Sàng lọc và kiểm tra cây ngô chuyển gen

SÀNG LỌC VÀ KIỂM TRA CÂY NGÔ CHUYỂN GEN TS. Phạm Thị Lý Thu Viện Di truyền nông nghiệp Lây nhiễm vi khuẩn với phôi và nuôi cộng sinh Nuôi phục hồi phôi biến nạp Phân tích cây chuyển gen Khi cây chuyển gen tái sinh trồng trên đất xuất hiện khoảng 2-3 lá mới, tiến hành thu mẫu lá để thực hiện các phân tích PCR Chuẩn bị dịch vi khuẩn QUY TRÌNH TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN Tạo và chọn lọc mô sẹo chuyển gen Tạo chồi và Chọn lọc chồi chuyển gen Tái sinh và Chọn lọc cây chuyển gen hoàn chỉnh Chuyển gen Kiểm tra, phân tích cây chuyển gen Sàng lọc Quá trình Chuyển Gen đã được thực hiện chưa? Tạo và chọn lọc mô sẹo chuyển gen Tác nhân chọn lọc: kháng sinh / PPT / mannose Tạo và chọn lọc mô sẹo chuyển gen NGUYÊN TẮC So với các tế bào Eukaryot khác, tế bào thực vật có thêm lớp thành xenlulose vững chắc ở bên ngoài. Do đó, việc tách ADN tổng số từ thực vật gặp phải những phức tạp và khó khăn. Có rất nhiều phương pháp tách chiết, tinh sạch ADN khác nhau và cũng thành công trên nhiều đối tượng thực vật. Nguyên tắc chung của các phương pháp này là: Sử dụng các biện pháp cơ học (nghiền mô trong đá khô, nitơ lỏng,... bằng chày cối sứ) để phá vỡ thành tế bào thực vật, giải phóng các thành phần bên trong. Sử dụng chất tẩy (CTAB) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng ADN. Sử dụng các hoá chất (phổ biến là EDTA) để bảo vệ ADN khỏi các nuclease nội bào. Sử dụng các hoá chất (chloroform, isoamyl alcohol, phenol,...) để loại protein và các tạp chất ra khỏi dung dịch chứa ADN. Thu hồi ADN bằng tủa (trong cồn hay isopropanol) và ly tâm. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ QUY TRÌNH Bước 1: Ủ sẵn 5ml đệm chiết ở 600C trong bình ổn nhiệt (30 phút). Thành phần đệm chiết: CTAB 2% (W/V) Mercaptoetanol 0,2% (V/V) EDTA 0,5M pH8. Tris HCl, 1M pH7,5. NaCl 5M. Bước 2: Nghiền 0,75 (g) mô lá thực vật bằng Nitơ lỏng (bằng chày thuỷ tinh hoặc sứ...) cho đến khi thành dạng bột mịn. Bước 3: Hoà tan mẫu đang nghiền trong đệm chiết, nghiền thêm một chút để tạo dạng đồng chất. Bước 4: Ủ mẫu ở 650C trong 30 phút (lắc đều, đảo nhẹ 3-5 lần) trong quá trình ủ. Bước 5: Thêm một thể tích dung dịch bao gồm chloroform và isoamyl alcohol (C:I) theo tỷ lệ 24:1, lắc đều. Bước 6: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Bước 7: Chuyển pha trên sang ống sạch và thêm một thể tích dung dịch C:I, lắc đều. Bước 8: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Bước 9: Chuyển pha trên sang ống sạch. Thêm 2/3 thể tích EtOH 100% có bổ sung CH3COONa, 3M (pH = 5,2) hoặc tốt hợp là thêm 2/3 thể tích isopropanol. Bước 10: Để mẫu ở -200C từ 3 giờ trở lên và ly tâm 13.000 vòng/phút, trong 10 phút ở 40C thu tủa. Bước 11: Rửa tủa bằng EtOH 80%, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C. Bước 12: Để khô không khí, hoà tan trong dung dịch TE 0,1X. Bước 13: Thêm RNase A để đạt nồng độ cuối cùng là 100mg/ml, ủ 370C trong 1 giờ. ADN tích điện âm. Trong điện trường sẽ di chuyển về cực dương. Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước và độ tích điện. ADN thường được điện di trên hai loại gel: agarose và acrylamid (gel acrylamid có độ phân giải cao hơn). ĐIỆN DI ADN Nồng độ agarose thường dùng phụ thuộc vào kích thước sản phẩm ADN cần phân giải (dao động từ 0,5% - 3%). Chuẩn bị: Agarose dạng bột hoà trong dung dịch điện di TBE (Tris Borat EDTA) hoặc TAE (Tris Acetat EDTA). Đun nóng, đổ vào khuôn. Đệm điện di: TAE thường gây kiềm hoá cực dương, axit hoá cực âm sau mỗi lần điện di cần trộn. Điện thế và thời gian điện di: Là hai yếu tố liên quan lẫn nhau (điện di ở điện thế thấp thì thời gian dài hơn). Tuỳ thuộc chiều dài 2 điện cực để tính hiệu điện thế. Không nên chạy quá 5V/cm (chiều dài 2 điện cực 30cm thì điện thế  150V). Độ phân giải kém khi hiệu điện thế cao. Băng ADN ADN hấp phụ tia 260nm, liên kết nhuộm hấp phụ 300 - 360 nm ==> huỳnh quang tia 590nm (đỏ da cam) ==> nhìn và chụp ảnh được. Trong gel polyacrilamide: gel được ngâm trong dung dịch nitrat bạc, ADN sẽ tương tác khi bổ sung formaldehyt ở pH kiềm, ion bạc chuyển thành nguyên tử bạc (Ag) tạo kết tụ ==> hạt bạc mầu xám ==> phát hiện băng ADN. Bổ sung chất phụ gia Potassium permanganet, potassium frrriayamid ==> tăng độ nét. Phương pháp định tính, định lượng ADN Phương pháp đo quang phổ (OD260nm) A260nm=1,0 OD=50 microg/ml ADN sợi đôi A260nm=1,0 OD=33 microg/ml ADN sợi đơn A260nm=1,0 OD=40 microg/ml ARN Phương pháp điện di Bản chất của kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp, phản ứng chuỗi nhờ polymerase) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn ADN với tốc độ nhanh chưa từng thấy và độ chính xác cao được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt (máy PCR). Kỹ thuật PCR được Karry Mullis phát minh 1985 Phân tích PCR (Polymerase Chain Reaction) Các yêu cầu cần thiết cho PCR 2 mồi tổng hợp oligonucleotide (20-30 nucleotide) có trình tự bổ sung với trình tự của đoạn ADN cần nhân dòng ADN khuôn (đoạn ADN cần nhân dòng) ADN polymerase chịu nhiệt (Taq-polymerase) 4 loại nucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP ) Mg++, dung dịch đệm thích hợp, pH,... Khuôn ADN được biến đổi thành 2 sợi đơn (94 0C, 5 phút) Gắn primer vào đầu đoạn ADN (55 0C, 30 giây) Tổng hợp chuỗi ADN mới (65-75 0C, 2-5 phút) Biến đổi để tách sợi ADN mới thành 2 đơn (94 0C, 30 giây) Chu trình PCR Các yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu quả PCR Độ tinh sạch của ADN khuôn Hoạt động của Enzym ADN polymerase (Tỷ lệ nhầm lẫn của Taq - polymerase 10-6) Nồng độ các loại nucleotid Nồng độ các dung dịch đệm, Mg++, ... Ưu điểm nổi bật của kỹ thuật PCR Có thể sử dụng trực tiếp ADN vừa tách chiết, không cần tinh sạch. Đoạn ADN làm khuôn không cần tách chính xác, tính đặc hiệu của phản ứng do các oligo nucleotid làm mồi quyết định.  Lượng ADN dùng làm khuôn ít (1g) Tốc độ nhân dòng cao: N=2(A-2) +A số chu kỳ PCR +N số đoạn ADN nhân được 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3 BƯỚC CƠ BẢN CỦA PCR Khởi đầu : Primer 1 : Primer 2 Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Chu kỳ 3 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ Biến tính Gắn mồi Kéo dài chuỗi Nồng độ các thành phần chính của PCR sử dụng Taq ADN polymerase  10-50 mM Tris-HCl, pH 7,5-9,0  6-50 mM KCl  1,5-5 mM MgCl2 hoặc MgSO4  0,2-0.4 mM dNTPs mỗi loại  0,1-1mM primer mỗi loại  1-1,25 unit Taq ADN pol 102-105 copy của ADN khuôn Tính nghiêm ngặt (stringency) của PCR  Nhiệt độ gắn mồi (thấp hơn Tm khoảng 2-4oC)  Nồng độ Mg2+ (1,5-5 mM) Kỹ thuật lai ADN (Southern hybridization) (mang tên Southern E.M. phát minh ra) Nguyên tắc: Dựa vào sự ghép cặp Watson-Crick đặc hiệu giữa hai đoạn ADN có trình tự bổ sung để nhận biết các (mẫu) ADN đích. Nếu một oligo có chiều dài n nucleotit thì khả năng lai đặc hiệu (trong điều kiện khắt khe) là A/4n Trong đó A là kích thước của hệ gen đối tượng cần lai tính bằng bp Các bước tiến hành: 1. Thiết kế mẫu dò (oligo đặc hiệu/suy biến, số mẫu, độ dài) 2. Lựa chọn phương pháp đánh đấu (phóng xạ hay huỳnh quang) 3. Tiến hành phép lai cho mục đích sàng lọc hay nhận dạng Các bước lai ADN a) Phân tách các đoạn ADN bằng điện di trên gel agarose b) Làm biến tính ADN bằng kiềm và chuyển hay thẩm tách các băng lên màng nylon hay nitrocellulose c) Cố định ADN sợi đơn trên màng bằng nhiệt hay UV d) Tiền lai màng với ADN không đặc hiệu, sau đó rửa bỏ các ADN dư thừa e) Lai màng với mẫu dò đặc hiệu, rửa bỏ các mẫu dò gắn không đặc hiệu f) Phát hiện các mẫu lai bằng tự chụp phóng xạ hay huỳnh quang. g) Đối chiếu kết quả trên bản film để tìm ra các băng ADN laiđặc hiệu với mẫu dò. Phân tách ADN bằng điện di và lai với mẫu dò A. Sau khi điện di B. Sau khi lai và hiện ảnh 1 2 3 1 2 3 Lai ADN ( DNA Hybridisation) 5’...GGGAGAGGATGTAGCCTGCTTCGT…3’ |||||||||||||||||||||||| 3’...CCCTCTCCTACATCGGACGAAGCA…5’ Target 5’...GGGAGAGGATGTAGCCTGCTTCGT…3’ Probe + Hybridisation 5’...GGGAGAGGATGTAGCCTGCTTCGT…3’ 3’...CCCTCTCCTACATCGGACGAAGCA…5’ Target 5’...GGGAGAGGATGTAGCCTGCTTCGT…3’ Probe + denatured Hybridisation 5’...GGGAGAGGATGTAGCCTGCTTCGT…3’ 3’...CCCTCTCCTACATCGGACGAAGCA…5’ Target 5’...GGGAGAGGATGTAGCCTGCTTCGT…3’ Probe + |||||||||||||||||||||||| annealed Hybridisation can label one molecule out of a complex mixture DNA mix probe Annealed mix Detection DNA tổng số các dòng ngô chuyển gen được cắt bằng BamHI DNA được thẩm tách lên màng nylon và lai với mẫu dò Kết quả lai DNA của các dòng ngô chuyển gen Kỹ thuật thẩm tách miễn dịch/Western blotting Nguyên tắc: Dựa trên sự tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể và phản ứng tạo màu do enzym gắn với kháng thể xúc tác. Kháng nguyên Kháng thể sơ cấp Kháng thể thứ cấp (protein) IgG của ĐV A IgG của ĐV B Cơ chất Sản phẩm có màu  Tách protein hay kháng nguyên và gây kháng thể ở trên động vật A  Thẩm tách hay chuyển protein lên màng và cố định protein trên màng  Ủ màng với kháng thể sơ cấp (KT do động vật A tạo ra để kháng lại KN tương ứng). Rửa bỏ các KT dư  Ủ màng với kháng thể thứ cấp (KT do động vật B tạo ra để kháng lại phần Fc trên IgG của động vật A). Rửa bỏ KT thứ cấp dư  Ủ màng với hỗn hợp cơ chất của enzym tương ứng (HRP hay AP) đã được gắn sẵn trên phân tử KT thứ cấp  Phát hiện sản phẩm tạo thành. Các bước cơ bản của thẩm tách miễn dịch M D7( LM) D2(SP) D5(LG) D9(LG) D16(LG) Phân tích Western blot các dòng bèo tấm chuyển gen kháng nguyên HA1