Quy trình sản xuất sinh khối nấm men

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ------------–&—---------- QUY TRÌNH SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN GVHD: NGUYỄN THỊ THU SANG Sinh viên : Huỳnh Ngô Diệu Huyền 3005110118 Nguyễn Thị Kim Phụng 3005110239 Nguyễn Thị Thảo Quyên 3005110249 Mai Thị Thanh Thủy 3005110310 Phạm Thị Thanh Thủy 3005110311 Võ Thị Bích Trâm 3005110343 Nhóm: 1 Lớp: 11CDTP1 Tp,HCM 05/2014 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU 3 Giới thiệu 4 Định nghĩa 4 Các loại nấm men thường dùng 4 Giới thiệu sơ lượt về nấm men 4 Ứng dụng của nấm men và sinh khối nấm men 5 Giới thiệu sơ lượt về nấm men 6 Men lạt 6 Men ngọt 6 Sinh khối nấm men dạng thương mại 7 Men lỏng 7 Men dạng paste 7 Men khô 7 Điều kiện nuôi cấy nấm men 7 Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất nấm men 7 Nhiệt độ 7 Độ pH môi trường 7 Ảnh hưởng của chất hóa học 8 Ảnh hưởng nồng độ rỉ đường 8 Ảnh hưởng của cường độ không khí và khuấy trộn lên tốc độ tăng trưởng của nấm men 8 Các phương pháp xử lý dịch đường trước khi lên men 8 Phương pháp hóa học 8 Phương pháp cơ học 9 Các phương pháp bảo quản men giống 9 Phương pháp 1 9 Phương pháp 2 9 Phương pháp 3 9 Phương pháp 4 9 Sản xuất men khô 11 Chuẩn bị môi trường và nhân giống 11 Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng 11 Quá trình nhân giống 13 Quá trình nuôi cấy nấm men 14 Thu nhận sinh khối nấm men 16 Sấy khô 17 Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm 17 Sản xuất men nước 18 Thiết bị nuôi cấy nấm men 18 Thiết bị thanh trùng dạng bảng mỏng 18 Thiết bị lên men 19 LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, công nghệ lên men chiếm vị trí rất quan trọng và không thể thiếu trong ngành công nghệ thực phẩm.Lên men làm cho các sản phẩm thực phẩm đa dạng hơn, dinh dưỡng hơn và tiện ích hơn. Sản phẩm của công nghệ lên men có thể là canh trường lên men không chiết tách ( sữa chua), canh trường sau lên men đã chiết tách sinh khối ( bia, rượu vang…), một sản phẩm trao đổi chất (thạch dừa), hay là chính sinh khối của nấm men. Ngành công nghiệp thực phẩm cũng như công nghệ sinh học ngành càng phát triển , con người đã phần nào giải thích được những quá trình xảy ra trong quy trình lên men các sản phẩm khác nhau. Từ đó, cho thấy được tầm quan trọng của việc sản xuất bánh men có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng sản phẩm sau cùng. Ở bài tiểu luận này, nhóm chúng em đi sâu vào tìm hiểu quy trình sản xuất ra được sinh khối nấm men để sử dụng cho các quá trình lên men khác nhau bằng vốn kiến thức ít ỏi và các nguồn tài liệu khác. Trong quá trình tìm hiểu không tránh khỏi những soi sót về nội dung cũng như cách trình bày. Vì vậy, nhóm em rất chân thành cảm ơn sự đóng góp ý kiến của Cô và các bạn. Giới thiệu 1.1 Định nghĩa: Sinh khối: - Sinh khối là tổng trọng lượng của sinh vật trong sinh quyển hoặc sô lượng sinh vật sống trong 1 đơn vị diện tích, thể tích vùng. Nấm men: - Chỉ tên chung để chỉ nhóm vi nấm gồm các cấu tạo đơn bào thường sinh sôi và nảy nở bằng phương pháp nẩy chồi. - Con người hiểu biết về nấm men và những tính chất của nó mới được hơn 150 năm. Đến đầu thế kỉ 19, nấm men bia, nấm men thải từ nhà máy rượu bia đã được con người sử dụng để làm bánh mì. - Cuối thế kỉ 19, nhiều cải tiến kỹ thuật như hệ thống thông khí (nước Anh ), kỹ thuật li tâm để tách nấm men ra khỏi môi trường tăng trưởng (Mỹ) đã được dùng để sản xuất men bánh mì. Nguyên liệu để sản xuất sinh khối nấm men chủ yếu là rỉ đường. Thành phần hóa học của rỉ đường:chất phi đường và nước. Các chất phi đường bao gồm các chất hữu cơ và vô cơ.Các chất hữu cơ có chứa nitơ của rỉ đường mía chủ yếu là các acid amin cùng với một lượng nhỏ protein và sản phẩm phân giải của nó.Các chất phi đường vô cơ là các loại muối tìm thấy trong thành phần tro của rỉ đường. Rỉ đường mía còn chứa các nguyên tố khác với hàm lượng nhỏ như: Zn, Mn, Cu, B, Co, Mo. Rỉ đường rất giàu các chất sinh trưởng như: acid pentotenic, nicotinic, folic, B1, B2 và đặc biệt là biotin.1.2. Các men thường dùng trong sản xuất: * Giống nấm Candida: - Candida tropicalis: lên men rất tốt ở các dịch đường glucoza, galactoza, sacaroza, maltoza. không hấp thu được sorbioza, xenlobioza, lactoza… * Giống nấm Saccharomyces: - Saccharomyces cerevisiae: nấm men được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm như làm bánh mì, sản xuất cồn - Saccharomyces là một chi nấm men được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm như làmbanh mì, sản xuất cồn. Saccharomyces có nghĩa là nấm đường và là loại vi sinh vật duy nhất đuợc sản xuất với quy mô rất lớn trên thế giới. Các sản phẩm của quá trình lên men gồm các dạng: Sinh khối Sản phẩm trao đổi chất: bậc 1 và 2 Sản phẩm của sự chuyển hóa chất Sản phẩm lên men... Theo chức năng này, trong quá trình tiến hóa của tế bào vi sinh vật đã hình thành cơ chế điều hòa trao đổi chất sao cho phần lớn các chất dinh dưỡng tiêu hao phục vụ cho việc tổng hợp tế bào chất. Ứng dụng của nấm men và sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae: được sử dụng rất phổ biến trong sản xuất bia rượu và bánh mì. Nấm men còn được sử dụng làm cao chiết nấm men trong nuôi cấy vi sinh vật, là nguồn thu nhận một số vitamin; protein, enzyme, kháng sinh, chất màu... Nấm men còn là đối tượng nghiên cứu trong kỹ thuật di truyền. Gần đây, các nhà khoa học đã đưa vào bộ gen của nấm một loại gen trích từ chuột, có khả năng phản ứng khi tiếp xúc với thuốc nổ DNT (tên khoa học là 2,4-dinitrotoluen)... Giới thiệu sơ lược về nấm men Saccharomyces là một chi nấm men được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm như làm bánh mì, sản xuất cồn.Saccharomyces có nghĩa là nấm đường và là loại vi sinh vật được sản xuất với quy mô rất lớn trên thế giới. Phân loại theo đặc tính sử dụng: 3.1. Men lạt: Men dùng cho sản xuất bánh mỳ lạt (Hàm lượng đường thấp). Những chủng men này chỉ sống và phát triển tốt trong môi trường có nồng độ đường thấp (nhỏ hơn 20%)3.2. Men ngọt: Men dùng cho sản xuất bánh mỳ ngọt (Hàm lượng đường cao). Những chủng men này chỉ sống và phát triển tốt trong môi trường có nồng độ đường cao (cao hơn 20%) Phân loại khoa học Giới (regnum): Fungi Ngành (phylum): Ascomycota Phân ngành (subphylum): Saccharomycotina Lớp (class): Saccharomycetes Bộ (ordo): Saccharomycetales Họ (familia): Saccharomycetaceae Chi (genus): Saccharomyces Hình thái, cấu tạo Nấm men thuộc nhóm cơ thể đơn bào Nấm men Saccharomyces thuộc họ Saccharomycetaceae, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm. Nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, từ 5-14 µm, sinh sản bằng cách tạo chồi hay bào tử. Nấm men Saccharomyces gồm những hành phần chủ yếu sau: + Vách tế bào + Màng tế bào chất: nằm sát vách tế bào, có cấu tạo chủ yếu là lipoprotein, giữ vai trò điều hòa vận chuyển các chất dinh dưỡng cho tế bào. + Tế bào chất gồm có mạng lưới nội chất là vị trí của nhiều hệ thống enzyme khác nhau, đảm bảo sự vận chuyển vật chất cho tế bào và các cấu tử khác nhau như bộ máy Golgi, lysosom, không bào (chứa các sản phẩm bị phân cắt, hay chất độc lạ có thể có hại cho tế bào). Trong tế bào chất có nhân chứa thông tin di truyền cho tế bào và các thành phần liên quan trong quá trình sinh tổng hợp và sinh sản của tế bào.Năng lượng cung cấp cho tế bào qua những phản ứng xảy ra trong ty thể cũng nằm trong tế bào chất.Ngoài ra còn có hạt glycogen, hạt mỡ dự trữ chất dinh dưỡng cho tế bào. Đặc điểm sinh hóa Lên men 13 loại đường Đồng hóa 46 nguồn carbon Tính chống chịu với 0,01% hoặc 0,1% cycloheximide Đồng hóa 6 nguồn nitơ: nitrate, nitrite, ethylnamine hydrochloride, L-lyzine, cadaverine dihydrochloride, creatine Sinh trưởng khi thiếu hụt một số vitamin (myo-Inositol, calcium pantothenate, biotin, thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, p-aminobenzoic acid Sinh trưởng tại các nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 37, 420C Sản sinh acid từ glucoza Thủy phân Urê Phân giải Arbutin Phân giải lipid Có năng lực sản sinh sắc tố Sinh trưởng trên môi trường chứa 50% và 60% glucoza Hóa lỏng gelatin Phản ứng với Diazonium Blue B Phát triển trên môi trường chứa chứa acid acetic 1% Sinh khối nấm men dạng thương mại . Men lỏng Nấm men lỏng là một sản phẩm thu nhận được ngay sau khi quá trình lên men hiếu khí kết thúc. Khi sử dụng nấm men lỏng thì vấn đề chất lượng rất được quan tâm do nó rất dễ bị nhiễm những vi sinh vật lạ, bị lẫn các sản phẩm trao đổi chất của nấm men. Nhược điểm rất lớn là khó bảo quản, thời gian sử dụng chỉ nằm trong giới hạn 24 giờ sau khi sản xuất.Chính vì thế, việc sản xuất và sử dụng nấm men lỏng thường được tổ chức như một phân xưởng riêng trong các cơ sở sản xuất. 4.2.Men dạng paste Nấm men paste là khối nấm men thu được sau khi ly tâm nấm men lỏng. Nấm men paste thường có độ ẩm khoảng 70-75%. Nấm men paste thường có hoạt lực nở kém hơn nấm men lỏng do quá trình ly tâm và thời gian kéo dài, nhiều tế bào nấm men chết. Nếu được bảo quản lạnh ở 4-70C, ta có thể sử dụng nấm men paste trong khoảng 10 ngày. Như vậy nếu chuyển nấm men lỏng sang nấm men paste, ta có thể kéo dài thời gian sử dụng và thuận lợi trong việc vận chuyển. Thường sử dụng ở các cơ sở sản xuất bánh mì, liều lượng sử dụng 4-5% so với khối bột lên men. 4.3. Men khô Nấm men khô lại được sản xuất từ nấm men paste. Người ta sấy nấm men paste ở nhiệt độ < 400C hoặc sử dụng phương pháp sấy thăng hoa. Nấm men khô có độ ẩm < 10%, ưu điểm rất lớn là thời gian sử dụng rất lâu và dễ vận chuyển. Điều kiện nuôi cấy nấm men: 5.1.Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất sinh khối nấm men 5.1.1. Nhiệt độ Có ảnh hưởng lớn lên tốc độ tăng trưởng của nấm men. Nhiệt độ thích hợp nhất để nấm men phát triển tốt là 28-30ºC.Trên 43ºC và dưới 28ºC sự sinh sản của nấm men bị chậm hay ngừng lại. 5.1.2. Độ pH của môi trường Độ pH tốt nhất cho sự tăng trưởng của men bánh mì là 4,5 – 5,5; pH= 4: tốc độ tích lũy sinh khối giảm. Nếu pH=3,5 hay pH=3 sẽ làm sự sinh sản của nấm men bị ngừng lại. Mức độ hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzym tham gia vào sự tổng hợp protein, tạo vitamin đều tùy thuộc vào độ pH, pH ngoài 4,5-5,5, làm chất lượng nấm men giảm đi. 5.1.3. Ảnh hưởng của chất hóa học Nguyên liệu chủ yếu để sản xuất men bánh mì là rỉ đường, ammonium sunphat, DAP, MgSO4, axit sunfuric trong các hóa chất này đôi khi có sự hiện diện của những chất làm ức chế sự tăng trưởng của tế bào nấm men. 5.1.4. Ảnh hưởng nồng độ rỉ đường Tốc độ tăng trưởng của tế bào nấm men phụ thuộc vào sự hấp thụ chất dinh dưỡng, trong giới hạn áp suất thẩm thấu của môi trường và nồng độ tế bào. Áp suất thẩm thấu của môi trường tăng khi hàm lượng chất khô như saccharose hay chất hoạt động thẩm thấu như NaCl nhiều. Hiện nay, các nhà máy sản xuất men bánh mì nước ngoài nuôi nấm men trong môi trường có nồng độ saccharose lên đến 5-6% để cải tiến chất lượng men ép và làm men khô. 5.1.5. Ảnh hưởng của cường độ không khí và khuấy trộn lên tốc độ tăng trưởng của nấm men Trong quá trình nuôi nấm men cần thiết giữ cho dịch men liên tục bão hòa oxy hòa tan. Ngừng cung cấp oxy trong 15 giây sẽ gây nên tác dụng “âm”trên hoạt động sống của nấm men. Oxy khí quyển chuyển vào tế bào nấm men qua hai giai đoạn : - Hòa tan oxy đến dạng lỏng. - Hấp thu oxy hòa tan vào tế bào. Về lý thuyết cần 0,761m³ oxy để oxy hóa 1 kg đường, nhưng thực tế chỉ một phần nhỏ oxy bơm vào được nấm men sử dụng, phần còn lại bị mất đi do các quá trình tiếp xúc, nhiệt độ nồng độ, độ nhầy nhớt của môi trường, cường độ khuấy trộn. Kích thước của thiết bị nuôi cấy nấm men là tiền đề cần thiết, ảnh hưởng gián tiếp lên sự tăng trưởng của nấm men vì chiều cao cột dung dịch môi trường càng cao, thời gian khí bơm vào đạt đến bề mặt lâu hơn, và sự hấp thụ oxy được thúc đẩy khi nhiệt độ tăng gần thích hợp cho hoạt tính men. Chiều cao cột dung dịch men tốt nhất là 3m mới có thể đảm bảo hiệu suất thành phẩm và giảm trọng lượng khi tiêu dùng. Rõ ràng là để tăng 1kg nấm men còn tùy thuộc vào chiều cao cột nước và lượng khí tiêu dùng do đó cũng có khác nhau.Trong điều kiện thông khí tốt nhất, tổng số thể tích oxy bơm vào dịch men gấp 7 lần trị số lý thuyết(6). Nếu tốc độ hòa tan oxy cao, có thể thấy bọt khí nhỏ sủi lăn tăn giữa bề mặt tiếp xúc của chất khí và chất lỏng.5.2. Các phương pháp xử lý dịch đường trước khi lên men 5.2.1. Phương pháp hóa học Thường sử dụng axid sulphuric, kết hợp với vôi tôi có khả năng làm đông tụ, kết tủa chất keo, đồng thời acid sulfuric còn liên kết với muối của rỉ đường cạnh tranh với acid hữu cơ, phân hủy protein tạo cơ chất cho nấm men sử dụng để tăng sinh khối. Cách thực hiện:Pha loãng rỉ đường khoảng 0,73m3 nước / 1 tấn rỉ đường, trộn đều, thêm cloruacanxi 0,9 kg/1 tấn rỉ đường, khuấy trộn trong 30 phút sau đó để yên trong 30 phút. Thêm vào 6 lit acid sulfuric / 1 tấn rỉ đường, khuấy tiếp tục 30 phút nữa, sau đó để lắng 6- 12 h. Dùng bơm hút dịch trong bên trên, loại bỏ cặn.Pha loãng rỉ đường như trên. Thêm 1% vôi tôi tính theo nồng độ rỉ đường , khuấy đều, cho sôi 30 phút. Sau đó để lắng trong 7h, loại bỏ lớp màu đen. 5.2.2. Phương pháp cơ học  Dùng máy ly tâm để loại chất bẩn, chất keo có ưu điểm hơn so với phương pháp hóa học về phương diện kinh tế và thời gian, giảm thất thóat so với phương pháp hóa học từ 2% còn 0,14%. Trước khi ly tâm, pha loãng rỉ đường với nước theo tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 tùy thuộc vào thành phần muối canxi trong rỉ đường. Nếu lượng muối canxi trong rỉ đường <0,5% thì pha loãng 1:1, nếu là 0,6% thì pha loãng 1:1 , nếu là 0,6% thì pha loãng 1:2, hơn 1% thì pha loãng 1:4.5.3. Cácphương pháp bảo quản men giống 5.3.1. Phương pháp 1– Giữ giống thuần khiết trên môi trường thạch nghiêng, cấy chuyền sau 12- 24 ngày sau khi đã hoạt hóa sơ bộ trên môi trường lỏng.– Môi trường thạch nghiêng, nước malt đường hóa (có 12% đường khô) 49,5%; dịch men tự phân (khoảng 9% chất khô) 1% và thạch 2%.– Môi trường lỏng để hoạt hóa nấm men người ta dùng dịch malt không có hublon, lượng chất khô 12%.– Nếu không cấy chuyền và hoạt hóa kịp thời thì hoạt lực maltaza và khả năng thích nghi với rỉ đường giảm hoặc trên bề mặt thạch các tế bào nấm men sinh bào tử rồi kết hợp với nhau làm thay đổi tính chất của giống. 5.3.2. Phương pháp 2– Giữ tế bào men trong dịch saccharose 30%. Dịch đường được cho vào bình và thanh trùng.– Cấy giống từ ống thạch nghi êng đã nuôi 2 ngày và giữ ở to bình thường. Trong điều kiện này nấm men hầu như không phát triển, không lên men.– Khi sử dụng có thể dùng que cấy hoặc pipet vô trùng lấy dịch giống cấy chuyền vào môi trường lỏng để hoạt hóa.– Sau 24-36h giữ ở nhiệt độ 3000C dịch đường lên men và cấy chuyền tiếp sang môi trường thạch hoặc các môi trường nhân giống. 5.3.3. Phương pháp 3– Bảo quản giống dưới lớp dầu vaselin hoặc parafin. Giống cấy trên môi trường thạch nghiêng 2-3 ngày được đổ phủ lên bề mặt một lớp vaselin vô trùng.– Người ta thường dùng vaselin có tỉ trọng 0,8 - 0,9 đã được đun nóng ở 15 0C để đuổi nước có trong dầu, rồi hấp thanh trùng. Lớp dầu trên bề mặt môi trường không quá 1cm. Ống giống có vaselin có thể để ở to trong phòng nhưng tốt hơn cả là giữ ở 4-600C. 5.3.4. Phương pháp 4– Giữ giống ở điều kiện đông khô.– Dịch huyền phù giống được đựng trong ống nghiệm – ampul ở trạng thái đông lạnh (- 4000C), sấy khô dưới điều kiện lạnh và chân không cao tới độ ẩm còn 1,5-2,6 %.– Gắn miệng ampul dưới chân không và vô trùng.– Thời gian bảo quản tới 3 năm không phải cấy chuyền, một vài chủng men được bảo quản đông khô có tỉ lệ tế bào sống thấp. Các nguyên liệu chứa sacaroza (rỉ đường..) là dạng nguyên liệu lý tưởng nhất đến sản xuất protein đơn bào, vì các nguyên liệu này chứa nhiều yếu tố kích thích sinh trưởng, khí, biotin và sản phẩm protein thu được hầu như sạch, không độc.Rỉ đường được dùng làm các cơ chất cho nhiều quá trình lên men vì:− Giá thành rẻ hơn các nguyên liệu chứa đường khác.−Ngoài đường sacaroza, rỉ đường còn chứa một số chất vô cơ, hữu cơ vàvitamin có giá trị. Sản xuất men khô Quy trình sản xuất nấm men từ rỉ đường: Rỉ đường Xử lý Pha loãng Nấm men Thanh trùng Nhân giống Môi trường dinh dưỡng Lên men Ly tâm Sinh khối Thành phẩm Sấy khô Thuyết minh Quy trình công nghệ sản xuất sinh khối nấm men bao gồm các giai đoạn chính sau: Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng và nhân giống Quá trình nuôi cấy nấm men Thu nhận sinh khối Sấy khô 6.1.Chuẩn bị môi trường và nhân giống Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình lên men Loại bỏ tạp chất, làm trong rỉ đường Rỉ đường: được dùng làm cơ chất cho nhiều quá trình lên men, nguyên nhân chính là do giá thành của rỉ đường rẻ hơn so với các nguyên liệu chứa đường khác. Ngoài saccharose trong rỉ đường còn chứa một số chất vô cơ, hữu cơ và vitamin có giá trị.Ngày nay, cả rỉ đường củ cải lẫn rỉ đường mía thường được gọi là sản phẩm phụ hơn là một chất thải. Sản lượng trung bình của rỉ đường chứa khoảng 50% saccharose dao động từ 3,5 đến 4,5 tấn trên 100 tấn củ cải gốc. Rỉ đường trước khi được dùng để nuôi nấm men cần được xử lý để loại bỏ chất keo, chất lơ lửng và một số chất có hại cho sự tăng trưởng của nấm men. Hệ keo có trong mật rỉ được hình thành bởi protein và pectin.Hệ keo thường tạo ra độ nhớt cao và làm cản trở quá trình trao đổi chất của nấm men.Nếu hệ keo không bị phá hủy sẽ gây ra hiện tượng thoái hóa, tế bào sẽ phát triển và sinh sản kém. Hiệu suất thu hồi sinh khối sẽ thấp. Nếu khôngloại bỏ chất keo nói trên sản phẩm sinh khối nấm men thu nhận được sẽ bám đầy chất keo này do đó có màu vàng đậm đặc đặc trưng của mật rỉ, không phải màu tự nhiên của nấm men. Vì vậy, cần loại bỏ các chất tạo màu trong mật rỉ trước khi làm môi trường nuôi cấy. Các biến đổi Vật lý: khối lượng riêng của dung dịch giảm, sự thay đổi màu Hóa học: các hợp chất keo đông tụ Sinh học: mật độ vi sinh vật giảm Thực hiện loại bỏ chất keo trong rỉ đường: có thể làm bằng 2 phương pháp Phương pháp hóa học: + Thường sử dụng acid sulfuric, kết hợp với vôi tôi có khả năng làm đông tụ, kết tủa chất keo, đồng thời acid sulfuric còn liên kết với muối của rỉ đường cạnh tranh với acid hữu cơ, phân hủy protein tạo cơ chất cho nấm men sử dụng để tăng sinh khối. + Cách thực hiện: Pha loãng rỉ đường khoảng 0,73m3 nước/tấn rỉ đường, trộn đều, thêm cloruacanxi 0,9kg/tấn rỉ đường, khuấy trộn trong 30 phút sau đó để yên trong 30 phút. Thêm vào 6 lit acid sulfuric/tấn rỉ đường, khuấy tiếp tục 30 phút nữa, sau đó để lắng 6-12h. Dùng bơm hút dịch trong lên trên, loại bỏ cặn. Phương pháp cơ học Dùng máy ly tâm để loại chất bẩn, chất keo có ưu điểm hơn so với phương pháp hóa học về phương diện kinh tế và thời gian, giảm thất thoát so với phương pháp hóa học từ 2% còn 0,14%. Trước khi ly tâm, pha loãng rỉ đường với nước theo tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 tùy thuộc vào thành phần muối canxi trong rỉ đường. Nếu lượng muối canxi trong rỉ đường < 0.5% thì pha loãng 1:1, nếu là 0,6% thì pha loãng 1:2, hơn 1% thì pha loãng 1:4. Pha loãng dịch lên men: Ta tiến hành pha loãng thành nồng độ 28-30% chất khô. Lọc dịch: sử dụng thiết bị lọc khung bản. Bổ sung dinh dưỡng cho nấm men Các hóa chất sử dụng gồm: Nguồn hydrat carbon: 12-15% chất khô tính trên rỉ đường Ammonium sulfat: từ 0,1-0,3% Ure: 0,1-0,15% DAP: 0,1% hay acid photphoric 0,06%. DAP rất khó hòa tan trong nước do khi sản xuất nó có chứa một số chất phụ gia không tan. Vì vậy, trước khi sử dụng phải hòa tan vào nước nóng theo tỷ lệ 1:5-6 (nước) trước. Dung dịch được trộn lẫn với lượng acid phosphoric đã tính toán, pha loãng bằng nước theo tỷ lệ 1:5. Magie sulfat 0,05% Chú ý: phải làm nguội dịch rỉ trước khi bổ sung hóa chất Điều chỉnh pH dung dịch: điều chỉnh pH = 4-4,5 bằng acid sulfuric loãng với nồng độ pha trước Phân phối vào dụng cụ Thanh trùng: Mục đích: tiêu diệt vi sinh vật gây hại, chuẩn bị cho quá trình lên men Tiến hành: thanh trùng ở nhiệt độ 80-900C trong vòng 20 phút Các biến đổi: Vật lý: nhiệt độ tăng Sinh học: tiêu diệt vi sinh vật nhiễm Hóa học: có thể xảy ra phản ứng Maillard Hóa lý: độ nhớt dung dịch giảm Hóa sinh: các enzyme bị biến tính bất thuận nghịch Làm nguội Mục đích: Chuẩn bị và hạ nhiệt độ của canh trường để chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy. Các biến đổi trong quá trình: Vật lý: nhiệt độ giảm Hóa lý: độ nhớt dung dịch tăng Nhiệt độ môi trường dinh dưỡng sau quá trình làm lạnh: 28-320C Quá trình nhân giống Mục đích Là quá trình tăng thể tích dịch nấm men sau mỗi chu kỳ cho tới khi đủ số lượng phục vụ cho sản xuất Biến đổi chủ yếu Quá trình tăng nhanh sinh khối. Các phương pháp tiến hành nhân giống Quá trình nhân giống trong phòng thí nghiệm và nhân giống trong sản xuất cần tạo điều kiện cho giống thuần chủng sinh sản nhanh, không bị tạp nhiễm với các dụng cụ và thiết bị, phục vụ cho nuôi cấy vô khuẩn Nuôi cấy nhân giống đầu tiên được thực hiện trong phòng thí nghiệm: Giống được nuôi cấy trên ống nghiệm thạch nghiêng rồi cấy chuyền vào ống nghiệm 20ml chứa 10ml môi trường nuôi cấy đã được vô trùng. Tiến hành nuôi ở 28-320C trong vòng 16-20h. Sau khoảng thời gian trên thì ta lần lượt cấy vào bình tam giác và trong các thiết bị lớn hơn, tỷ lệ giống chuyển cấp là 1:10 cho đến khi được 100 lit thì ta chuyển sang giai đoạn nhân giống ở chế độ phân xưởng. Nhân giống trong giai đoạn phân xưởng: Tiến hành nhân giống trong thiết bị nuôi cấy cũng ở nhiệt độ và thời gian như trên, sau đó ta tiếp tục nhân giống vào những thiết bị lớn hơn với tỷ lệ mỗi cấp chuyển giống là 1:10 Quy trình nhân giống bán liên tục Dịch sau khi đã thanh trùng và làm nguội xuống nhiệt độ lên men là 28-300C được bơm vào thùng nuôi cấy. Nấm men từ thùng men giống được tháo xuống sao cho thể tích dịch nuôi cấy và men giống chiếm 50% thể tích thùng. Ta cho nấm men lên men trong khoảng 16-18h. Trong quá trình nuôi cấy nhiệt độ được điều chỉnh bằng cách dội nước lạnh bên ngoài thùng hoặc ta sử dụng các thùng nuôi cấy có hỗ trợ thêm thiết bị điều chỉnh nhiệt độ. Song song với quá trình men giống phát triển trong thùng nhân giống ta tiếp tục cho dịch rỉ vào thùng xử lý. Sau 16-18h ta cho dịch rỉ thêm vào thùng nhân giống nấm men rồi trộn đều. Cho lên men thêm khoảng 2-3h. Tháo 50% lượng men ở thùng nhân giống xuống thùng nuôi cấy. Tiến hành lặp lại các bước như trên. Nhân giống liên tục Trong sản xuất công nghiệp người ta thường dùng phương pháp nuôi cấy theo dòng liên tục. Hàm lượng oxi hòa tan là nhân tố giới hạn trong thành phần tối ưu của môi trường và điều kiện thuận lợi cho nuôi cấy. Tốc độ sử dụng oxi của nấm men chỉ phụ thuộc vào hoạt tính của chúng và thành phần của môi trường. Hiệu suất của thiết bị nuôi cấy phụ thuộc vào hệ số hấp phụ của oxi, mức độ sử dụng không khí, phụ thuộc vào nhu cầu riêng về oxi để tổng hợp 1 đơn vị sinh khối từ từng loại nguyên liệu và phụ thuộc vào hệ số tổng hợp. Để xác định chế độ làm việc tối ưu của một thiết bị, người ta xác định mức độ sử dụng oxi và theo đó sẽ chọ được tốc dộ pha loãng, thành phần tương ứng của môi trường và tăng cao năng suất sinh khối. Các tế bào càng được giữ lâu trong thiết bị thì hoạt tính của giống càng giảm và năng suất sinh khối càng thấp. Vì vậy khi tiến hành nuôi lên men theo phương pháp bán liên tục thì sẽ cho hiệu quả kinh tế cao: khi đạt lượng sinh khối có trong dịch nuôi cấy sẽ lấy dần ra rồi cho thêm môi trường mới vào nồi lên men có hàm lượng khoảng 1-2%. Sử dụng giống nấm men có hoạt tính thấp sẽ làm giảm hiệu suất thu hồi sinh khối. Quá trình nuôi cấy nấm men (quá trình lên men dịch rỉ) Mục đích: tăng sinh khối tế bào nấm men đến mức như mong muốn. Nguyên tắc: Sinh khối nấm men có thể được thu nhận bằng 2 cách: nuôi cấy kỵ khí và nuôi cấy hiếu khí. Trong điều kiện nuôi cấy hiếu khí sản phẩm chủ yếu là sinh khối, còn CO2 là sản phẩm thứ cấp. Trong nuôi cấy kỵ khí thu được sinh khối ít hơn (chỉ khoảng 1/4 so với hiếu khí) còn lại CO2 và một số sản phẩm trao đổi chất của tế bào nấm men, quan trọng nhất là ethanol. Vì thế, trong sản xuất sinh khối nấm men, để đạt được hiệu xuất thu hồi sinh khối cao cần phải tạo điều kiện hiếu khí để đảm bảo cho nấm men sinh trưởng và tăng sinh khối tốt đồng thời tránh tiêu hao nhiều chất dinh dưỡng cần thiết trong quá trình nuôi. Các biến đổi trong quá trình nuôi cấy Các biến đổi sinh học Các giai đoạn của nấm men Ở giai đoạn tiềm phát: Nấm men cần phải có thời gian thích nghi với điều kiện mới.Ở giai đoạn này việc tạo thành các acid amin, các peptid và các acid nucleic xảy ra nhanh hơn các quá trình khác.Thời gian cũng thể kéo dài cũng có thể ngắn tùy thuộc vào từng chủng nấm men. Giai đoạn này thường khoảng 0,5-1 giờ và chỉ cần cung cấp lượng không khí khoảng 50m3/giờ/m3 môi trường là đủ. Ở giai đoạn tăng trưởng: Nấm men tiến hành các quá trình trao đổi chất rất mạnh, khối lượng nấm men trong thiết bị tăng lên rõ rệt.Việc tổng hợp các enzyme được xúc tiến nhanh.Hàm lượng RNA được tổng hợp nhiều nhất. Giai đoạn này thường kéo dài khoảng 7-14 giờ va cũng là giai đoạn nấm men cần nhiều oxy nhất, do đó lượng oxy cung cấp, do đó lượng oxy cung cấp phải gấp đôi giai đoạn đầu tiên, khoảng 80- 100m3/giờ/m3 môi trường. Giai đoạn cân bằng. Giai đoạn này có nhiều thay đổi quan trọng.Lượng tế bào mới sinh gần bằng tế bào chết. Các quá trình trao đổi chất giảm mạnh do nhu cầu oxy không nhiều. Giai đoạn này kéo dài khoảng 1-2 giờ và ta phải giảm lượng không khí cấp vào môi trường.Lượng không khí cấp vào môi trường này từ 20-50 m3/giờ/m3 môi trường. Các biến đổi vật lý Trong quá trình nuôi cấy, quá trình trao đổi chất của nấm men xảy ra liên tục làm cho nhiệt độ canh trường tăng lên. Các biến đổi hóa học Hàm lượng chất khô (chủ yếu là đường saccharose): giảm dần theo thời gian do quá trình hô hấp hiếu khí và quá trình sinh tổng hợp vật chất tế bào của nấm men. pH: sự thay đổi theo 2 cơ chế chính: + Sự sinh tổng hợp các acid hữu cơ (các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi + Cơ chế đồng vận chuyển ion H+ trong và ngoài tế bào nấm men trong quá trình trao đổi chất Các biến đổi hóa lý Sự hòa tan oxy Vì nấm men chỉ sử dụng oxy ở dạng hòa tan nên tốc độ hòa tan của oxy vào dung dịch bằng tốc độ sử dụng oxy của tế bào nấm men thì sinh khối của tế bào nấm men đạt cực đại. Độ hòa tan của oxy phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, tốc độ khuấy trộn, lưu lượng sục khí, sự tác động của các chất hoạt động bề mặt, các chất phá bọt. Sự hình thành bọt Trong quá trình nuôi cấy, do sục khí liên tục và nấm men hô hấp giải phóng một lượng đáng kể CO2 nên làm tăng thể tích bồn nuôi cấy gây hiện tượng trào bọt trên bề mặt. Vì vậy, dung dịch nuôi cấy rất dễ bị tạp nhiễm. Do đó dung tích sử dụng thiết bị phải nằm trong khoảng 0,7- 0,8 đồng thời có thể sử dụng chất phá bọt (keo ưa nước, mỡ cá, hỗn hợp xà phòng hóa, acid oleic, dầu silicone…) Các biến đổi hóa sinh Các biến đổi hóa sinh phần lớn xảy ra bên trong cộng với sự trao đổi chất của tế bào nấm men.Biến đổi đầu tiên quan trọng nhất là sự chuyển hóa đường sacharose thành D-glucose và D-fructose dưới xúc tác của enzyme invertase được tổng hợp bởi nấm men. Sau đó glucose tiếp tục tham gia các chuỗi phản ứng hóa sinh trong các chu trình sinh hóa để tổng hợp vật chất tế bào và năng lượng cho nấm men sinh trưởng. Trong giai đoạn này, các dạng tế bào con, tế bào trẻ vừa mới tạo chồi, tế bòa thành thục.Tỉ số các dạng này khác nhau tùy thuộc quy trình kỹ thuật và môi trường hoạt động lúc đầu.Số tế bào thành thục càng cao men thành phẩm càng giữ được tính chất của nó lâu hơn. Kiểm tra Nhuộm tế bào với xanh methylen: nếu tế bào già, chết sẽ bắt đầu từ màu xanh đến xanh đậm, trong khi tế bào trẻ không bắt màu. Vòng tuần hoàn sau 200 lít có thể lên đến 10 lần phụ thuộc vào chất lượng men mẹ, độ sạch của môi trường, nguyên liệu, điều kiện vệ sinh của cơ sở mỗi vòng từ 6 đến 8 giờ. Ở các nước phát triển giai đoạn nuôi men mẹ bà men thương phẩm được thực hiện trong thiết bị lên men kín, khá tối ưu về điều kiện thông khí, điều kiện kiểm tra quá trình được tự động hóa, do đó kịp thới xử lý những sơ xót về kỹ thuật. Quá trình men lắng Mục đích: chuẩn bị cho quá trình ly tâm tách rửa. Điều kiện lắng: Giảm nhiệt độ đến 270C. Giảm lượng không khí 40- 60% so với giai đoạn nuôi chính. Thời gian lắng từ 1,5- 2 giờ. Thiết bị: quá trình men lắng xảy ra trong tiết bị lên men. Thông số công nghệ: giảm nhiệt độ đến 270C, giảm lượng không khí 40-60% so với giai đoạn nuôi cấy chính, thời gian lắng từ 1,5-2 giờ. Thu nhận sinh khối nấm men Mục đích: khai thác và hoàn thiện. Về lý thuyết Từ 1g C6H12O6 có thể thu được 0,5g sinh khối nấm men khô (theo nghiên cứu của A.J.Forage): C6H12O6 (1g) + O2 (0,4g) ® CO2 (0,67g) + H2O (0,27g) + NH3 (0,05g) Q (1,25 kcal) + sinh khối nấm men khô 0,5g Hoặc theo nghiên cứu C.L Cooorey C6H12O6 (2kg) + O2 (0,7g) ® CO2 (1,1g) + H2O (0,7g) + sinh khối nấm men khô (1kg) + N, P, K, Mg, S (0,1kg) Phương pháp Bọt và sinh khối tràn ra ngoài trong quá trình lên men được tách trước tiên theo phương pháp tạo thành bọt cùng với sinh khối tạo ra ngoài rồi đưa đi ly tâm tách bọt và sinh khối trào ra ngoài được thu gom lại đi đi xử lý bằng phương pháp tuyển nổi (flotation) rồi đưa đi ly tâm qua các máy ly tâm tách (Seprator), cô đặc chân không. Nấm men thường có tỷ trọng lớn hơn dung dịch nấm men (tỷ trọng của nấm men thường nằm trong khoảng 1,13- 1,14 còn dịch nuôi cấy không chứa nấm men là 1,01- 1,03). Do vậy tế bào nấm men sẽ chịu lực ly tâm lớn hơn và được tách ra khỏi dung dịch nuôi cấy. Sấy khô Mục đích: Bảo quản Huyền phù sinh khối nấm men sau quá trình cô đặc có nồng độ chất khô 40%.Quá trình sấy nhằm mục đích tách ẩm ra khỏi men, đưa độ ẩm của chúng về dưới 8% để kéo dài thời gian bảo quản của nấm men. Đồng thời, quá trình sấy cũng làm đa dạng hóa sản phẩm nhằm thuận tiện cho quá trình vận chuyển và sử dụng Các biến đổi trong quá trình sấy Vật lý: hàm ẩm giảm nhanh chóng Hóa lý: sự bay hơi nước và các chất dễ bay hơi dưới tác động của nhiệt độ cao. Có sự chuyển pha từ dạng lỏng (dịch lên men) sang dạng rắn. Hóa sinh: một số enzyme bị biến tính Sinh học: tế bào nấm men và một số vi khuẩn bị tiêu diệt. tuy nhiên, do thời gian sấy rất ngắn nên biến đổi về hóa sinh và sinh học không lớn lắm. Chỉ tiêu chất lượng thành phẩm Tiêu chuẩn của sinh khối nấm men thương phẩm dùng cho chăn nuôi như sau: Chỉ tiêu vi sinh: Tổng vi sinh vật hiếu khí không quá 7500 cfu/kg men khô Vi khuẩn thương hàn: không được có Nấm mốc: không quá 50 cfu/kg men khô Chỉ tiêu hóa lý: Độ ẩm: không quá 8% Protein: không nhỏ hơn 45% (tính theo chất khô), với men ở loại khô là 56% Lizin, metionin và tryptophan tương ứng không dưới 0,5; 1,4; 1,1% của protein khô Độ tiêu hóa của protein không dưới 75-80% Giá trị sinh học của protein khô không dưới 55% Các vitamin B1, B2, B5 tương ứng không dưới 10, 30 và 300 mg/kg.hàm lượng tro: đối với men rượu từ rỉ đường không quá 14% men khô tuyệt đối, còn men rượu từ bã rượu ngũ cốc thì không quá 10%. Tạp chất kim loại sau khi tách sắt có thể còn có trong chế phẩm men ở dạng các mẫu vảy nhỏ là kim loại bắt từ hoặc không bắt từ Những tạp chất kim loại là thể mảnh kim loại không bắt từ phải có kích thước mảnh, miếng kim loại không quá 2mm. hàm lượng kim loại mảnh có kích thước < 2mm (mg/ 1kg men khô): < 20 Các kim loại từ tính: không quá 0,003% (chì và asen không quá 5mg/kg) 7. Sản xuất men nước Men nước được sản xuất phục vụ cho nhu cầu sử dụng tại chỗ Ưu điểm: quá trình sản xuất đơn giản, giá thành hạ, có thể cho chất lượng tốt so với men ép và men khô Nhược điểm: không bảo quản được lâu, vận chuyển khó khăn Nguyên liệu dùng sản xuất men nước là bột, thóc mầm hoặc chế phẩm mốc có hoạt lực amylase, vi khuẩn lactic (Lactobacterium delbrucki) và nấm men Saccharomyces cerevisiae. Vi khuẩn Lactobacterium delbrucki dùng acid hóa và cải thiện thành phần dinh dưỡng của môi trường cho nuôi cấy nấm men ở giai đoạn sau. Đây là giống vi khuẩn lactic lên men đồng dạng cho sản phẩm là acid lactic. Dịch bột thủy phân bằng thóc hoặc chế phẩm mốc: trộn bột: nước theo tỷ lệ 1:3 à nấu chin à làm nguội 48-500C à thêm 3% thóc mầm hoặc 0,8-1% chế phẩm mốc Asp.Awamori hoặc Asp.Oryzae giữ 8-14h à dịch bột được đường hóa và đông thời tích tụ acid đến khi môi trường đạt 11-120C acid thì có thể đưa vào nuôi cấy nấm men. Giống men: Saccharomyces cerevisiae cấy chuyển trên môi trường malt (ống nghiệm) để ở 28-300C trong 6-12h à nhân giống, cấy vào 3 bình tam giác chứa 100ml nước malt (mạch nha) ở nhiệt độ 300C trong 24h à chuyển sang bình 5-6 lit. Giống men sau khi nhân giống chuyển vào dịch bột thủy phân đã acid hóa và làm nguội đến 28-300C, giữ ở nhiệt độ này 14-15h không sục khí hoặc sục khí gián đoạn kết hợp khuấy. Ở nhiệt độ này, vi khuẩn lactic ưa nhiệt ngừng phát triển và ngừng tích tụ acid. Nấm men tiêu hóa đường và acid lactic để tăng sinh khối đồng thời lên men rượu. Môi trường lên men có nồng độ acid cao tạo điều kịện thuận lợi cho nấm men phát triển và hạn chế sự phát triển vi sinh vật tạp nhiễm. Người ta có thể sản xuất nấm men theo phương pháp này mà không cần phải vô trùng. Từ men nước có thể ly tâm thu men dạng sữa hoặc dạng nhão và đem đóng thành bánh. 8.Thiết bị nuôi cấy nấm men: 8.1.Thiết bị thanh trùng dạng bảng mỏng Bộ phận chính của thiết bị là những tấm bản hình chữ nhật với độ dày rất mỏng và được làm bằng thép được làm bằng thép không gỉ. Mỗi tấm bản sẽ có bốn lổ tại bốn góc và hệ thống các đường rãnh trên khắp bề mặt để tạo ra sự chảy rối và tăng diện tích truyền nhiệt. −Nguyên tắc hoạt động:Môi trường nuôi cấy được bơm vào thiết bị trao đổi nhiệt bản mỏng cùng với dòng nóng. −Thông số công nghệ:Nhiệt độ thanh trùng: 95 – 980CThời gian thanh trùng: 30 phút8.2. Thiết bị lên menĐặc tính kỹ thuật của thiết bị:Thể tích của thiết bị lên men: 200 m3Hệ số chứa đầy: 0,6Áp suất làm việc: 0,02 - 0,03 MpaNhiệt độ hoạt động: 28 – 320CMôi trường pH: 4,0 - 4.2 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Đức Lượng_Công nghệ vi sinh vật 2,3_Vi sinh vật công nghiệp NXB ĐHQG Tp. HCM. Vi sinh vật học thực phẩm_Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm Tp.HCM.