quả này tương đối phù hợp, ở 2 chủng có cùng giá trị 8 µg/ml nhưng kết quả kháng sinh đồ khác nhau ở chủng PTV083 là nhạy còn PBT0925 là nhạy trung bình, tuy nhiên ở đây có thể do mức độ chênh lệch không nhiều so với khoảng cách giữa các nồng độ thuốc làm MIC nên không thể xác định được chính xác vì thế kết quả này có thể chấp nhận được. Kim et al. (2004) nghiên cứu về sự đa dạng của các gen kháng thuốc TE ở vi khuẩn đã xác định giá trị MIC của 3 chủng Pseudomonas là <31,3; 62,5; 250 µg/ml. Gần đây, Akinbowale et al. (2007) cũng nghiên cứu về tính đa dạng của gen kháng thuốc TE ở vi khuẩn từ các nguồn thủy sản ở Úc cho kết quả MIC của TE và oxytetracycline ở P. fluorescens là lớn hơn 128 µg/ml. Tuy nhiên 2 nghiên cứu đều không xác định được sự có mặt của gen kháng thuốc TE ở Pseudomonas spp. Kết quả kháng sinh đồ của 4 chủng PTV083; PCT0914; PTV0923; PBT0925 phù hợp với kết quả giá trị MIC của 4 chủng vi khuẩn với 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 4.7 Kết quả MIC của chủng PTV083 với chloramphenicol ở nồng độ là 64 µg/ml (mũi tên) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 23 streptomycin (SM) nằm trong khoảng từ 4 đến >256 µg/ml. Giá trị MIC cao ở 3 chủng đều >256 µg/ml cho thấy các chủng này kháng với SM ở mức cao, SM không hấp thu qua ruột nên thường sử dụng phương pháp tiêm là chủ yếu, vì thế SM không được sử dụng phổ biến trong nuôi thủy sản, có nhiều nguyên nhân, có thể do có sự chuyển đổi gen môi trường theo nhiều con đường khác nhau (Hình 2.1). Để xác định được nguyên nhân cần có những nghiên cứu sâu hơn về bản chất của sự kháng thuốc của vi khuẩn Pseudomonas spp. Tuy nhiên, không tìm thấy sự khác biệt về tính kháng thuốc của vi khuẩn Pseudomonas spp. trong môi trường ao nuôi cá tra ở 3 tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Cần Thơ. Vì Pseudomonas phân bố khắp nơi trong môi trường, đất, nước, là tác nhân gây bệnh trên nhiều đối tượng (người, động vật và thực vật), mà sự lan truyền tính kháng thuốc của vi khuẩn giữa người và động vật, môi trường…qua nhiều con đường khác nhau (Hình 2.1), nên không thể thấy sự khác biệt về tính kháng thuốc của các chủng vi khuẩn ở các tỉnh trong đề tài này . PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 24 Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Kết quả định danh được 30 chủng Pseudomonas spp. từ môi trường ao nuôi cá tra ở 3 tỉnh Trà Vinh, Bến Tre, Cần Thơ. Qua kết quả kháng sinh đồ cho thấy các chủng Pseudomonas spp. kháng tỉ lệ kháng cao nhất là đối với ampicillin và cefazolin 100%, kế là nitrofurantoin và rifampicin (91,7%), kế streptomycin (66,7%), chloramphenicol (60%), các kháng sinh còn lại tỉ lệ kháng thấp hơn 50%, thấp nhất là doxycycline (6,7%), từ đó cho thấy doxycycline nhạy với các chủng Pseudomonas spp. thí nghiệm. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của 4 chủng Pseudomonas spp. (PTV083, PCT0914, PTV0923, PBT0925) với chloramphenicol trong khoảng từ 32-256 µg/ml , với oxytetracycline là 8-128 µg/ml, với streptomycine là 4- 256 µg/ml. 5.2 Đề xuất Cần mở rộng địa bàn thu mẫu và tăng lượng mẫu nhằm đánh giá toàn diện hơn khả năng kháng thuốc của vi khuẩn Pseudomonas spp. trong ao nuôi cá tra. Cần định danh Pseudomonas spp. trong ao nuôi đến loài và có những nghiên cứu sâu về cơ chế kháng thuốc của loài vi khuẩn này, từ đó đưa ra những giải pháp khống chế hiện trạng kháng thuốc có hiệu quả trong nuôi thủy sản. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Akinbowale, O.L., H. Peng and M.D. Barton, 2005. Antimicrobial resistance in bacteria isolated from aquaculture sources in Australia. The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology 100. School of Pharmaceutical and Medical Sciences, University of South Australia, Adelaide, Australia. p1103–1113. 2 Akinbowale, O.L., H. Peng and M.D. Barton, 2007. Diversity of tetracycline resistance genes in bacteria from aquaculture sources in Australia. Journal compilation. The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology 103 (2007): p2016–2025. 3 Alderman, D. J, 2000. Antimicrobial drug use in aquaculture. In S. Giguere, J.F. Prescott, D. Baggot, R.D.Walker, and P.M. Dowling (eds.). Antimicrobial therapy in veterinary medicine. Lowa State University Pree/Ames. P 705-706. 4 Al-Harbi, A.H. and N.Uddin, 2003. Quantitative and qualitative studies on bacterial flora of hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O. aureus) cultured in earthen ponds in Saudi Arabia. Aquaculture Research, Volume 34. p 43-48. 5 Barrow, G.I. and R. K. A. Feltham, 1993. Cowan and Steel’s manual for the indentification of medical bacteria, 3rd edn. Cambridge Univesity. 262pp. 6 Bauer, A.W. and W.M. Kirby, 1966 . Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disc method. American Jounal of Clinical Pathology, V. 45, p493-496. 7 Bùi Kim Tùng, 2001. Thuốc kháng sinh. Sở khoa học và công nghệ Bà Rịa- vũng Tàu. 255 trang 8 Bùi Thị Tho, 2003. Thuốc kháng sinh và nguyên tắc sử dụng trong chăn nuôi. Nhà xuất bản Hà Nội. 323 trang. 9 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006. Methods for borth dilution susceptibility testing of bacteria isolated from aquatic animals: M49-A. Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne. USA. 10 Đặng Thị Bé, 2008. Xử lí đạm trong nước ao nuôi cá tra bằng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri và vi khuẩn Rhodopseudomonas spp. Luận văn tốt nghiệp đại học. Khoa thủy sản. Trường Đại học Cần Thơ. 43 trang. 11 Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Minh Hậu và Nguyễn Thanh Phương, 2004. Thiết lập bộ sưu tập vi khuẩn kháng thuốc kháng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 26 sinh chloramphenicol tại khoa thủy sản, đại học Cần Thơ. Tạp chí Nghiên cứu Khoa học 2004. Trường Đại học Cần Thơ. Trang 76-81. 12 Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, Temdoung Somsiri, Supranee Chinabut, Fatimah Yussoff, Mohamed Shariff, Kerry Bartie, Geert Huys, Mauro Giacomini, Stefania Berton, Jean Swings and Alan Teale, 2005. Xác định tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ các hệ thống nuôi thủy sản ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam. Tập chí nghiên cứu khoa học. Trường Đại học Cần Thơ. 13 Đặng Thị Hoàng Oanh, Từ Thanh Dung, Trần Thị Tuyết Hoa, 2005. Giáo trình bệnh học thủy sản. Đại học Cần Thơ. Trang 47-48. 14 Dung, T.T., F.Haesebrouck, N.A.Tuan, P.Sorgeloos, M.Baele, A.Decosrere, 2008. Antimicrobial susceptibility pattern of Edwardsiella ictaluri isolates from natural outbreaks of bacillary necrosis of Pangasianodon hypophthalmus in Vietnam. Microbial drug resistance, volume 14, number 4, 2008. p 311-316. 15 Dzung, N. H, 2007. Vietnam pangasius and World Markets. Global trade conference on Aquaculture, Qingdao, 29-31 May 2007. 16 Inglis, V. and M. S. Hendrie, 1993. Pseudomonas and Alteromonas infections. Bacterial disease of fish. Institute of Aquaculture, Scotland, UK. p 169-172. 17 Kim, S.R., L. Nonaka and S. Suzuki, 2004. Occurrence of tetracycline resistance genes tet(M) and tet(S) in bacteria from marine aquaculture sites. FEMS Microbiology, Letters. 237: 147–156. 18 Kobayashi,T., M. Imai, Y. Ishitaka and Y. Kawaguchi, 2004. Histopathological studies of bacterial haemorrhagic ascites of ayu, Plecoglossus altivelis (Temminck & Schlegel). Journal of Fish Diseases 27: p451–457. 19 Lê Thị Kim Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, Nguyễn Thị Như Ngọc, Phạm Thanh Liêm, 2008. Bài giảng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản. Khoa thủy sản. Đại học Cần Thơ. Trang 76.(79 trang). 20 Le, T. X., Y. Munekage and S. Kato, 2005. Antibiotic resistance in bacteria from shrimp farming in mangrove areas. Science of the Total Environment 349 (2005): 95-105. 21 Mai Văn Tài, Tống Hoài Nam, Lý Thị Thanh Loan, Phạm Văn Tình,…, 2004. Điều tra đánh giá hiện trạng các loại thuốc, hóa chất và chế phẩm sinh học dung trong nuôi trồng thủy sản nhằm đề xuất các giải pháp PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 27 quản lý. Báo cáo đề tài khoa học, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 1. 24 trang. 22 Newaj-Fyzul, A., A. Mutani, A. Ramsubhag and A. Adesiyun, 2008. Prevalence of bacterial pathogens and their antimicrobial resistance in Tilapia and their Pond Water in Trinidad. Journal compilation Blackwell Verlag. Zoonoses Public Health. 55 (2008): p 206–213. 23 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 2002. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo dục. Hà Nội. Trang 14. 24 Nguyễn Thị Tiên, 2007. Xác định đặc điểm sinh hóa của và khả năng kháng thuốc của mầm bệnh phân lập trên tôm sú (Penaeus monodon) bệnh phân trắng. Luận văn tốt nghiệp đại học. Khoa thủy sản. Đại học Cần Thơ. 48 trang. 25 Phan Thị Vân, Nguyễn Thị Hà, Kim Văn Vạn, Phạm Thị Yến, Trần Thị Kim Chi, Phạm Văn Khang, Đặng Thị Lụa, Phạm Văn Thư và Nguyễn thị Nguyện, 2002. Xác định tác nhân gây bệnh đốm đỏ và xuất huyết trên cá trắm cỏ. Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1. 5 trang. 26 Sarter. S, H. N. K. Nguyen, L.T. Hung, J. Lazard and D. Montet, 2007. Antibiotic resistance in Gram-negative bacteria isolated from farmed catfish. Food Control 18. p 1391-1396. 27 Sazakli, E. , M. Leotsinidis, A. Vantarakis and M. Papapetropoulou, 2005. Comparative typing of Pseudomonas species isolated from the aquatic environment in Greece by SDS-PAGE and RAPD analysis. Journal of Applied Microbiology, 99: 1191–1203. 28 Stock, I. and B. Wiedemann, 2001. Natural Antibiotic Susceptibilities of Edwardsiella tarda, E. ictaluri, and E. hoshinae. Antimicrobial agents and Chemotherapy, Vol. 45, No. 8: p2245–2255. 29 Trần Thanh Nguyên, 2004. Khảo sát tình hình sử dụng thuốc và hóa chất đối với nghề nuôi cá tra công nghiệp trong ao ở Thốt Nốt- Cần Thơ. Tiểu luận tốt nghiệp đại học. Khoa thủy sản. Trường Đại học Cần Thơ. 30 trang. 30 Từ Thanh Dung, 2008. Bài giảng bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản. Khoa Thủy Sản. Trường Đại Học Cần Thơ. 127 trang. 31 Wooley, R.E, Branson W. Ritchie, Victoria V. Burnley, 2004. In vitro effect of a buffered chelating agent and neomycin or oxytetracycline on bacteria associated with diseases of fish. Diseases of aquatic organisms, 59 (2004): 263–267. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 28 32 Bến Tre: Con cá tra “bơi” vào vùng nước lợ. 432 (cập nhật ngày 13/2/2008). 33 Dương Thị Mỹ Hận, Phức hệ vi sinh vật trong trại sản xuất giống tôm càng xanh (Macrobrachiumrosenbergii). (Cập nhật 18/03/2007). 34 Đặng Văn Bường, 2008. Nuôi thủy sản ở Trà Vinh. DMwQ3Z9ITbmM3dl52X3VWa21TMtZSbh5Gdllmd9ATb (Cập nhật ngày 17/10/2008) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 29 PHỤ LỤC Phụ lục 1 PHIẾU THU MẪU Số TT:……. Ngày thu mẫu: ........................................................................................................ Họ và tên người nuôi: ............................................................................................. Địa chỉ: ................................................................................................................... Điện thoại: .............................................................................................................. Loài cá: ................................................................................................................... Tuổi hay cỡ cá: ....................................................................................................... Trọng lượng (g): ..................................................................................................... Chiều dài (cm): ........................................ Chiều cao (cm): .................................... Kích thước ao: Dài (m): ............ Rộng (m): .................. Sâu (m): ......................... Kích thước bè: Dài (m): ............ Rộng (m): .................. Sâu (m): ......................... Số lượng cá thả trong ao hay bè: ............................................................................ Mật độ cá thả (con/m2, con/m3): ........................................................................... Ngày thả cá: ............................................................................................................ Nguồn giống: .......................................................................................................... Vệ sinh, cải tạo ao/bè (có/không): .......................................................................... Hóa chất đã sử dụng, liều lượng: ............................................................................ Vôi: ......................................................................................................................... Thuốc tím: .............................................................................................................. Các loại khác: ......................................................................................................... ................................................................................................................................ Loại thức ăn: ........................................................................................................... Ngày mua thức ăn: ................................................................................................. Thức ăn tươi sống:................................................................................................ % thức ăn/trọng lượng cơ thể: ................................................................................ Tần số cho ăn: ......................................................................................................... Thức ăn chế biến: ................................................................................................. % thức ăn/trọng lượng cơ thể: ................................................................................ Tần số cho ăn: ......................................................................................................... Nguồn nước: .......................................................................................................... PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 30 Chất lượng nước: .................................................................................................... Các chỉ tiêu môi trường: ......................................................................................... pH: ................................ NH4+: ................................. Độ kiềm: ........................... Màu nước trong ao hay bè: ..................................................................................... Có thay nước hay không: ....................................................................................... Thời gian thay nước: .............................................................................................. Ngày xuất hiện bệnh: ............................................................................................ Số cá chết hàng ngày: Tăng/giảm: ......................................................................... Ngày bắt đầu dung thuốc: ....................................................................................... Các loại thuốc đã sử dụng, liều lượng: ................................................................... Loại thuốc sử dụng có hiệu quả không: ................................................................. Người thu mẫu ...……............. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 31 lame Giọt dung dịch vi khuẩn vaseline Phụ lục 2 Xác định các chỉ tiêu cơ bản (Theo cẩm nang Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993)) Quan sát tính di động Sự di động của vi khuẩn có thể quan sát bằng phương pháp giọt nước treo ở vật kính 40X. Các bước thực hiện như sau: Cho Vaseline lên bốn góc của lamelle và đặt ngửa lamelle trên bàn. Dùng que cấy tiệt trùng lấy nước muối sinh lý cho lên lamelle. Tiệt trùng que cấy, lấy một ít vi khuẩn cho lên lamelle hoà vào nước muối sinh lý. Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn . Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước được treo ngược trên lamelle. Đặt lame lên kính hiển vi quan sát tính di động của vi khuẩn ở vật kính 40X. Nhuộm Gram Chuẩn bị tiêu bản: Nhỏ một giọt nước cất lên lame, dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn trãi đều lên giọt nước cất. Để khô ở nhiệt độ phòng sau đó hơ lướt lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn trên lame. Các bước nhuộm Gram: Nhuộm crystal violet khoảng 1 phút. Rửa bằng nước cho hết màu tím trên lame (khoảng 2 giây), để khô ở nhiệt độ phòng. Nhuộm iodine trong 1 phút, rửa lame bằng nước. Rửa bằng dung dịch 95% cồn: 5% aceton để tẩy màu bằng cách nghiêng lame rồi nhỏ từ từ dung dịch cho đến khi giọt nước cuối lame không còn màu tím. Rửa và để khô ở nhiệt độ phòng. Nhuộm safranin khoảng 2 phút. Rửa và để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, vật kính 100X (có giọt dầu). Đọc kết quả: Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh. Vi khuẩn Gram âm (G-) có màu hồng đỏ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 32 Phản ứng oxidase Sử dụng test Bactident Oxidase. Dùng que cấy phết một ít vi khuẩn lên giấy tâm cytochrome oxidase. Vi khuẩn cho phản ứng oxidase (+) sẽ làm giấy chuyển sang màu tím hoặc tím đen trong vòng 60 giây và ngược lại. Phản ứng catalase Dung que cấy nhặt một ít vi khuẩn lên lame, sau đó nhỏ lên vi khuẩn một giọt H2O2 3%. Vi khuẩn cho phản ứng catalase (+) sẽ gây ra hiện tượng sủi bọt trong dung dịch H2O2 3% và ngược lại. Khả năng lên men và oxy hoá đường glucose (Fermentation/ oxidation: O/F) Môi trường O/F (xem công thức pha chế trên nhãn). Đun và khuấy cho tan hoàn toàn. Tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút, để nguội 45oC. Thêm 1% glucose tiệt trùng. Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Cấy vi khuẩn vào hai ống nghiệm có chứa môi trường O/F. Sau đó cho phủ 0.5-1 ml dầu paraffin tiệt trùng vào 1 ống nghiệm để tạo thành điều kiện yếm khí trong ống nghiệm. Để ủ trong tủ ấm ở 28oC. Đọc kết quả sau 1-7 ngày. Lên men (F) khi ống có phủ paraffin chuyển sang màu vàng. Oxidation (O) khi ống không phủ paraffin chuyển sang màu vàng. Không đổi khi cả hai ống đều có màu xanh lá cây hoặc xanh lơ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 33 Phụ lục 3 Bảng nồng độ thuốc và dung dịch vi khuẩn cần pha STT Nồng độ cần pha (µg/ml) Thuốc kháng sinh (ml) Thể tích nước muối sinh lý (ml) Thể tích dd thuốc kháng sinh (ml) Thể tích dd vi khuẩn (ml) Nồng độ cuối cùng (µg/ml) 1 1024 25 (dd thuốc gốc 1) 0 3 3 512 2 512 25 (1024) 25 3 3 256 3 256 25 (512 µg/ml) 25 3 3 128 4 128 25 (dd thuốc gốc 2) 25 3 3 64 5 64 25 (128 µg/ml) 25 3 3 32 6 32 25 (64 µg/ml) 25 3 3 16 7 16 25 (32 µg/ml) 25 3 3 8 8 8 25 (16 µg/ml) 25 3 3 4 9 4 25 (8 µg/ml) 25 3 3 2 10 2 25 (4 µg/ml) 25 3 3 1 11 1 25 (2 µg/ml) 25 3 3 0,5 12 0,5 25 (1 µg/ml) 25 3 3 0,25 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version