Phương pháp phân tích cực phổ

CHƯƠNG 2 : MỘT SỐ CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP CỰC PHỔ 2.1 Xác định hàm lượng kẽm trong rau quả, và sản phẩm rau quả bằng phương pháp phân tích cực phổ theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7811-1:2007, Iso 6636-1:1986. 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định hương pháp xác định hàm lượng kẽm trong rau, quả và sản phẩm rau, quả bằng phân tích cực phổ. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tà liệu vện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu vện dẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi. TCVN 5120 (ISO 874), Rau và quả tươi-Lấy mẫu 3 Nguyên tắc Tro hoá toàn bộ phần mẫu thử trong lò nung ở nhiệt độ 5250C+250C . Xử lý lượng tro thu được bằng axit clohydric. Trung hoà bằng amoniac 25% (khối lượng) rồi xác định hàm lượng kẽm bằng máy đo cực phổ có sử dụng dung dịch điện phân amonac/amoni clorua. 4 Thuốc thử Tất cả các thuốc thử sử dụng phải có chất lượng phân tích và nước được sử dụng phải là nước cất hay ít nhất là nước có độ tinh khiết tương đương. 4.1 Axit nitric 4.2 Axit clohydric, pha loãng theo tỉ lệ 1:1 Pha loãng 1 phần thể tích axit clohydric với 1 phần thể tích nước 4.3 Amoniac, dung dịch 25%theo khối lượng. 4.4 Dung dịch điện phân Hoà tan 52,5 g amoni clorua trong nước đựng trong bình định mức 1000l, thêm 155ml dung dịch amoniac (4.3), thêm nước đến vạch rồ. Trộn. 4.5 Natri sulfit (Na2SO3), dung dịch nồng độ 1mol/l 4.6 Kẽm, dung dịch chuẩn có nồng độ từ 0,01mg đến 0,04mg kẽm trên mililt. 4.6.1 Dung dịch gốc Hoà tan hoàn toàn 1g kẽm kim loại [độ tinh khiết ít nhất là 99% (theo khối lượng)] trong 10ml axit clohydric (3.2) đựng trong bình nón. Chuyển toàn bộ sang bình định mức 1000ml, thêm nước đến vạch rồi trộn. 4.6.2 Chuẩn bị Pha loãng từ 1ml đến 4ml dung dịch kẽm gốc (4.6.1) trong bình định mức 100ml, thêm nước đến vạch rồi trộn 5 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm thông thường và cụ thể như sau: 5.1 Máy đo cực phổ, thích hợp cho việc xác định hàm lượng kẽm lớn hơn 0,05mg/kg, được trang bị điện cực giọt thuỷ ngân là catot và máy điện phân có đáy thuỷ ngân là anot. 5.2 Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ từ 100+5 đến 150+5. 5.3 Lò nung, có thể duy trì nhiệt độ từ 100 5.4 Đĩa sứ, có đường kính từ 9cm đến 11cm 5.5 Bình định mức một vạch, dung tích 50ml. 5.6 Pipet chia độ, dung tích tù 1ml đến 10 ml 5.7 Bình nón, dung tích 25ml 5.8 Cân phân tích 5.9 Nồi cách thuỷ 6 Lấy mẫu Phương pháp lấy mẫu rau, quả tươi xem TCVN 5120 (ISO 874) Trộn kĩ mẫu thử trước khi lấy phần mẫu thử. Đối với mẫu thử đông lạnh hoặc đông lạnh nhanh, thì tiến hành làm tan băng trong bình kín rồi gộp phần nước tan ra với sản phẩm rồi đồng hoá. 7 Cách tiến hành 7.1 Phần mẫu thử Cân khoảng 10g đến 25g mẫu chính xác đến 0,01g, tuỳ theo hàm lượng kẽm dự kiến rồi chuyển vào chén sứ (5.4) 7.2 Phân huỷ 7.2.1 Đặt đĩa sứ đựng phần mẫu thử (7.1) vào tử sấy 5.2 và sấy ở nhiệt độ từ 110C đến 120C. Sau đó chuyển sang lò nung )5.3) đặt ở nhiệt độ 250C. Tăng từ từ nhiệt độ lên đến 350C và giữ ở nhiệt độ này cho đến khi phần mẫu thử này không còn sủi bọt nữa. Tăng dần nhiệt độ lên đến 525C ( sao cho phần mẫu thử không bốc cháy) và tiến hành tro hoá trong vòng 6h. Lấy đĩa sứ ra khỏi lò và để nguội. Nếu trong tro có một lượng lớn các mảnh các bon thì tiến hành như sau: Làm ẩm tro bằng 0,5 ml nước sau đó cho thêm 0,5 ml axit nitric (4.1) Cho toàn bộ bay hơi đến khô trên nồi cách thuỷ (5.9). Đặt đĩa vào lò nung ở nhiệt độ 250C, tăng nhiệt độ lên đến 525 và giữ trong vòng từ 1h đến 2h. Lặp lại toàn bộ quá trình này cho đến khi trong tro không còn những mảnh cácbon nữa. nếu cần. 7.2.2 Cho 10ml axit clohydric (4.2) vào tro và đặt trên nồi cách thuỷ cho hoà tan được dễ đàng và để nguội. 7.2.3 Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 50ml (5.5) rồi dùng 5ml đến 10ml nước để rủa và cho nước rủa vào bình định mức. 7.2.4 Thêm dung dịch amoniac (4.3) avò dich trên cho đến khi mùi amoniac xuất hiện (pH = 8) thêm tiếp dung dịch moniac cho đến khi pH đạt đến 10. Thêm nước đến vạch, trộn đều rồi lọc. 7.3 Phép thử trắng Tiến hành phép thử đối vỡi mẫu trắng song song cùng với phép xác định, theo cùng một quy trình thử, thêm cùng một lượng thuốc thử, nhưng thay thế phần mẫu thử bằng một lượng nước có khối lượng tương đương. 7.4 Phương pháp xác định 7.4.1 Dùng pipet hút 2 lần mỗi lần 8ml dung dịch lọc được (7.2.4 ) cho vào bình nón (5.7). 7.4.2 Thêm 1ml dung dịch natri sulfat (4.5) và 1ml nước vào một trong 2 bình nón rồi thêm dung dịch điện phân (4.4) để đạt đến thể tích là 25 ml. Trộn kỹ. Chuyển dung dịch sang bình điện phân của máy đo cực phổ. Rửa bình nón với một lượng nhỏ dung dịch thử. 7.4.3 Tiến hành đo cực phổ bằng cách quét từ -1,0V đến -1,6V theo hướng dẫn của nhà cung cấp thiết bị. Cài đặt độ nhạy của thiết bị tương ứng với hàm lượng kẽm dự kiến. Các thiết bị khác nhau có cách thức cài đặt khác nhau. Điện thế nửa sóng, E1/2, đối với kẽm vào khoảng -1,2V. Tốc độ nhỏ giọt của thuỷ ngân là 10 giọt trong vòng 25 giây cho đến 30 s. 7.4.4 Sau khi đã ghi lại cực phổ lần thứ nhất, tháo hết dung dịch trong bình điện phân rồi tráng bằng một ít dung dịch thử tiếp theo trước khi sử dụng lại. 7.4.5 Thêm vào bình nón thứ hai 1ml dung dịch natri sulfit (4.5) và một thể tích đã biết của dung dịch kẽm chuẩn (4.6), thể tích này không vượt quá 1ml. Thêm dung dịch điện phân (4.4) để có được 25ml. Tiến hành như đã mô tả trong 7.4.2. Lặp lại quá trình này 2 lần thêm tương tự dung dịch chuẩn kẽm và thu được hàm lượng kẽm bằng cách ngoại suy. Hiệu chỉnh kết quả với kết quả thu được từ phép thử trắng. 7.5 Số lần xác định Tiến hành 2 phép xác định trên hai phần mẫu thử lấy từ cùng một mẫu. 8 Biểu thị kết quả 8.1 Phương pháp tính toán Hàm lượng kẽm, tính theo miligam trên kilogam sản phẩm, bằng công thức sau đây: Trong đó h1 Là chiều cao của sóng cực phổ thu được từ lần đo thứ nhất (xem 7.4.3) tính bằng mlimét h2 Là chiều cao của sóng cực phổ thu được từ lần đo thứ hai (xem 7.4.5) tính bằng mlimét m là khối lượng của phần mẫu thử (7.1), tính bằng gam; V0 là tổng thể tich dung dịch được chuẩn bị từ phần mẫu thử đã phân huỷ (xem 7.2.4), tính bằng mililit; V1 là thể tích dung dịch dùng cho phép đo thứ nhất (xem 7.4.2), tính bằng mililít V2 là thể tích dung dịch dùng cho phép đo thứ hai xem (7.4.5), tính bằng mililít V3 là thể tích của phần mẫu đã sử dụng để chuẩn bị cho dung dịch phân tích (7.4.1), tính bằng mililit; V4 là thể tích của dung dịch chuẩn kẽm được thêm vào (7.4.5), tính bằng mililít; r20 là nồng độ cả dung dịch chuẩn kẽm (4.6) tính bằng miligam trên mili lit Kết quả là giá trị trung bình của các giá trị thu được trong hai phép xác định, khi đáp ứng được yêu cầu về độ lặp lại (xem 8.2) Kết quả lấy đến 1 chử số thập phân 8.2 Độ lặp lại Chênh lệch kết quả của hai lẫn xác định(7.5) được thực hiện đồng thời hay liên tiếp nhanh trong cùng điều kiện (cùng người thực hiện, cùng thiết bị và dụng cụ, cùng phòng thử nghiệm) không được vượt quá 5% giá trị trung bình. 9 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ phương pháp sử dụng và kết quả thu được. Báo cáo cũng phải nêu rõ mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tuỳ ý cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả. Báo cáo thử nghiệm cũng phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử 2.2 Xác định hàm lượng axit Fumaric trong thực phẩm bằng phương pháp cực phổ theo tiêu chuẩn AOAC 968.16 A. Máy móc, thiết bị : Dụng cụ dùng cho bất cứ phương pháp cực phổ hay voltampe nào đều gồm các bộ phận cần thiết như bình chuẩn độ, điện cực, thuỷ ngân, cột mao quản. Phương pháp này cho hiệu quả khi ta quét ở diện thế 3V ở cả điện cực dương và âm. B. Thuốc thử: (a) Dung dịch chuẩn axit Fumaric. (1) Dung dịch gốc 500ppm Cân 50mg axit fumaric cho vào bình định mức 100ml. Hoà tan và định mức đến vạch bằng methanol. (2) Dung dịch chuẩn làm việc : 25ppm Dùng pipet hút 5ml dung dịch gốc cho vào bình định mức 100ml, thêm vào 15ml methanol và dịnh mức đến vạch bằng dung dịch chất điện li. (b) Dung dịch điện li: Hoà tan 7.70g (CH3)4NBr và 0.210g LiCl vào trong nước và định mức đến 500ml. (LiCl rất dễ bị hút ẩm và bị phân huỷ bởi ánh sáng) (c) Khí nitơ. Nước tinh khiết. Bơm N2 bằng xylanh. C. Chuẩn bị dung dịch mẫu (a) Dung dịch mẫu A. (1) Mẫu dạng dung dịch ( nước ép tái cây…) Nếu mẫu không tan thì ta phải khuấy mạnh bằng Celite và tiến hành lọc. Chuyển 25,00g dung dịch sạch vừa lọc được cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol. (2) Powders Lắc mạnh mẫu cân với 1 thể tích chính xác methanol. Tiến hành lọc hoặc sừ dụng supernate sạch. (b) Dung dịch mẫu kiểm tra B: Sử dụng trong việc kiểm tra sơ bộ. Hút khoảng 5ml dung dịch mẫu A cho vào bình định mức 25ml ( nếu trường hợp hút < 5ml thì ta thêm methanol vào đến 5ml) và định mức đến 25ml bằng dung dịch điện li. (c) Dung dịch kiểm tra C : Sử dụng trong việc xác định cuối cùng. Sau khi xác định sơ bộ dung dịch kiểm tra B thì ta tiến hành điều chỉnh lại khối lượng mẫu cho nồng độ cuối của dung dịch kiểm tra C thành 25microgam axit Fumaric /ml, chuẩn bị dung dịch như (b). D. Chuẩn bị dãy chuẩn. Hút lần lượt 1ml, 3ml, 5ml dung dịch axit Fumaric gốc vào bình định mức 25ml. Đối với bình định mức chứa 1ml và 3ml dung dịch gốc ta thêm vào theo thứ tự 4ml, 2ml methanol. Định mức tất cả bình định mức đến vạch bằng dung dịch điện li.Tiến hành xác định bằng máy cực phổ. Đổi những giá trị số của dung dịch thành đơn vị microgam axit fumaric/ml. E. Xác định Chuẩn bị tế bào cực phổ và cho N2 chạy qua dung dịch kiểm tra B trong 3 phút với vận tốc 3-5 bọt bong bóng/s. Máy cực phổ sử dụng điện thế khởi đầu là – 0.8V. Peak điện thế của axit Fumaric trong điều kiện này là -1,15V với bể diện cực thuỷ ngân. Chiều cao sóng *( instrument scale factor) cho ra giá trị số và giá trị này biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ của axit fumaric trong dung dịch cực phổ. Từ giá trị của dung dịch kiểm tra B và dãy chuẩn ta tính toán được tỉ lệ phần trăm axit Fumaric trong mẫu. Thực hiện việc xác định 2 lần, sử dụng để tính khối lượng mẫu cho dung dịch kiểm tra C có nồng độ 25ppm. Giá trị phân tích cực của mẫu và chuẩn nên gần sát nhau. Từ 2 lần xác định ta tính toán: (a) mg axit Fumaric/ ml trong dung dịch kiểm tra C = [mg axit Fumaric/ml trong dung dịch chuẩn (0.025)]* [ giá trị số của dung dịch kiểm tra C) / (giá trị của dung dịch chuẩn làm việc) (b) %axit Fumaric trong mẫu = (mg axit fumaric/ ml trong mẫu kiểm tra C)*[ml dung dịch kiểm tra C (25ppm)]*100/( mg mẫu trong dung dịch mẫu a chia nhỏ được sử dụng trong khi chuẩn bị dung dịch kiểm tra C) 2.3 Xác định hàm lượng Bismuth trong thuốc bằng phương pháp cực phổ theo tiêu chuẩn AOAC 972.46 A.Máy móc thiết bị Máy cực phổ: Sử dụng máy von-ampe kế hoặc máy cực phổ cùng với các phụ kiện cần thiết (bình điện phân, điện cực, Hg, ống mao quản) mà có khả năng quét từ 0-1V và đo 0.04ma/mm Bình điện phân: Sử dụng loại bình điện phân nhỏ với Calomel bão hoà hoặc bể thuỷ ngân làm điện cực so sánh. B.Thuốc thử. Chất điện li nền: HCl 1M. Cho 171ml HCl và 1L nước vào bình định mức 2l và lắc đều. Bộ khử Gelatin cực đại: 1mg/ml Cân chính xác 100mg Gelatin cho vào bercher nhỏ và hoà tan bằng một ly nhỏ nước cất. Chuyển lượng cân đổ vào bình định mức 100 và định mức bằng nước. Chuẩn bị để sử dụng trong ngày. Dung dịch Bismuth chuẩn Dung dịch gốc: 1mg/ml chuyển 122,2 mg Bismuth Subcarbonate, Tương đương 100mg Bi (mg Bi Subcarbonate x 0,8182 [ từ dung dịch chuẩn ban đầu] = mg Bi) vào bình định mức 100 định mức bằng dung dịch điện ly nền (HCl 1M) Dung dịch làm việc: 0,2mg/ml. Dùng pipet hút 20ml dung dịch gốc vào bình định mức 100ml, thêm vào 1ml Gelatin maximum suppressor và pha loãng đến vạch bằng dung dịch chuẩn (HCl 1M). Lắc kỹ. C.Chuẩn bị mẫu: a)Thuốc viên: Xác định khối lượng trung bình. Nghiền thuốc đến kích thước 60 sieve (kích thước của rổ sàng rây). Định lượng lượng thuốc viên có 10mg Bi, Cân chính xác, cho vào bình định mức 50ml cùng với HCl 1M. Thêm vào 0,5 ml Gelatin maximum suppressor và pha loàng đến vạch bằng HCl 1M. Lắc mạnh hoặc sử dụng máy dao động âm (sóng âm). Lọc nhanh qua giấy lọc chỉ trước khi xác định bằng phân tích cực phổ b)Hỗn hợp các chất hữu cơ, nhũ tương và các hợp chất hữu cơ có thể tiêm được (injectables). Trộn lẫn để phân tán các chất. Chuyển trực tiếp một phần ước số 100mg Bi vào định mức 100ml. Rửa pipet bằng HCl 1M và pha loãng đến vạch bằng dung dịch đó (HCl 1M). Hút 10ml vào bình định mức 50ml. Thêm 0,5ml Gelatin định mức đến vạch bằng HCl 1M lắc đều. c)Bột: chuyển toàn bộ hàm lượng của lọ thuốc, hoặc số lượng tương đương với 200ml Bi đối với mẫu gộp hoặc vào bình định mức 200ml. Rửa lọ, đổ vào bình và pha loãng mẫu đến vạch bằng HCl 1M. Làm tương đương với magma (bắt đầu dùng pipet 10ml hút……) D.Xác định. Chuyển dung dịch thành phân tử và cho khí N2 đi qua 10 phút. Ghi nhận phổ cực phổ từ 0 đến 1 V đối với điện cực so sánh là Calomel bão hoà. Đo độ cao của cường độ dòng khuyếch tán ở nửa bước sóng điện thế (E1/2) và xác định nồng độ Bi bằng cách so sánh độ cao sóng của dung dịch mẫu với dung dịch chuẩn trực tiếp trước và sau mẫu. Thực hiện tất cả các phép xác định tại cùng cường độ dòng một cách liên tiếp và biểu thị kết quả. Đại lượng E1/2 là giá trị để định tính Bi Cách tính nồng độ như sau: Dạng thuốc viên: mgBi/mg mẫu = 50 x (I/I’) x C x (W/W’) Magma, nhũ tương, injectables: mgBi/ml = 500 x (I/I’) x (C/V) Dạng bột: mgBi/mg mẫu = 1000 x (I/I’) x (C/W’) Tại I và I’ bằng cường độ dòng khuyếch tán của mẫu và chuẩn một cách tương ứng; C = mgBi/mlL nồng độ dung dịch làm việc (1)(2), W và W’ bằng khối lượng trung bình của thuốc viên và khối lượng mẫu được lấy (mg) tương ứng; V = mL là dung dịch chuẩn bị E.Đo cường độ dòng khuyếch tán Đo cường độ dòng khuyếch tán (Ido ở E1/2). Vẽ đường tiếp tuyến đến các đỉnh của dòng dư và dòng giới hạn. Vẽ đường tiếp tuyến dốc thẳng đứng thứ 3. Đo chiều dài của nó, chọn ra điểm Id/2, rồi kẽ vuông góc với điểm này và qua hoành độ của nó (ứng dụng sức điện động). Cường độ dòng khuyếch tán là phần vuông góc chia giữa đường cắt của dòng giới hạn và đường tiếp tuyến của dòng dư. Tham khảo JAOAC 55, 155(1972) 2.4 Xác định cực giọt thủy ngân treo. A2.1 Cho 4 ml nước trong bercher 5 ml và một điện cực nhỏ giọt thủy ngân dưới dạng giọt treo(HMDE) mao quản ở dưới bề mặt của nước. A2.2 Đẩy ra khỏi vị trí 10 giọt từ HMDE trong bercher 5 ml. A2.3 Gạn nước và lấy 3ml phần aceton A2.4 Thu được trọng lượng của bercher với điện cực (+) thủy ngân (WT) A2.5 Loại bỏ thủy ngân và thu được trọng lượng của bercher(WB). A2.6 Tính toán điện cực giọt thủy ngân treo( giả thiết của giọt thủy ngân hình cầu) như cho phép: A2.6.1 WHg = ((WT - WB)/10 = trọng lượng của một giọt thủy ngân. A2.6.2 Thu được độ đặc của thủy ngân tại nhiệt độ phòng pHg, từ bảng như sau. Nếu sử dụng ở nhiệt độ phòng mà không được liệt kê ở đây tìm độ đặc tại nhiệt độ điều chỉnh , từ nguồn mẫu phù hợp. Nhiệt độ , 0C pHg, g/ml 13.5462 15.5438 13.5413 13.5398 13.5364 13.5340 13.5315 13.5291 12.5266 13.5242 30 13.5217 A2.6.3 Bề mặt giọt Hg = 4 (3 WHg/4pHg)2/3 A2.7 Tính toán mẫu : WHg = 0.006228 for 1 Hg drop Bề mặt 1 giọt Hg = 4 = 12.56636(1.0978 * 10-1)2/3 = 2.881 mm2 A2.8 Theo bảng ở đây tính toán bề mặt điện tích để phân chia nhỏ dọc thẳng trên điều chỉnh bằng điện cực giọt thủy ngân treo. Diện tích bề mặt , mm2 Đuờng phân chia nhỏ 1.42 2 1.86 3 2.23 4 2.6 5 2.92 6 3.23 7 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.AOAC Oficial method 968.16 Fumaric Acid in Food Polarographic Method First Action 1968 Final Action 1969 Apparatus Polarograph.- Any voltammetric or polarographic instrument with necessary accessories ( cells, electrodes, Hg, capillaries,etc.) Capale of effectively scanning up to3.0 votls in either positive or nagative direction starting at selected initial potential. Reagents Fumaric acid standard solutions.-(1) Stock solution.- 500microgam/ml Transfer 50 mg fumaric acid to 100ml volumetric flask. Dissolve in and dilute to volume with methanol. (2) Working standard solution. -25microgam/ml. Pipet 5ml stock solution into 100ml volumetric flask, add 15ml methanol, dilute to volume with electrolyte solution. Electrolyte solution.-dissolve 7.70g (CH3)4NBr and 0.210g LiCl in H2O and dilute to 500ml. (LiCl is very hygroscopic: weigh rapidly with minimun exposure to air) Nitrogen gas.-Purified H2O-pumped N2 in cylinder. Preparation of sample solutions. Sample solution A.-(1) Aqueous sample (fruit juice drinks, etc.)- If insolution matter is present, shake with Celite and filter. Transfer 25.00g clear solution to 100ml volumetric flask, using methanol, and dilute to volume with measured volume methanol. Filter, or use clear supemate. Sample test solution B.- Use in preliminary determination. Transfer <= 5ml sample solution A to 25ml volumetric flask (if < 5ml is taken, add methanol to make 5ml) and dilute to volume with electrolyte solution. Sample test solution C.- Use in final determination. After preliminary determination is performed on sample test solution B, adjust weight of sample to give final concentration of sample test solution C of 25microgam fumaric acid/ml, preparing solution as in (b). C.Preparation of Standard Curve Transfer 1,3, and 5ml fumaric acid stock solution to separate 25ml volumetric flask. To flask containing 1 and 3ml stock solution, add 4 and 2ml methanol, respectively. Dilute all flask to volume with electrolyte solution. Polarograph solution as in determination. Plot numerical values of solution against microgam fumaric acid/ml. Determination Prepare polarograph cell and pass N2 through sample test solution B 3 min at ca 3-5 bubbles/s. Polarograph, using starting potential of -0.8V. Peak potential of fumaric acid under these conditions is ca -1.15V with Hg pool electrode. Wave height * instrumet scale factor gives “ numerical value”, which shows relative concentration of fumaric acid in polarographed solution. From numerical value of sample test solution B and standard curve, calculate approximate % fumaric acid in sample. Make second determination, using calculated weight sample for sample test solution C containing 25microgam fumaric acid/ml and working standard solution containing exactly 25 microgam fumaric acid/ml. Polarographic values of sample and standard should be very close. From second determination calculate: mg fumaric acid/ml in sample test solution C = [ mg fumaric acid/ ml in working standard solution (= 0.025)]* ( numerical value of sample test solution C)/( numerical value of working standard solution). % fumaric acid in sample = (mg fumaric acid/ml in sample test solution C)* [ ml sample test solution C (=25)]*100/(mg sample in aliquot sample solution A used in preparing sample test solution C. References : JAOAC 49, 701 (1966); 51, 533 (1968). CAS-110-17-8 (fumaric acid). 2.AOAC Official Method 972.46 Bismuth compounds in Drugs Polarographic Method First Action 1972 Final Action 1974 Apparatus Polarograph-Any voltammetric or polarographic instrument with necessary accessories (cells, electrodes, Hg, capillaries) capable of scanning 0 to -1.0V and measuring 0.040ma/mm. Cells-Microcell with saturated calomel or Hg pool reference electrode. B.Reagents Supporting electrolyte-1M HCl. Add 171mL HCl to ca 1L H2O in 2 L volumetric flask and mix. Cool to room temperature, dilute to volume with H2O, and mix. Gelatin maximum supperssor.-1mg/mL.Accurately weigh 100mg gelatin into small beaker and dissolve in small amount of H2O om steam bath. Transfer quantitatively to 100 mL volumetric flask and dilute to volume with H2O. Prepare fresh daily. Bismuth standard solutions.-(1) Stock solution.-1mg/mL. Transfer 122.2 mg Bismuth subcarbonate, equivalent to 100 mg Bi(mg Bi subcarbonate x 0.8182 [factor derived from primary standard]=mg Bi), to 100mL volumetric flask with supporting electrolyte, (a). Dilute to volume with same solution. (2) Working solution.-0.2mg/mL. Pipet 20mL stock solution into 100 mL volumetric flask, add 1.0ml Gelatin maximum supperessor, (b), and dilute to volume with supporting electrolyte, (a). Mix thoroughly. C. Preparation of sample a) Tablets.-Determine average weight/tablet. Grind to pass No.60 Sieve. Quantitatively transfer amount tablet material containing 10mg Bi, accurately weighed, to 50mL volumetric flask with aid of 1M HCl, (a). Add 0.5mL Gelain maximum supporessor, (b) and dilute to volume with 1M HCl. Shake thoroughly or use sonic vibrator. Filter through rapid paper just before polarographic determination. b) Magma, emulsions,and injectables.-Mix thoroughly to dis-perse suspension. Immediately transfer aliquot containing ca 100mg Bi to 100 mL volumetric flask. Rinse inside of pipet with 1M HCl, (a), and dilute to volume with same solution. Pipet 10mL into 50 mL volumetric flask, add 0.5 ml Gelatin maximum suppressor, (b)and dilute to volume with 1M HCl. Mix thoroughly. c) Powder.-Transfer entire contents of vial, or amount material equivalent to 200 mg Bi for bulk powders or capsules, to 200 mL volumetric flask. Wash vial into flask and dilute sample to volume with 1M HCl, (a). Proceed as for magma, beginning “Pipet 10mL....” D.Determination Transfer solution to cell and bubble N2 through solution 10 min. Record polarogam, from 0 to -1.0 V against saturated calomel reference electrode. Measure height of diffusion current (Id) at half-wave potential (E1/2), and determine Bi concentration by comparing wave heights of smple solution with those of standard solution polarographed immediately beforeand after samples. Do all determinations at samme current sensitivity and consecutively. E1/2 value is qualitative identification of Bi. Calculate concentration of Bi as follows: a)Tablets-mg Bi/tablet = 50 x (I/I’) x C x (W/W’) b)Magma, elulsions,and injectables,- mgBi/ml = 500 x (I/I’) x (C/V) c)Powder.- mgBi/mg mẫu = 1000 x (I/I’) x (C/W’); Where I and I’= diffusion currents of sample and standard, respectively; C=mg Bi/mL working solution, (c)(2); W and W’ = average tablet weight and weight sample taken (mg),respectively; and V=mL liquid preparation taken. E. Measurement of Diffusion Current Measurement diffusion Current (Id at E1/2). Draw lines tangent to tops of residual and limiting currents. Draw third line tangen to vertical slope. Measure its length, mark off half-way point at Id/2; then drop perpendicular though this point and through abscissa (applied volt-age). Diffusion current is perpendicular portion of this line cutting through limiting current and redidual curerent tangent lines. 3.DETMINATION OF HANGING MERCURY DROP AREA A2.1 Place 4 ml of water into a 5 ml beaker and submerge a hanging mercury drop electrode (HMDE) capillary tip under the surface of water. A2.2 Extrude and disloge 10 drops from HMDE into the 5 ml beaker. A2.3 Decant the water and rinse with three 3 ml portions of acetone. A2.4 Obtain the weight of the beaker plus the mercury (WT). A2.5 Discard the mercury and the weight of the beaker (WB). A.2.6 Calculate the mercury drop area ( assuming a spherical drop ) as follows: A2.6.1 WHg = ((WT - WB)/10 = weight of a single mercury drop. A.6.2 Obtain the density of mercury at room temperature, pHg , from the following table. If the room temperature used is not listed here, find the density at the correct temperature from a suitable reference source. Temperature, 0C pHg, g/ml 13.5462 15.5438 13.5413 13.5398 13.5364 13.5340 13.5315 13.5291 12.5266 13.5242 30 13.5217 A2.6.3 Area of Hg drop = 4 (3 WHg/4pHg)2/3 A2.7 Sample Calculation: WHg = 0.006228 for 1 Hg drop Area of 1 Hg drop = 4 = 12.56636(1.0978 * 10-1)2/3 = 2.881 mm2 A2.8 Tabluted here are typical surface areas for each small vertical division on a manually opertated hanging mercury drop electrode. Surface Area, mm2 Reading , Small Vertical Division 1.42 2 1.86 3 2.23 4 2.6 5 2.92 6 3.23 7