Nghiên cứu thử nghiệm một số loại thảo dược có tác dụng kháng khuẩn trên một số loài vi khuẩn phân lập được từ tôm sú giống (Penaeus monodon) nuôi ở Phú Hải - Phú Vang - Thừa Thiên Huế

p nhất với 4,5 ha chiếm tỷ lệ 1,63%. Đặc biệt ở Hương Trà bệnh đốm trắng hầu như không xảy ra.[24] Trong báo cáo tình hình sản xuất nông nghiệp của Sở Nông nghiệp, tính đến ngày 27/11/2008 toàn tỉnh có 112,1 ha nuôi tôm thẻ chân trắng đạt sản lượng 1.208,9 triệu tấn với diện tích bị bệnh 4 ha chiếm 1,28% diện tích nuôi. Diện tích nuôi tôm sú lớn hơn với 3609,2 ha đạt sản lượng 2560,35 triệu tấn, trong đó diện tích bị bệnh khoảng 166,05 ha chiếm 4,62%. Qua thống kê cho thấy tỷ lệ bị bệnh của tôm sú cao hơn tôm thẻ chân trắng. Điều này chứng tỏ tôm thẻ có sức đề kháng, thích nghi với môi trường tốt hơn tôm sú. Năm 2008, tình hình thời tiết diễn biến ít bất lợi, người nuôi đã có kế hoạch phòng bệnh nên tỷ lệ bị bệnh giảm đáng kể so với năm 2007.[24] Năm 2009, tình hình dịch bệnh trên tôm sú vẫn diễn biến phức tạp, dịch bệnh đã xảy trên 4 huyện nuôi trồng thuỷ sản trọng điểm của tỉnh, cao điểm từ tháng 4 đến tháng 5 với tổng diện tích dịch bệnh là 158,6ha (trong đó bệnh đốm trắng 58,5ha; bệnh khác 100,1ha). Mặc dù dịch bệnh xảy ra trên diện rộng, nhưng do có sự can thiệp và xử lý kịp thời nên diện tích dịch bệnh giảm hơn so với năm 2008 (175,267ha). Đây là năm mà diện tích tôm bị bệnh thấp nhất trong vòng 5 năm kể từ năm 2005-2009.[23] Bảng 2.5. Tình hình dịch bệnh năm 2009 STT Huyện Tổng diện tích bị bệnh Tổng diện tích nuôi tôm Tỷ lệ % so với diện tích thả nuôi Phân ra các loại bệnh Bệnh đốm trắng Bệnh khác Diện tích Tỷ lệ (%) Diện tích Tỷ lệ (%) 1 Phú Vang 62,01 1932,73 3,21 23,38 1,21 38,63 2,00 2 Phú Lộc 34,34 886,53 3,87 18,95 2,14 15,4 1,74 3 Hương Trà 6,8 240,90 2,82 1,7 0,71 5,1 2,12 4 Quảng Điền 42,41 644,95 6,58 18,42 2,86 28,29 4,39 5 Phong Điền 8,65 130,53 6,63 0,8 0,61 7,85 6,01 Tổng 154,21 3835,64 4,02 63,25 1,65 95,27 2,48 2.4.2. Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn 2.4.2.1. Trên thế giới Cuối thế kỉ XIX, một số tác giả đã xuất bản cuốn sách: “Hướng dẫn dịch bệnh cá” nhưng cơ bản vẫn là mô tả những triệu chứng lâm sàng. Sang đầu thế kỷ XX, các nhà khoa học trên thế giới đã bắt đầu nghiên cứu và viết sách hướng dẫn các bệnh cá. Năm 1904, Bruno Hofer người Đức viết cuốn sách “Tác nhân gây bệnh ở cá” (Father of Fish Pathology). Năm 1929, Viện sĩ V.A.Dogiel thuộc viện Hàn lâm khoa học Liên Xô cũ là người có công lớn đóng góp vào công trình nghiên cứu ký sinh trùng cho cá, năm 1939 ông viết tiếp cuốn sách “Bệnh vi khuẩn của cá” (Bacterial Diseases Of Fish). Từ đó công tác nghiên cứu bệnh thủy sản ngày càng phát triển. Đến đầu những năm 80 của thế kỷ XX, khi nghề nuôi trồng thuỷ sản phát triển mạnh, đặc biệt là nghề nuôi tôm ở các nước Châu Á-Thái Bình Dương từ đó dịch bệnh tôm xảy ra gắn liền với nghề nuôi tôm. Đến nay người ta đã phát hiện rất nhiều loài là tác nhân gây bệnh cho động vật thuỷ sản như: bệnh virus cá đã phân lập được 60 loài virus, bệnh virus ở nhuyễn thể có 12 loài thuộc 8 họ, bệnh virus ở giáp xác có 14 loài ở tôm và 3 loài ở cua thuộc 5 họ, trong đó gặp nhiều nhất là 7 bệnh Baculovirus. Người ta cũng đã phân lập được hàng trăm loài vi khuẩn thuộc 9 họ, trong đó có một số nhóm vi khuẩn điển hình: Aeromonas spp, Pseudomonas spp, Vibrio spp,... Đến năm 1996 đã có trên 30 loại bệnh khác nhau trên tôm được nghiên cứu. Sakata, (1990), Kusuda và cộng sự (1986) ... đã nghiên cứu nghiên cứu một số tác nhân gây bệnh trên tôm và đưa ra kết quả có một số loài vi khuẩn thuộc họ Vibrionaceae là tác nhân gây bệnh trên tôm he và cá biển, các loài vi khuẩn này tồn tại phổ biến trong nước biển. 2.4.2.2. Tại Việt Nam Ở Việt Nam bệnh thuỷ sản được nghiên cứu chậm hơn so với các nước trên thế giới. Việc nghiên cứu bệnh thuỷ sản ở nước ta bắt đầu từ những năm của thập niên 60 và ngày càng được chú trọng. Hàng loạt các công trình khoa học được công bố. Năm 1967, ở nước ta đã phát hiện 120 loài ký sinh trùng gây bệnh, trong đó có 42 loài mang tên Hà Ký (Hà Ký, 1967). Từ năm 1980 trở lại đây nhiều công trình nghiên cứu vi khuẩn, virus được công bố góp phần thúc đẩy nghề nuôi cá ngày càng ổn định và phát triển.[10], [13] Lúc này nghề nuôi tôm đã bắt đầu được chú trọng tại Việt Nam, đi cùng với sự phát triển của nghề nuôi thì dịch bệnh cũng phát sinh làm giảm năng suất của người nuôi. Năm 1985, các nhà khoa học, các chuyên gia về thuỷ sản bắt đầu nghiên cứu và đi sâu vào lĩnh vực bệnh tôm, tuy còn non trẻ, nhưng do nhu cầu của thực tiễn, nên chỉ trong một thời gian ngắn hàng loạt công trình nghiên cứu bệnh tôm đã được công bố và áp dụng rộng rãi vào thực tiễn sản xuất, đem lại hiệu quả cao cho nghề nuôi.[29], [30] Năm 1991, khi nghiên cứu một số bệnh phổ biến trên tôm sú nuôi tại Khánh Hòa, Nguyễn Trọng Nho và cộng sự đã thông báo một số dấu hiệu bệnh lý thường gặp khi tôm bị bệnh do vi khuẩn gây ra. Tuy nhiên tác giả vẫn chưa đi sâu vào nghiên cứu về tác nhân gây bệnh và chưa đề ra được các biện pháp phòng trị, nghiên cứu chỉ mới đưa ra những thông tin cho việc phát hiện bệnh. Năm 1994, Đỗ Thị Hoà và cộng tác viên, công bố đề tài “Nghiên cứu một số bệnh do tác nhân vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật và giun tròn”, nhóm tác giả đã thông báo 8 loại bệnh khác nhau do các tác nhân là vi sinh vật gây bệnh cho tôm sú: virus, vi khuẩn, ... Ngoài ra, tác giả còn thông báo một số bệnh do các tác nhân vô cơ gây ra như: bệnh dị hình, bệnh cong thân, bệnh tôm chết do nhiệt độ cao. Tác giả đặc biệt nhấn mạnh nhóm vi khuẩn Vibrio là nhóm vi khuẩn gây ra một số bệnh có tác hại lớn cho tôm như: phát sáng, đỏ dọc thân, mềm vỏ, đen mang...[7], [14] Năm 1997, khi dịch bệnh tôm gây chết hàng loạt ở đồng bằng sông Cửu Long, Nguyễn Việt Thắng và cộng tác viên đã nghiên cứu đề tài “Tìm hiểu nguyên nhân tôm chết ở đồng bằng sông Cửu Long”. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Việt Thắng (1997) cho thấy vi khuẩn hiển diện khá cao trên tổng số mẫu thu xét nghiệm, nhiều loại Vibrio xuất hiện với tần số lớn, 2/3 xã điều tra cho thấy hiện tượng nhiễm khuẩn (Pycnozec nhân), chiếm tỷ lệ 80-100%. Bên cạnh tác nhân virus, vi khuẩn cũng là một tác nhân khá nguy hại khác cho tôm nuôi nếu đàn tôm bị nhiễm khuẩn với cường độ cao và số lượng lớn.[15], [16] Năm 1996, Đỗ Thị Hoà cùng cộng tác viên đi sâu vào nghiên cứu các tác nhân gây bệnh trên tôm sú ở khu vực Nam Trung Bộ đã phát hiện: virus, vi khuẩn, protozoa cảm nhiễm trên tôm, kết quả này đã mở ra nhiều triển vọng cho nghề nuôi tôm tại Việt Nam.[13] Gần đây công trình nghiên cứu lớn là đề tài cấp nhà nước mang mã số: KN-04-12 do Hà Ký đã nghiên cứu được 13 loại bệnh vi khuẩn tôm. Ông đã công bố đầy đủ các khâu từ phân lập vi khuẩn, tác nhân gây bệnh, dấu hiệu bệnh lý, phân bố và lan truyền, biện pháp phòng trị với một số bệnh được đi sâu nghiên cứu như: bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm sú, bệnh đỏ dọc thân ở ấu trùng tôm sú, bệnh hoại tử đốm nâu ở tôm càng xanh, bệnh hoại tử do vi khuẩn gây ra trên cá trê, bệnh xuất huyết ở cá trắm cỏ nuôi lồng.[6] 2.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng các loại thảo dược trong phòng trị bệnh trên động vật thủy sản Những hợp chất hóa học, dược học luôn tồn tại những hạn chế hay nói cách khác chúng có thể gây nên tác dụng phụ đối với sức khỏe người nuôi cũng như người tiêu dùng các sản phẩm thủy sản. Vì thế, xu hướng tìm về những “sản phẩm xanh”, những sản phẩm an toàn có nguồn gốc từ thảo dược đang được sử dụng rộng rãi đặc biệt tại các quốc gia có nền công nghệ kỹ thuật phát triển. Theo định nghĩa của cơ quan Y Tế Thế Giới, một sản phẩm được coi là dược thảo khi “thành phần chủ yếu gồm một bộ phận của thảo mộc nằm trên không hay dưới đất, trong hình dạng nguyên thủy hay được chế biến”.[12], [16], [29], [30], [32], [33] Hiện nay việc chữa bệnh cho tôm, cá bằng thảo dược đang trở thành xu hướng của giới nuôi trồng thuỷ sản, khắc phục tình trạng lệ thuộc vào dùng hóa chất, kháng sinh phòng trị bệnh cho cá nuôi, tiến tới phát triển nuôi theo hướng tạo sản phẩm bảo đảm an toàn thực phẩm, tiết kiệm kinh tế, dễ thực hiện, bảo vệ môi trường đồng thời nâng cao sản lượng xuất khẩu theo đúng tiêu chuẩn.[9], [12], [16], [29], [30] 2.5.1. Tình hình nghiên cứu thảo dược trong phòng trị bệnh ở động vật thủy sản trên thế giới Theo tài liệu thu thập được cho biết thảo dược được sử dụng sớm nhất ở Ai Cập từ năm 2000 trước Thiên Chúa, tại Trung Hoa, thảo dược được ghi nhận từ năm 168 trước Thiên Chúa, rồi nó du nhập vào Nhật Bản năm 411 sau Thiên Chúa khiến cho nền y học thảo dược hiện nay rất phổ thông, phát triển, đồng thời đang được hệ thống hóa. Hai quốc gia La Mã - Hi Lạp đã dùng thảo dược từ thời Aristole, sách thảo dược của Dioscorides viết vào thế kỷ thứ nhất sau Thiên Chúa đã thống kê trên 600 vị thuốc cỏ cây. Tiếp đó nền y học Ayurvedic Ấn Độ cũng dùng thảo dược từ trên năm ngàn năm để hỗ trợ việc phòng trị bệnh.[21] Tại các nước châu Âu: Anh, Pháp, đặc biệt Ðức là quốc gia tiến bộ nhất có nhiều công trình nghiên cứu khoa học về thảo dược. Tại Đức, một ủy ban gồm nhiều bác sĩ, dược sĩ, chuyên gia về chất độc đã hoàn thành một tài liệu với trên 400 chuyên đề mô tả công dụng, tác dụng phụ, phân lượng của nhiều loại thảo dược khác nhau.[29], [30], [31], [32] Tại Mỹ, thảo dược rất thông dụng với thổ dân bản xứ. Cơ quan The American Botanical Council, Austin-Texas, dựa vào hai công trình của Đức và Anh, đã soạn thảo một tài liệu nói về 26 thảo dược thông dụng. Những năm gần đây, Viện Sức Khỏe Hoa Kỳ đã thành lập một trung tâm nghiên cứu về thảo dược.[29], [30], [31], [32] . Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng diệt vi khuẩn của tỏi. Năm 1944, nhà hóa học Chester J. Cavallito đã phân tích được hợp chất Allicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh. Kháng sinh này mạnh bằng 1/5 thuốc Penicillin và 1/10 thuốc Tetraclline, có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn, xua đuổi hoặc tiêu diệt nhiều sâu bọ, ký sinh trùng, nấm độc. Một nghiên cứu khác tại Brazil năm 1982 đã chứng minh nước tinh chất của tỏi có thể chữa được nhiều bệnh nhiễm độc bao tử, do thức ăn có lẫn vi khuẩn, nhất là loại Salmonella. Các nghiên cứu tại Đại học California ở Davis cũng đưa đến kết luật tương tự. Ngoài ra, tỏi cũng được dùng rất công hiệu để trị bệnh sán lãi, giun kim, các bệnh nấm ngoài da.[17], [29] Vào năm 1867, Binz đã chứng minh được quinin rất độc với Paramecium. Quinin ở nồng độ 1/20.000 làm suy yếu hoạt lực của Paramecium sau 2 phút, làm bất hoạt sau 2 giờ. Từ đó Binz đưa ra vấn đề về khả năng dùng qinin để điều trị các bệnh do Paramecium gây ra.[17] Năm 1887, R.Koch đã nghiên cứu chứng minh tính kháng khuẩn của nhiều loại tinh dầu. Cũng trong thời gian này, Chamberland đã chứng minh rằng nhiều loại tinh dầu có tính kháng khuẩn, các thí nghiệm này được nhiều người như Cadeae, Mennic, Bering, Reilling,... tiếp tục nghiên cứu.[29], [30], [32] Năm 1817 Pelletier, Magendie tách ra được một loại alkaloid có tên emetin. Rogers, 1912 nhận thấy dung dịch muối chlohydrat emetin 1/10.000 diệt được amip, từ đó emetin được dùng rộng rãi trong điều trị lỵ cấp tính ở ruột, áp-xe gan do amip. Nhiều loài cây Holarrhena đã được người dân ấn Độ dùng để chữa sốt rét, lao, chữa lỵ Amip và Trichomonas, trong số 20 alkaloid chiết suất từ hạt và vỏ cây nhận thấy chất conessin có tác dụng mạnh với amip, đã được ứng dụng điều trị lỵ amip có kết quả. Holarrhena antidysenterica đã được Viện Dược Liệu tách chiết được một chế phẩm gọi là “Holanin” thành phần chủ yếu chứa conessin và các alkaloid khác, có tác dụng điều trị lỵ amip thể cấp, được xác nhận qua nhiều công trình nghiên cứu lâm sàng.[29], [30] Năm 1928 B.P. Tokin đã chứng minh nhiều chất bay hơi từ cây xanh có tác dụng với vi khuẩn được gọi là Phytoncid. Gries (1943), Largralge (1956) chiết xuất từ cây Hồ đào (Juglals ligra-Juglandaceae) được chất Juglon, đây là một dẫn chất Natoquinon, chất này có tác dụng với nhiều loại nấm và vi khuẩn có nha bào. Năm 1959 Horak, Santavi chiết xuất từ Cannabit sativa thuộc họ Cannabinnaceae, được chất Cannabiriolic, dung dịch 10-15 ug/ml có tác dụng với vi khuẩn lao ở người và một số vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là vi khuẩn kháng lại Penicilin.[17], [30] Tại Liên Xô (cũ) thường dùng “imalin” tách chiết từ cây Hypericum persoratum họ Hyperaceae. Dung dịch imalin 1/1.000.000 đã có thể diệt được tụ cầu vàng, vi khuẩn vàng, vi khuẩn bạch cầu, vi khuẩn hoại thư sinh hơi. Chế phẩm giữ được lâu không hỏng, dùng để chữa viêm họng, dạng mỡ chữa bỏng, mụn nhọt.[29] Năm 1997 tại Thái Lan, Sataporn Direkbusarakom và cộng sự đã thử nghiệm thành công khả năng kháng khuẩn của các loài thảo dược như: O.sanctum, C.alata, Tinospora cordifolia, Eclipa alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava, Clinacanthus nutans, Andrographic panniculata, Momordica charatina, Phyllanthus reticulates, P. pulcher, P. acidus, P. debelis, P. amarus, P. debelis và P. urinaria đối với vi khuẩn Vibrio spp. Tuy nhiên, chỉ có hai cây P.guajava và M.charantina có hiệu quả ức chế đối với Vibrio spp. Nồng độ ức chế tối thiểu của P. guajava ở 0,625mg/ml, 1,25mg/ml đối với M. charantina.[17], [29], [30] 2.5.2. Tình hình nghiên cứu thảo dược trong phòng trị bệnh ở động vật thủy sản tại Việt Nam Từ lâu người dân ở nhiều địa phương đã sử dụng nhiều loại cây cỏ để trị các bệnh viêm nhiễm đường ruột, đường hô hấp, tiết niệu, trị mụn nhọt, rửa vết thương,... Nhiều vị thuốc có tính kháng khuẩn được kết hợp với nhau để thành một đơn thuốc như kết hợp hạt củ cải, hạt tía tô, hạt cải bẹ để trị bệnh nhiễm khuẩn ở phổi hoặc kết hợp các vị hoàng liên, hoàng lá, đại hoàng, gọi là “tam hoàng”, sắc nước rửa vết thương nhiễm khuẩn. Từ thế kỷ XIV Đại y thiền sư Tuệ Tĩnh đã sử dụng nhiều thảo mộc như: tỏi, hẹ, tô mộc, hạt cải, trầu không,... trị một số bệnh viêm nhiễm, giữa thế kỷ XX trở lại đây những nghiên cứu thực nghiệm xác định tính kháng khuẩn thực vật mới được quan tâm. Vào năm 1956, Phạm Văn Ngữ đã tiến hành nghiên cứu trên 500 cây thuốc có tác dụng kháng khuẩn mạnh. Năm 1959, Nguyễn Văn Hưởng cùng với cộng sự đưa ra chế phẩm Tô Mộc trị tiêu chảy sau khi nghiên cứu trên 1000 cây thuốc về tính kháng khuẩn.[2], [3], [4], [8] Theo nhiều người, ý tưởng dùng thảo dược trị bệnh trên động vật thủy sản bắt nguồn từ những bài thuốc dân gian có tác dụng trên gia súc vật nuôi, sau đó cải biến cho phù hợp với môi trường thuỷ sản.[10], [14], [21] Ở một số tỉnh và địa phương người dân đã sử dụng thảo dược để phòng trị bệnh trên cá tôm nuôi. Ở các làng cá bè ở vùng đồng bằng sông Cửu Long thời gian gần đây nở rộ phong trào dùng cây, lá thuốc nam trộn với thức ăn để phòng và trị bệnh trên cá nuôi bè.[29], [30], [31], [32], [33] Phòng trị bệnh cá bằng cây thuốc nam là do người nuôi ở đây tự nghiên cứu, thực hiện rồi truyền miệng nhau.[29], [30] Các loại cây như lá trầu, cỏ mực, cỏ ri trị bệnh kí sinh trùng cho cá rất tốt. Huyện Anh Sơn (Nghệ An), đã có những kinh nghiệm hay của nhiều gia đình trong việc sử dụng các loại thảo mộc làm thuốc chữa một số bệnh thường gặp trên tôm, cá thay cho việc dùng thuốc kháng sinh rất có hiệu quả: cây thuốc cá, lấy quả thàn mát già và bã khô dầu cây sở để diệt hết các loại cá tạp, diệt khuẩn trong ao, dùng lá xoan diệt trùng mỏ neo và trùng bánh xe, lá thầu dầu tía có chất đắng để chữa bệnh loét mang, đốm đỏ cho cá rất hiệu quả... Tại Tân Châu - Châu Đốc (An Giang), Hồng Ngự (Đồng Tháp)... người dân tại khu vực nuôi bè đã biết dùng cây cỏ mực, cây trầu để trị bệnh kí sinh trùng cho cá, lá ổi chữa bệnh cho cá...[14], [21], [29], [30], [33] Năm 1995, Hà Ký cùng cộng sự đã nghiên cứu một số loài thảo dược dùng để phòng trị bệnh trên cá trắm ở Miền Bắc. Bước đầu chọn được 9 loài cây thuốc: rau nghể (Polygonum hydropiper), rau sam (Portulaca cleracea), cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta), cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolis), sài đất (Wedelia calendu lacae), nhọ nồi (Eclipta alba), bồ công anh (Lactuca indica), cây vòi voi (Heliotropium indicum) và cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria) có thể sử dụng trong phòng trị bệnh đốm đỏ ở cá trắm cỏ.[6] Năm 2000, Nguyễn Ngọc Hạnh cùng cộng sự tiến hành nghiên cứu thử nghiệm thành công các hợp chất chiết xuất từ thảo dược, như Hepato, Alixin với tác dụng hỗ trợ tiêu hoá tốt, giúp tôm khoẻ mạnh, sinh trưởng bình thường, chống nhiễm bệnh đặc biệt các bệnh về gan. Ngoài ra, Hepato có thể sử dụng phòng bệnh cho cá.[14] Năm 2002, Phan Xuân Thanh và cộng tác viên đã xác định được chất: 2-hydroxy-6-pentandecatrienilbenzoat có nguồn gốc từ thảo dược, có tác dụng phòng trừ các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra. Nhằm mục đích sử dụng các hoạt chất sinh học thay thế các kháng sinh, hoá chất độc trong lĩnh vực nuôi trồng thuỷ sản.[18] Năm 2003, Ts.Bùi Quang Tề, Ks.Lê Xuân Thành và CTV đã nghiên cứu thành công 2 loại chế phẩm thảo dược VTS1-C, VTS1-T phối chế từ các hoạt chất chiết tách từ tỏi (Allium sativum), sài đất (Weledia calendulacea) sử dụng phòng bệnh cho tôm cá, kết quả cho thấy tỏi, sài đất đều có tác dụng với cả 6 loài vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, V.harveyi, V.alginolyticus, Aeromonas hydrophyla, Edwardsiella tarda và Hafnia alvei gây bệnh ở nước ngọt, nước lợ mặn.[15], [29], [30] Năm 2004, nhóm nghiên cứu thuộc Viện Sinh học Nhiệt Ðới (Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc Gia) đã thực hiện thành công đề tài chế tạo sản phẩm sinh học từ cây thuốc cá để xử lý môi trường ao nuôi tôm, ứng dụng hiệu quả qua các tỉnh Bạc Liêu, Sóc Trăng, Cà Mau.[16], [29] Năm 2007, chế phẩm sinh học bokashi được chiết xuất từ lá trầu của Nguyễn Ngọc Phước được xem như một trong những hướng nghiên cứu đột phá trong phòng và trị bệnh cho thủy sản, dùng để điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra trên động vật thủy sản mà không sử dụng kháng sinh và thân thiện với môi trường.[11], [12], [29] Về vấn đề chế tạo những sản phẩm thuốc nam ở dạng sản phẩm công nghiệp đã được các nhà nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản cũng đã có sự quan tâm bước đầu. Nhóm nghiên cứu thuộc Viện Sinh học Nhiệt Ðới (Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc Gia) đã thực hiện thành công đề tài chế tạo sản phẩm sinh học từ cây thuốc cá để xử lý môi trường ao nuôi tôm, ứng dụng hiệu quả qua các tỉnh Bạc Liêu, Sóc Trăng, Cà Mau.[16], [29] 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 3.1.1.1 Tôm sú (Penaeus monodon) Hệ thống phân loại: Phân loại theo hệ thống phân loại của Holthuis, LB 1980. Ngành: Anthropoda Lớp giáp xác: Crustacea Bộ mười chân: Decapoda Bộ phụ bơi lội: Natantia Phân bộ tôm he: Penaeidea Tổng bộ tôm he: Penaeoidea Họ tôm he: Penaeidae Giống tôm he: Penaeus Loài tôm sú: Penaeus monodon Tên tiếng Anh: Giant Tiger Shrimp Black Tiger Shrimp 3.1.1.2. Một số loại vi khuẩn thường gặp ở tôm sú giống - Vi khuẩn Vibrio spp thuộc họ Vibrionaceae 3.1.1.3. Một số loại thảo dược - Tỏi (Allium sativum L) - Chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) - Rau diếp cá (Houttuynia cordata Thumb) 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu - Địa điểm thu mẫu: Mẫu tôm được thu tại trại tôm giống (thuộc Trung Tâm Giống Thủy Sản Tỉnh Thừa Thiên Huế) ở xã Phú Hải, huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế. - Địa điểm phân tích, nuôi cấy, phân lập, lưu giữ giống vi khuẩn và tiến hành thí nghiệm: + Phòng thí nghiệm Khoa Thủy sản - Trường Đại học Nông Lâm Huế. + Khoa vi sinh - Bệnh viện Trung Ương Huế. 3.1.3. Thời gian nghiên cứu Thời gian: từ tháng12/01/2010 đến tháng 15/05/2010. 3.2. Nội dung nghiên cứu - Phân lập, định danh một số loài vi khuẩn trên tôm sú giống (Penaeus monodon). - Thử nghiệm tác dụng diệt khuẩn của dịch chiết từ các loại thảo dược với các chủng vi khuẩn phân lập được. 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Vật liệu nghiên cứu 3.3.1.1. Dụng cụ thí nghiệm - Dụng cụ thu mẫu: Chai lọ, găng, bình sục khí... - Dụng cụ bố trí thí nghiệm: các đĩa peptri thạch. - Dụng cụ thí nghiệm, giải phẫu: Đèn cồn, que cấy, bông thấm, găng tay... - Dụng cụ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn: Các loại ống nghiệm vô trùng, đĩa peptri, que cấy vô trùng, đèn cồn, lamen, lam, pipet, kẹp gắp, kính hiển vi có độ phóng đại 100x, dầu soi kính, tủ lạnh, nước muối sinh lý 9%0, nước cất vô trùng. - Dụng cụ chiết xuất dịch chiết thảo dược: Máy xay, chai lọ, tủ ấm, nước cất, cồn 900, lưới lọc, giấy lọc... 3.3.1.2. Môi trường và hóa chất - Môi trường: + Môi trường phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm: TCBS (Thiosunfat Citrat Bilesalt Agar). + Môi trường nuôi cấy tăng sinh: Pepton. + Môi trường thử khả năng kháng khuẩn của thảo dược: NA (Nutrient agar) có bổ sung thêm 2%NaCl. + Các môi trường dùng cho phản ứng sinh hóa: Glucose, Lactose, Saccharose, đường Mantose, môi trường Simon Citrat Agar, môi trường KIA, môi trường MR, môi trường dùng cho phản ứng sinh Indol, Dul, môi trường Mobile để thử khả năng di động... - Hóa chất sử dụng trong test sinh hóa và nhuộm Gram: + Thuốc thử Methylred dùng cho phản ứng MR. + Thuốc thử Kovac’s dùng cho phản ứng sinh Indol. + Thuốc thử NaOH 20% và α-Napton dùng cho phản ứng MR-VP. + Dung dịch chỉ thị màu dùng để nhuộm Gram: Dung dịch Cristal Violet (màu tím), dung dịch Fushin, dung dịch Lugol, dung dịch cồn 96% để khử màu. 3.3.2. Phương pháp nghiên cứu SƠ ĐỒ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU Nhuộm Gram Nuôi cấy trong môi trường TCBS Chọn khuẩn lạc ưu thế Nuôi cấy thuần trên môi trường TCBS Thử test sinh hóa Định danh vi khuẩn Nuôi cấy tăng sinh trong môi trường pepton lỏng Xác đinh nồng độ (106) Thử nghiệm dịch chiết các loại thảo dược ở các nồng độ khác nhau Mẫu tôm giống Đo chiều dài, cân trọng lượng Mẫu bệnh phẩm(tôm) Quan sát dấu hiệu bệnh lý Đo chiều dài, trọng lượng Lấy nội tạng, máu Nuôi cấy trong môi trường TCBS Chọn khuẩn lạc ưu thế Nuôi cấy thuần trên môi trường TCBS Nhuộm Gram Thử test sinh hóa Định danh vi khuẩn Nuôi cấy tăng sinh trong môi trường pepton lỏng Xác đinh nồng độ (106) Thử nghiệm dịch chiết các loại thảo dược ở nồng độ khác nhau Mẫu bệnh phẩm(tôm) Quan sát dấu hiệu bệnh lý Đo chiều dài, trọng lượng Lấy nội tạng, máu Nuôi cấy trong môi trường TCBS Chọn khuẩn lạc ưu thế Nuôi cấy thuần trên môi trường TCBS Nhuộm Gram Thử test sinh hóa Định danh vi khuẩn Nuôi cấy tăng sinh trong môi trường pepton lỏng Xác đinh nồng độ (106) Thử nghiệm dịch chiết các loại thảo dược ở nồng độ khác nhau 3.3.2.1. Phương pháp thu mẫu - Phương pháp thu mẫu tôm: áp dụng phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên. - Mẫu bệnh phẩm đem nuôi cấy, phân lập được lấy bằng cách nghiền nát toàn bộ mẫu tôm với nước cất vô trùng thành dung dịch huyền phù rồi lấy đem nuôi cấy trên môi trường đặc trưng TCBS. 3.3.2.2. Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Phương pháp phân lập xác định tên loài vi khuẩn gây bệnh dựa trên phương pháp nghiên cứu của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006). - Nuôi cấy phân lập: Lấy mẫu bệnh phẩm (bao gồm cả khối gan tụy, đường ruột, cơ) cấy lên các đĩa chứa môi trường và giữ các đĩa cấy ở nhiệt độ phòng. Sau 24h, quan sát, ghi nhận những tính chất đặc trưng: hình dạng khuẩn lạc, kích thước, màu sắc, đặc tính lý học và hoá học của khuẩn lạc. Sau đó tiến hành chọn khuẩn lạc ưu thế cấy chuyền làm thuần sang môi trường TCBS. - Nhuộm Gram và test sinh hóa Lấy vi khuẩn dòng thuần từ môi trường thạch TCBS để nhuộm Gram theo phương pháp của Christian Gram (1884). Lấy vi khuẩn dòng thuần từ môi trường thạch TCBS để test sinh hóa, định danh vi khuẩn theo khóa phân lập của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006). - Nuôi cấy tăng sinh Cấy tăng sinh trên môi trường pepton lỏng ở nhiệt độ 300C để đạt mật độ cần thiết (106 CFU/ml) giúp cho quá trình giữ giống và bố trí thí nghiệm. - Xác định mật độ tế bào vi khuẩn Chuẩn bị một số ống nghiệm vô trùng, mỗi ống chứa 9ml nước muối sinh lý. Lấy 1ml mẫu dung dịch pepton chứa vi khuẩn cần nghiên cứu, đưa sang ống nghiêm thứ nhất làm đồng đều ta được độ pha loãng 10 (10-1). Lấy 1ml nước ở ống nghiệm 10-1 cho vào ống nghiệm thứ 2 được độ pha loãng 100 lần (10-2), cứ làm như thế đến khi đạt được độ pha loãng tiếp theo:10-3, 10-4, 10-5, 10-6. Lấy 0,1ml nước nghiên cứu ở 2-3 độ pha loãng khác nhau, nuôi cấy trên đĩa thạch chứa môi trường cần thiết bằng que gạt. Mỗi nồng độ pha loãng nuôi cấy từ 2-3 đĩa lồng. Nuôi cấy ở nhiệt độ 30 - 370C, sau 24 giờ, đem ra đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, lấy giá trị trung bình của các đĩa lồng có cùng nồng độ pha loãng. Mật độ vi khuẩn tính theo công thức: X = A.K/V. Trong đó: X: Mật độ vi khuẩn. A: Số lượng khuẩn lạc trung bình trong 1 độ pha loãng. V: Thể tích nước đưa vào nuôi cấy. K: Hệ số pha loãng. 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Dd gốc 10-1 10-2 ... . 10-(n-1) 10-n Sơ đồ xác định mật độ vi khuẩn Phương pháp so màu: Dùng máy đo độ đục của Macfaland để so màu nhằm xác định nồng độ vi khuẩn. 3.3.2.3. Phương pháp nhuộm vi khuẩn Dùng que đã diệt khuẩn để lấy mẫu (khuẩn lạc) đặt lên lam kính,dàn mỏng Nhỏ dung dịch Violet (màu tím) lên mẫu để 30-60s Rửa nhanh bằng nước, rảy khô Nhỏ dung dịch Lugol lên mẫu để 1 phút Rửa nhanh rảy khô Nghiêng lam kính, nhỏ cồn 96% lên để tẩy màu Rửa nhanh bằng nước, rảy khô Nhỏ dung dịch Fushin lên mẫu, để 1-2 phút Rửa nước, rảy khô dùng khăn giấy thấm làm khô tiêu bản Nhỏ dầu lên tiêu bản, đem soi dưới kính hiển vi (vật kính dầu) nếu mẫu giữ nguyên màu xanh tím là vi khuẩn Gram(+), nếu mẫu chuyển sang màu hồng là vi khuẩn Gram(-). 3.3.2.4. Phương pháp chiết xuất thảo dược Thảo dược thí nghiệm được rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phòng, rồi cho vào máy xay thật nhuyễn, có thể thêm một ít nước cất làm dung môi nhằm thuận tiện cho việc vắt lấy dịch chiết qua lưới lọc. Dịch chiết được bảo quản ở nơi khô thoáng với nhiệt độ luôn bảo đảm dưới 500C tránh hiện tượng tác dụng dược lý của thảo dược bị mất đi bởi nhiệt độ. 3.3.2.5. Phương pháp thử khả năng kháng khuẩn của thảo dược Tiến hành thử nghiệm dịch chiết thảo dược trên vi khuẩn phân lập được theo phương pháp thạch lỗ của Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội, 1998. Các thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng bằng tủ cấy vô trùng. Phương pháp tiến hành: Lấy 0,1ml dung dịch ở ống nghiệm chứa vi khuẩn có mật độ 106CFU/ml dàn đều trên mặt thạch bằng que gạt, để khoảng 5 phút cho bề mặt thạch khô tự nhiên. Mỗi đĩa thạch đục 5 lỗ trên mặt thạch với đường kính 3mm/lỗ (mỗi nồng độ thảo dược thử nghiệm được lặp lại 5 lần). Nhỏ vào mỗi lỗ 0,1ml dịch chiết dược liệu rồi giữ ở nhiệt độ370C trong tủ ấm. Sau 24 giờ lấy ra xác định độ dài đường kính vòng tròn kháng khuẩn. Mỗi loại thảo dược được thử nghiệm ở nồng độ gốc và các nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khả năng kháng khuẩn của mỗi loại thảo dược I1 II1 III1 I2 II2 III2 I3 II3 III3 Giải thích: I1, I2, I3:công thức thí nghiệm I, II, III: loai thảo dược thử nghiệm 1, 2, 3: số lần lặp lại 3.3.2.6. Phương pháp sàng lọc nồng độ Thí nghiệm được bố trí trên 24 giếng nhựa chứa 2 ml pepton với các nồng độ dịch chiết thảo dược pha loãng 10 lần và được lặp lại 3 lần. Khối thạch có vi khuẩn phát triển trên đó được cắt bằng dụng cụ chuyên dụng với đường kính 5,5 mm sau đó được cho vào trong các giếng, ngâm trong 24h. Các khối thạch sau khi ngâm trong các giếng được đưa vào nuôi cấy ở các đĩa thạch NA + 2% NaCl. Xem xét khả năng phát triển của khuẩn lạc sau 1 ngày, 2 ngày và 7 ngày. Nghiệm thức đối chứng âm không bổ sung dịch chiết thảo dược vào môi trương nuôi cấy. Nghiệm thức đối chứng dương bổ sung 2 ml nước cất trong môi trường pepton. 3.3.2.7. Phương pháp xác định nồng độ ức chế Từ kết quả thí nghiệm thứ nhất, nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu sẽ được thử nghiệm ở thí nghiệm thứ hai với thí nghiệm được bố trí như thí nghiệm đầu tiên nhưng nồng độ dịch chiết thảo dược sẽ được pha loãng 2 lần trong các nghiệm thức. Các nghiệm thức đối chứng không bổ sung dịch chiết thảo dược. Sau 1 ngày, 2 ngày và 7 ngày kiểm tra sự phát triển của khuẩn lạc. Nuôi cấy trong môi trường NA + 2% NaCl ở nhiệt độ 300C. 3.3.2.8. Phương pháp xác định nồng độ tiêu diệt vi khuẩn Các khối thạch có vi khuẩn phát triển trên đó được ngâm trong các môi trường có chứa các nồng độ dịch chiết thảo dược khác nhau trong 15 phút, 30 phút, 1 giờ và 24 giờ. Sau đó được rửa sạch 3 lần với nước cất và nuôi cấy trong môi trường NA + 2% NaCl. Xác định khả năng tiêu diệt vi khẩn của dịch chiết thảo dược bằng cách so sánh sự phát triển của khuẩn lạc trong môi trường thạch ở các nghiệm thức có bổ sung dịch chiết thảo dược với các nghiệm thức đối chứng là các khối thạch được ngâm trong nước cất. Nếu khuẩn lạc không phát triển thì tiếp tục theo dõi đến ngày thứ 3. 3.4. Phương pháp xử lý số liệu 3.4.1. Giá trị trung bình = Trong đó: : Giá trị trung bình Xi : Giá trị của mỗi lần đo n : Số lần đo 3.4.2. Độ lệch chuẩn Trong đó: : Giá trị trung bình : Độ lệch chuẩn n: Số lần đếm Xi: Giá trị trung bình 3.4.3. Công thức tính mật độ vi khuẩn X = Trong đó: X: mật độ vi khuẩn A: Số lượng khuẩn lạc trung bình trong 1 độ pha loãng V: Thể nước đưa vào nuôi cấy K: Hệ số pha loãng 3.4.4. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh vật học trên phần mềm Excel. 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đặc điểm chung của mẫu tôm Mẫu được chọn là tôm sú giống (từ Post15 đến Post33). Mẫu được thu theo phương pháp ngẫu nhiên, mỗi đợt thu khoảng 30 mẫu. Quan sát thấy mẫu có kích cỡ đồng đều (1 - 2 cm), hoạt động nhanh nhạy, không có hiện tượng phân đàn... 4.2. Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn Kết quả phân lập vi khuẩn từ những mẫu tôm được thể hiện ở bảng 4.1 sau: Bảng 4.1. Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn trên tôm sú giống Đặc điểm sinh hoá Kết quả Chủng 1 Chủng 2 Hình dạng khuẩn lạc Tròn to, không đều Tròn nhỏ, đều Màu sắc khuẩn lạc Xanh Vàng Kích thước khuẩn lạc (mm) 3,2 - 3,9 1,4 - 1,8 Hình dạng tế bào Hình que Hình que Đặc điểm khuyếch tán Không làm biến đổimôi trường nuôi cấy Làm biến đổi màu của môi trường nuôi cấy Kết quả nhuộm Gram - - Acid hoá Glucose + + Acid hoá Lactose + + Acid hoá Sacarose - + Phản ứng Methylred + - Phản ứng KIA +/+ +/+ Phản ứng Citrat - - Sinh hơi từ Glucose + - α – Naptol - - Indol + + Phản ứng MR – VP - - Khả năng di động Không di động Không di động Khả năng sinh H2S - - Kết luận V. harveyi V. alginolyticus Kết quả phân lập được 2 chủng vi khuẩn Vibrio harveyi, và Vibrio alginolyticus từ các mẫu tôm thu được. Đây là 2 loài vi khuẩn Gram (-) (Hình 4.1 và 4.2), tế bào có dạng hình que ngắn, không có khả năng di động, phát triển trên môi rường thạch chọn lọc TCBS, cho khuẩn lạc màu rõ rệt: màu xanh của V.harveyi (Hình 4.3), và màu vàng của V.alginolyticus (Hình 4.4). Hình 4.1. Vibrio harveyi Hình 4.2: Vibrio alginolyticus tôm nước mặn, lợ như tôm sú Theo Bùi Quang Tề (2002) các loài vi khuẩn Vibrio là những loài gây ra bệnh chủ yếu trên tôm như: bệnh đỏ dọc thân, bệnh ăn mòn vỏ giáp xác, bệnh mềm vỏ... Những vi khuẩn này thường là những tác nhân cơ hội, khi tôm sốc do môi trường biến đổi, hoặc bị nhiễm các bệnh khác như virus, nấm, kí sinh trùng. Khi sức đề kháng của động vật thuỷ sản giảm, các loài vi khuẩn Vibrio có khả năng gây bệnh nặng và gây chết hàng loạt. Vibrio harveyi thường phân bố trong nước biển, ven bờ... gây bệnh cho giáp xác, đặc biệtlà . Hình 4.3. Khuẩn lạc của V. harveyi trên môi trường TCBS Hình 4.4. Khuẩn lạc của V. alginolyticus trên môi trường TCBS Theo Đỗ Thị Hòa (2004), có sự khác nhau về sự khuếch tán màu sắc trên môi trường TCBS của hai chủng vi khuẩn này do khác nhau về khả năng lên men loại đường Saccarose. Vi khuẩn V.alginolyticus có khả năng lên men đường Saccarose và làm thay đổi màu sắc của môi trường từ màu xanh sang màu vàng (Hình 4.4). Trong khi đó, vi khuẩn V. harveyi không có khả năng lên men loại đường này nên không làm thay đổi màu sắc của môi trường (Hình 4.3). 4.3. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại dịch chiết thảo dược Thí nghiệm thử khả năng kháng khuẩn của các công thức dịch chiết thảo dược khác nhau được tiến hành trên cả hai chủng vi khuẩn V.alginolyticus và V.harveyi. Các thí nghiệm được tiến hành đối với vi khuẩn nuôi cấy ở mật độ 106 CFU/ml. Thảo dược thử nghiệm ở 4 nồng độ: 106, 105, 104, 103. Qua kết quả thử nghiệm thảo dược ở nồng độ 104, 105, 106, tất cả các thảo dược đều có tác dụng kháng khuẩn (có vòng kháng khuẩn rõ ràng). Riêng ở nồng độ 103, diếp cá không có tác dụng kháng khuẩn (vi khuẩn mọc tràn đĩa). 4.3.1. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Kết quả thử nghiệm tác dụng của tỏi lên sự phát triển V.alginolyticus, V.harveyi được thể hiện ở đồ thị 4.1 và đồ thị 4.2. c a Đồ thị 4.1. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với V.alginolyticus (a, b, c, d: thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) d b d c b a Đồ thị 4.2. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với V.harveyi (a, b, c, d: thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) Đối với vi khuẩn V.alginolyticus, kết quả từ đồ thị 4.1 cho thấy tỏi ở 4 nồng độ: 106, 105, 104, 103 đều có khả năng kháng khuẩn. Tỏi ở nồng độ 106 khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 26.0 ± 0.44 mm, tỏi ở nồng độ 103 kháng khuẩn kém nhất với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 16.8 ± 1.25 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p = 0.035, 0.043, 0.042 < 0.05). Hình 4.5. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử nghiệm trên V.alginolyticus Hình 4.6. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử nghiệm trên V.harveyi Đối với vi khuẩn Vibrio harveyi, đồ thị 4.2 chỉ rõ, tỏi nguyên chất và tỏi pha loãng 105, 104, 103 đều có khả năng kháng khuẩn. Tỏi ở các nồng độ khác nhau cho khả năng kháng khuẩn khác nhau. Tỏi nguyên chất có khả năng kháng khuẩn tốt nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 23.7 ± 1.18 mm, tỏi 105, 104 kháng khuẩn kém hơn với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn tương ứng là 19.9 ± 1.26 mm, 15 ± 0.7 mm, thấp nhất ở tỏi nồng độ 103 với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 11.17 ± 1.27 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (p = 0.02, 0.004, 0.01). Mức độ kháng khuẩn của thảo dược được quyết định bởi thành phần, tính chất của các hợp chất được chiết xuất. Theo Đỗ Tất Lợi, 2004, trong tỏi có một ít iốt và tinh dầu. Thành phần kháng khuẩn chủ yếu của tỏi là chất lixin (C6H10OS2), alixin là một hợp chất có tác dụng diệt khuẩn mạnh, phổ diệt khuẩn rộng với nhiều loại vi khuẩn. Ở động vật thủy sản, alixin có tác dụng rất tốt với các vi khuẩn gây bệnh gram (-). Trong tỏi tươi không có chất alixin, nó chỉ hình thành khi củ tỏi được phơi khô. Trong tỏi tươi, chứa chất aliin - đây là một acide amin, dưới tác dụng của men alinaza có trong tỏi để tạo nên alixin. Chất alixin tinh khiết là một chất dầu không màu, hòa tan trong cồn, benzen, ete, không ổn định trong nước, dễ thủy phân, độ thủy phân 2 - 5%. Điều này giải thích vì sao tỏi nồng độ 105, 104, 103 có tác dụng kháng khuẩn kém hơn tỏi nguyên chất. Chất alixin bị nhiệt sẽ chóng mất tác dụng, gặp kiềm cũng bị mất tác dụng. Để ở nhiệt độ mát trong phòng, sau 2 ngày, chất alixin không còn tác dụng diệt trùng, gặp môi trường kiềm cũng biến chất, nhưng trong môi trường acid yếu không bị ảnh hưởng. Chất alixin rất dễ mất oxy do đó mất tác dụng kháng sinh, vì vậy nhiều tác giả đã cho rằng tác dụng kháng sinh của alixin chủ yếu do oxy trong phân tử. Nồng độ alixin trong dung dịch từ 1/50.000 - 1/25.000 có khả năng diệt trùng do oxy nguyên tử của alixin quyết định. Alixin rất dễ kết hợp với một acid amin gốc SH là Cystein của tế bào vi khuẩn, để tạo thành hợp chất mới, làm vi khuẩn hết khả năng sinh sản, sau đó bị tiêu diệt. 4.3.2. Khả năng kháng khuẩn của chó đẻ răng cưa đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Kết quả thử nghiệm tác dụng của chó đẻ răng cưa lên sự phát triển của V.alginolyticus, V.harveyi được thể hiện ở đồ thị 4.3 và đồ thị 4.4. b a c b Đồ thị 4.3. Khả năng kháng khuẩn của chó đẻ răng cưa đối với V.alginolyticus (a, b, c: thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) d c b Đồ thị 4.4. Khả năng kháng khuẩn của chó đẻ răng cưa đối với V.harveyi (a, b, c, d:thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) a  Kết quả từ đồ thị 4.3 chỉ rõ đối với vi khuẩn V.alginolyticus, chó đẻ răng cưa ở 4 nồng độ đều có khả năng kháng khuẩn. Chó đẻ răng cưa nồng độ 106 có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 20.2 ± 0.93 mm, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p = 0.042 (p 0,05). Hay nói cách khác khả năng kháng khuẩn của chó đẻ răng cưa nồng độ 105 tương đương với chó đẻ răng cưa nồng độ 104. Nhưng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về khả năng kháng khuẩn của chó đẻ răng cưa nồng độ 105 và 104 với p = 0.007. Hình 4.7. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của chó đẻ răng cưa khi thử nghiệm trên V.alginolyticus Đối với vi khuẩn V.harveyi, qua đồ thị 4.4 cho thấy chó đẻ răng cưa ở 4 nồng độ đều có khả năng kháng khuẩn. Chó đẻ răng cưa nồng độ 106 có khả năng kháng khuẩn cao nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 19.3 ± 0.86 mm, kém nhất chó đẻ răng cưa nồng độ 10ˆ3 với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 7.3 ± 0.29 mm. Sự khác biệt giữa hai nồng độ chó đẻ răng cưa 106 và 105 có ý nghĩa thống kê (p = 0.006 < 0,05). Khả năng kháng khuẩn của chó đẻ răng cưa nồng độ 105 kém hơn chó đẻ răng cưa nồng độ 106 nhưng tốt hơn chó đẻ răng cưa nồng độ 104, 103, sự khác biệt giữa nồng độ này với hai nồng độ còn lại (104, 103) có ý nghĩa về thống kê (tương ứng p = 0.016, 0.023 < 0,05). Trong chó đẻ răng cưa có chứa các chất phyllanthin (C24H34O6), hypophyllanthin (C24H30O7), niranthin (C24H32O7), nirtetralin (C24H30O7), phylteralin (C24H34O6). Đây đều là những chất có tính kháng vi sinh vật rất cao. Trong phòng trị bệnh ở động vật thuỷ sản, đã thử tác dụng diệt khuẩn của dịch chiết rút từ cây chó đẻ răng cưa với vi khuẩn Aeromonas hydrophyla, Edwardsiella tarda gây bệnh hoại tử ở cá trê, kết quả cho vòng kháng khuẩn khá lớn 11 - 20 mm (Bộ môn bệnh cá viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, 1993). Một số nghiên cứu khác ở Việt Nam, bằng phương pháp đào rãnh cho thấy, dịch chiết rút từ cây chó đẻ răng cưa có khả năng diệt khuẩn cao với một số vi khuẩn gây bệnh ở tôm và cá như: Vibrio parahaemolyticus, V.alginolyticus và Aeromonas hydrophyla, đường kính vòng kháng khuẩn 18 - 20 mm khi chiết rút với dung môi là cồn (Đỗ Thị Hòa và ctv, 1998). Năm 1992, Sataporn Direkbusarakom đã thử nghiệm dùng dịch chiết rút từ cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus spp) để ngăn chặn sự bùng phát bệnh virus đầu vàng (YHD) ở tôm sú, cho kết quả rất khả quan. Những lô thí nghiệm có dịch chiết từ 2 loại Phyllanthus amarus và P.urinarria tôm vẫn sống và khỏe mạnh 80 - 100%, trong khi các lô đối chứng tôm chết 100% sau một ngày thí nghiệm. 4.3.3. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Bảng 4.2. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với V.alginolyticus Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được thể hiện qua bảng 4.2 và 4.3. Nồng độ thảo dược (ppm) Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MS ± SD 1000000 10.9 ± 0.91a 100000 8.9 ± 0.21b 10000 5.0 ± 4.38b 1000 0.0 ± 0.00b (a, b: thể hiện sự khác biệt thống kê với p<0,05) Bảng 4.3. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với Vibrio harveyi Nồng độ thảo dược (ppm) Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MS ± SD 1000000 9.2 ± 0.92a 100000 7.9 ± 0.58a 10000 6.3 ± 0.12b 1000 0.0 ± 0.00a (a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p<0,05) Đối với V.alginolyticus, kết quả bảng 4.2 thể hiện rõ diếp cá ở nồng độ 103 ppm không có khả năng kháng khuẩn. Các nồng độ khác đều có khả năng kháng khuẩn. Ở nồng độ 106 ppm hiệu quả kháng khuẩn của diếp cá cao hơn với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 10.9 ± 0.91 mm (sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p = 0.02 0.05). Đối với V.harveyi, qua bảng 4.3 thấy rõ diếp cá nồng độ 106, 105, 104 có khả năng kháng khuẩn, diếp cá nồng độ 103 không có tác dụng kháng khuẩn. Diếp cá nồng độ 106 kháng khuẩn mạnh hơn diếp cá nồng độ 105, 104 tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê (p = 0.09 > 0.05). Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình của hai nồng độ 105, 104: 7.9 ± 0.58 mm, 6.3 ± 0.12 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p = 0.009 < 0.05. Theo Đỗ Tất Lợi, 2004, trong cây diếp cá có chừng 0,0049 % tinh dầu, một ít chất ancaloit có tên cocdalin. Thành phần chủ yếu của tinh dầu có chứa mertylnonylxeton CH3CO(CH2)8CH3 (có mùi rất khó chịu), chất miêcxen C10H46, axit caprinic C9H19COOH và laurinaldehyt. Hoa quả chứa chất isoquexitrin và không chứa quexitrin. Những hợp chất này có tính kháng khuẩn mạnh, đặc biệt đối với những vi khuẩn gây bệnh trên người. 4.4. Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn của mỗi loại thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Bảng 4.4. So sánh khả năng kháng khuẩn của thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất (tương ứng với nồng độ 10ˆ6)của mỗi loại thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được sử dụng để so sánh hiệu quả giữa chúng. Kết quả được thể hiện qua bảng 4.7. Chủng vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)MD ± SD Tỏi 106 Chó đẻ 106 Diếp cá 106 V.alginolyticus 26 ± 0.44 20.2 ± 0.93 10.9 ± 0.91 V.harveyi 23.7 ± 1.18 19.3 ± 0.86 9.2 ± 0.92 (a,b trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0,05) Kết quả từ bảng 4.4 cho thấy, tất cả thảo dược khi thử nghiệm trên V.alginolyticus và V.harveyi đều có sự chênh lệch đường kính vòng kháng khuẩn. Tỏi, chó đẻ, diếp cá khi thử nghiệm trên vi khuẩn V.alginolyticus cho hiệu quả kháng khuẩn cao hơn so với thử nghiệm trên vi khuẩn V.harveyi. Tuy nhiên, không có sự khác biệt thống kê khi so sánh khả năng kháng khuẩn của tỏi, chó đẻ răng cưa, diếp cá khi thử nghiệm trên vi khuẩn V.alginolyticus và V.harveyi (p > 0,05). Trong cùng một loài vi khuẩn khả năng kháng khuẩn của thảo dược không giống nhau đối với các chủng vi khuẩn khác nhau. Thảo dược có tác dụng tiêu diệt chủng vi khuẩn này, nhưng lại không có khả năng tiêu diệt chủng vi khuẩn khác. Điều này có thể giải thích do cấu tạo tế bào của các chủng vi khuẩn có sự sai khác dẫn đến tác dụng của các hợp chất trong thảo dược lên màng tế bào vi khuẩn không có sự đồng nhất giữa các chủng vi khuẩn. Vì vậy, khả năng tiêu diệt vi khuẩn của thảo dược cũng khác nhau ở mỗi chủng vi khuẩn trong cùng một loài. 4.5. Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn giữa các loại thảo dược khác nhau đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất (tương ứng với nồng độ 10ˆ6)của mỗi loại thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được sử dụng để so sánh hiệu quả giữa chúng. Kết quả được thể hiện ở đồ thị 4.5 và 4.6. a b a Đồ thị 4.5. Khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược khác nhau đối với Vibrio alginolyticus (a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) b a a Đồ thị 4.6. Khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược khác nhau đối với Vibrio harveyi (a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) Kết quả từ đồ thị 4.5 cho thấy, đối với vi khuẩn V.alginolyticus, trong 3 loại thảo dược được thử nghiệm, tỏi 106 có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 26 ± 0.44 mm. Chó đẻ 10ˆ6 khả năng kháng khuẩn tương đối mạnh với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 20.2 ± 0.93 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p = 0.0006 < 0.05). Diếp cá 106 là thảo dược có khả năng kháng khuẩn kém nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 10.9 ± 0.91 mm. Chó đẻ và diếp cá có chênh lệch về đường kính vòng kháng khuẩn, sự chênh lệnh này có ý nghĩa thống kê với p = 0.0002 < 0.05. Đối với vi khuẩn V.harveyi, kết quả từ đồ thị 4.6 chỉ rõ trong các loại thảo dược thử nghiệm, tỏi 106 có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 23.7 ± 1.18 mm, chó đẻ 106 khả năng kháng khuẩn kém hơn tỏi 106 nhưng hiệu quả hơn diếp cá 106 với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 19.3 ± 0.86 mm. Sự sai khác này có ý nghĩa thống kê (p = 0.007 < 0.05). Diếp cá có đường kính vòng kháng khuẩn nhỏ nhất với kích thước 9.2 ± 0.92 mm, có sự sai khác có ý nghĩa với chó đẻ răng cưa (p = 0.0002 < 0.05) . 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận - Kết quả phân lập cho thấy 2 chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi đã được phát hiện trong mẫu tôm giống thu được. - Trong 3 loại thảo dược được thử nghiệm cho thấy 3 loại đều có khả năng tiêu diệt chủng vi khuẩn phân lập được. - Trong 3 loại thảo dược có khả năng kháng khuẩn, tỏi có khả năng kháng khuẩn cao nhất với đường kính vòng kháng khuẩn 26 ± 0,44 mm, diếp cá có đường kính vòng kháng khuẩn nhỏ nhất. - Nồng độ thảo dược có tác dụng kháng khuẩn cao nhất là 106. Nồng độ diếp cá 103 không có khả năng kháng khuẩn. 5.2. Kiến nghị - Phân tích thành phần hóa học của các loại thảo dược để hiểu rõ hơn về cơ chế kháng khuẩn. - Tiến hành cảm nhiễm ngược trở lại trên tôm, dùng chiết xuất thảo dược để thử nghiệm khả năng trị bệnh. - Nhân rộng kết quả nghiên cứu, áp dụng vào thực tiễn. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Tôn Thất Chất, 2006. Giáo trình kỹ thuật nuôi giáp xác, trường Đại học Nông Lâm Huế. [2]. Võ Văn Chi, 2000. Cây thuốc trị bệnh thông dụng, NXB Thanh Hoá. [3]. Võ Văn Chi, 1997. Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội. [4]. Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến. Phân loại học thực vật bậc cao, 1978. NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp. [5]. Phan Văn Chinh. Bài giảng Dược liệu thú y, trường Đại học Nông Lâm Huế. .[6]. Hà Ký và cộng tác viên, 1995. Phòng và trị bệnh cho tôm cá, Báo cáo tổng kết cấp Nhà nước mã số KN - 04 - 12, Hà Nội. [7]. Nguyễn Thị Huế Linh, 2006. Bài giảng Bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản, trường Đại học Nông Lâm Huế. [8]. Đỗ Tất Lợi, 1968. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. [9]. Chu Viết Luân, 2003. Thủy sản Việt nam phát triển và hội nhập, NXB Chính trị quốc gia Hà Nội. [10]. Nguyễn Ngọc Phước, 2002. Bệnh và phương pháp chẩn đoán bệnh, trường Đại học Nông Lâm Huế. [11]. Nguyễn Ngọc Phước, Phạm Thị Phương Lan, Nguyễn Quang Linh, Kishio Hatai, 2007. Nghiên cứu khả năng kháng nấm của dịch chiết lá Trầu (Piper betle. L), Tạp chí Thủy Sản số 4/2007. [12]. Nguyễn Ngọc Phước, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Quang Linh, Ngô Thị Hương Giang, Nguyễn Nam Quang, 2007. Sử dụng thảo dược và chế phẩm từ thảo dược trong điều trị bệnh vi khuẩn cho động vật thủy sản, Kỷ yếu khoa học công nghệ, 2007. Liên hiệp Khoa học kỹ thuật Việt Nam, Hà Nội. [13]. Bùi Quang Tề, Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004. Bệnh học thủy sản, NXB Nông Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh. [14]. Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám, 1999. Những bệnh thường gặp của tôm cá và biện pháp phòng trị, NXB Nông Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh. 15]. Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành và cộng tác viên, 2006. Kết quả nghiên cứu chế phẩm ( VTS1-C) ( VTS1 – T) tách chiết từ thảo dược phòng trị bệnh cho tôm sú và cá tra. [16]. Bùi Quang Tề, Đỗ Thị Hoà, Lê Xuân Thành và cộng tác viên, 2006. Dự thảo danh mục các chất thay thế hoá chất, kháng sinh và chế phẩm sinh học cấm sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản. [17]. Nguyễn Thị Vân Thái và cộng tác viên, 2006. Bàn về tiềm năng phòng và chữa bệnh nhiễm khuẩn bằng kháng sinh thảo mộc trong nuôi trồng thuỷ sản. [18]. Phan Xuân Thanh và cộng tác viên, 2002. Tuyển tập nghề cá đồng bằng sông Cửu Long. [19]. Phạm Thiệp, Vũ Ngọc Thuý, 2001. Thuốc biệt dược và cách sử dụng, Nhà xuất bản Y học. [20]. Trần Linh Thước, 2002. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục. [21]. Khuê Lập Trung, 1985. Kỹ thuật phòng trị bệnh tôm, cá và nhuyễn thể, NXB Nông thôn Trung Quốc. [22]. Nguyễn Thị Xuyến, 1997. Thực tập vi sinh vật, trường Đại học Nha Trang. [23]. Tổng kết tình hình nuôi trồng thuỷ sản năm 2009, phương hướng, nhiệm vụ kế hoạch năm 2010. Báo cáo chính thức của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Thừa Thiên Huế. [24]. Tổng kết tình hình nuôi trồng thuỷ sản năm 2008, phương hướng, nhiệm vụ kế hoạch năm 2009. Báo cáo chính thức của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Thừa Thiên Huế. [25]. Tình hình nuôi trồng thuỷ sản Thừa Thiên Huế năm 2007, Báo cáo của Sở Thuỷ Sản Thừa Thiên Huế. [26]. Tình hình nuôi trồng thuỷ sản Thừa Thiên Huế năm 2004, Báo cáo của Sở Thuỷ Sản Thừa Thiên Huế. [27]. Tổng kêt tình hình nuôi trồng thuỷ sản năm 2002. Báo cáo của Bộ Thuỷ Sản. [28]. Kobori, K., and Tanabe, T., 1993. Atimicrobial activity of Hinokitiol for methicillin resistant staphylococus aureus. 2 (in Japanese). Med. Examinat. 1639 – 1642. Các website: [29]. Website chuyên về Nông nghiệp và Thuỷ sản: www.vietlinh.com.vn [30]. Website của Bộ Thuỷ Sản: www.fishtenet.gov.vn [31]. Bách khoa toàn thư mở: www.en.wikipedia.org [32]. Website của Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I: www.ria1.mofi.gov.vn [33]. www.24h.com.vn www.dantri.com.vn www.vnexpress.net MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Bảng tổng hợp giống thả các huyện và thành phố Huế 14 Bảng 2.2. Diện tích nuôi nước lợ theo các huyện Error! Bookmark not defined. Bảng 2.3. Diện tích nuôi nước ngọt theo huyện 16 Bảng 2.4. Thiệt hại do bệnh tôm gây ra ở các tỉnh miền Nam năm 1996 18 Bảng 2.5. Tình hình dịch bệnh năm 2009 20 Bảng 4.1. Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn trên tôm sú giống 16 Bảng 4.2. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với V.alginolyticus 24 Bảng 4.3. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với Vibrio harveyi 24 DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với V.alginolyticus 19 Đồ thị 4.2. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với V.harveyi20 Đồ thị 4.3. Khả năng kháng khuẩn của chó đẻ răng cưa đối với V.alginolyticus 22 Đồ thị 4.4. Khả năng kháng khuẩn của chó đẻ răng cưa đối với V.harveyi22 Đồ thị 4.5. Khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược khác nhau đối với Vibrio alginolyticus26 Đồ thị 4.6. Khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược khác nhau đối với Vibrio harveyi27