Tối ưu hóa một số điều kiện thu sinh khối của các chủng Baciillus ứng dụng tạo chế phẩm nuôi tôm

NH3 Các VSV tham gia: Planosaricna ureae, Micrococus Sự amon hóa protein Dưới tác dụng của enzyme proteinaza, protein được phân giải thành các chuỗi polypetit và oligopeptit. Sau đó, dưới tác dụng của enzyme peptidaza các polyeptit và oligopeptit sẽ được phân giải thành các axit amin. Một phần axit amin sẽ được tế bào vi sinh vật hấp thụ làm chất dinh dưỡng. Phần khác sẽ thông qua quá trình khử amin tạo thành NH3 và nhiều sản phẩm trung gian khác[1] Nhóm VSV tham gia: Vi khuẩn: Bacillus mycoides, B. mesentericus, B.subtilis Xạ khuẩn:Streptomyces Vi nấm: Aspergillus oryzae Quá trình Nitrat hóa: Gồm 2 giai đoạn là nitrit hóa và nitrat hóa Nitrit hóa: NH4 + 3/2 O2 → NO2- + H2O+ 2H++ năng lượng Các VSV tham gia: Nitrozomona, Nitrozolobus là các vi khuẩn tự dưỡng hóa năng Quá trình phản nitrat hóa NH2OH →NH3 (amon hóa nitrat) NO3 → NO2 → NO N2O→N2 (phản nitrat hóa) Các vi sinh vật tham gia: Nhóm tự dưỡng hóa năng: Thibacillus denitrificans, Hydrogenomonas agilis.. Nhóm dị dưỡng: Pseudononas denitrificans, Micrococus denitrificans, Bacillus licheniformis... 9. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật trong xử lý môi trường Hiện nay trên thế giới các chế phẩm sinh học tăng cường xử lý nước thải, bùn thải công nghiệp, chế biến và nuôi trồng thủy sản đang được thương mại hóa rộng rãi trên thế giới hư BZT, EPICIN, BRF2 của Mĩ, EM và Boski của Nhật, Vlmedin của Thái Lan [1] Ở nước ta , đối với vấn đề ứng dụng chế phẩm VSV phục vụ nuôi trồng thủy sản: Trong những năm gần đây, để giảm thiểu những bất lợi do sử dụng hóa chất trong môi trường thủy sản, việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm sinh học trong quá trình nuôi tôm đang phát triển mạnh. Theo cục Bảo vệ nguồn lợi thủy sản, hiện có khoảng 200 thương hiệu chế phẩm sinh học và vitamin đang được bán trên thị trường nước ta. Đa số các chế phẩm sinh học có nguồn gốc nhập ngoại và một số chế phẩm được sản xuất trong nước nhưng phần lớn các chế phẩm này chưa được công bố về nguồn gốc xuất xứ. Hiện nay cũng chưa có nghiên cứu nào đánh giá việc đưa các chủng VSV ngoại nhập có phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam không? Có làm ảnh hưởng đến sự bền vững của hệ sinh thái môi trường hay không? Một số chế phẩm sinh học được sử ở Việt Nam ứng dụng xử lý môi trường nuôi tôm đang được thương mại hóa: ACCEL OBCđAG, AGROSTIMTM, VIME- Yucca, BIO- DIABAPES, ENVIRON- ACTM, BIOTIC For Shrimp, Super MAZAL ,EMS... có tác dụng khử ô nhiễm bùn, nước , loại thải khí độc( NH3, H2S, NO2), phân hủy các chất thải và các chất hữu cơ, tăng nguồn dinh dưỡng, cải thiện hệ số chuyển hóa thức ăn, giảm chất cặn bã, độ acid ở đáy, ổn định pH, cho môi trường, ngăn ngừa dịch bệnh, tăng độ oxy hòa tan, kiểm soát các chất lư lửng trong nước [1] II- ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN BACILLUS 1. Đặc điểm chung: Bacillus là những vi khuẩn gram dương, nhóm vi khuẩn này được tìm thấy trong môi trường pH có độ biến động cao, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc. Thuộc chi Bacillus, đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hay thành sợi. Chúng có khả năng tạo bào tử khi xẩy ra các điều kiện khắc nghiệt như thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt độ cao…phần lớn tế bào có bào tử trong, hình oval có khuynh hướng phình ra ở 1 đầu. Bào tử có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì nảy mầm phát triển thành tế bào sinh dưỡng Qua kính hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình que, que có bào tử hình oval có khuynh hướng phình ra một đầu Một đặc điểm nữa của vi khuẩn Bacillus là có bao nhầy, bao nhầy cấu tạo bởi các polypeptit. Việc hình thành bao nhầy giúp cho vi khuẩn có thể chịu được các điều kiện khắc nghiệt là do bao nhầy có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi gặp khô hạn [2] Bacillus tồn tại khắp nơi trong tự nhiên. Tính dễ sống, dễ tồn tại là một lợi thế để sử dụng Bacillus làm chế phẩm sinh học. Trong quá trình hình thành bào tử Bacillus thường sản sinh những chất có hoạt tính sinh học như sản sinh ra các enzyme phân hủy các chất hữu cơ là: enzyme amylase, protease, cellulose. Bacillus là các cơ thể hiếu khí thường phải kể đến là Bacillus subtilis, B. mensentericus, B. mycoides, B. megaterium… +Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí có bào tử có thể sống sót ở nhiệt độ cao. B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp riboflavin, tạo cho nó có khả năng cạnh tranh thức ăn với một số loài khác. +B. mensentericus: chúng có hoạt tính amylase, protease cao hơn B. subtilis nhưng khả năng lên men đường kém hơn. Trong tự nhiên có thể sinh ra chất đối kháng với các sinh vật khác ức chế sinh vật gây bệnh và hoại sinh +B. megaterium : khuẩn lạc tròn đều, giống giọt nến, lồi, nhẵn, thường có vòng viền quanh, màu trắng sữa. Trong tế bào có nhiều giọt mỡ glycogel, bào tử hình oval hay hình trụ 2. Các đặc tính của Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis 2.1. Đặc tính cơ bản của Bacillus subtilis + Tế bao :hình que, xếp thành chuỗi, kích thước (2.0-2.5)µm x 0.6µm. + Khuẩn lạc: khô, màu trắng hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch + Bào tử: hình bầu dục, kích thước 1.2µm x 0.6µm, phân bố lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. + Tính chất nhuộm màu: gram dương. + Điều kiện sống: hiếu khí. Hình 1. Hình thái vi khuẩn B. subtilis Hình 2. Bào tử của B. subtilis 2.2. Đặc tính cơ bản của Bacillus licheniformis + Tế bào hình que ( sau 2 ngày cấy) + Khuẩn lạc: hình tròn, dẹt, mép có răng cưa, giữa khuẩn lạc có màu trắng đục, xung quanh trắng trong, kích thước 1.2-2.5cm ( sau 2 ngày cấy) + Tính chất nhuộm: gram dương + Điều kiện sống hiếu khí Hình 3.Hình thái tế bào B. licheniformis 2.3. Các ưu điểm nổi bật của Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis Ngoài những ưu điểm chung của Bacillus như: tính phổ biến, dễ sống, sinh trưởng trong vùng pH biến động, tồn tại trong những điều kiện khắc nghiệt… thì các chủng thuộc loài Bacillus subtilis và Bacilluslicheniformis có những ưu điểm riêng so với các chủng khác cùng loài và khác loài tiêu biểu như: 1, Sản sinh ra các hợp chất ức chế và điều chỉnh sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột. + Trong quá trình sinh trưởng, phát triển và sự trao đổi chất Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis có thể kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh thông qua cơ chế cạnh tranh oxy, dinh dưỡng, vị trí bám dính và sản sinh một loạt các chất kháng khuẩn, tiêu diệt các loài như Staphylococcus aureus, Candida albicans. Các chất kháng khuẩn này bào gồm riboflavin, Bacitracin, Iturins, polymyxin, nystatin, gramicidin (Bacillus subtilis) và Bacitracin (Bacillus licheniformis) nhanh chóng đi vào bộ phận tiêu hóa, sau khi vi khuẩn thích ứng và sinh sản, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis nhanh chóng phát triển làm cạn kiệt oxy tự do của môi trường, dẫn đến tình trạng thiếu oxy trong ruột thúc đẩy các vi khuẩn kỵ khí sinh lý đường ruột như Bifidobacterium, Lactobacillus, Peptostreptococcus, Bacteroides, tăng trưởng và sinh sản các chất như acid lactic và các axit hữu cơ khác, làm giảm giá trị PH đường ruột, và gián tiếp ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác do đó điều chỉnh để khôi phục lại chức năng tiêu hóa [17] 2, Sản sinh ra nhiều loại enzyme tiêu hóa động vật và làm tăng hoạt động của chúng. + Các vi khuẩn Bacillus subtilis và Bacilluslicheniformis có thể sản xinh ra nhiều loại enzym hoạt động, như protease, amylase, lipase, enzyme cellulase pectinase, glucanase, mà còn tạo ra một loạt các yếu tố enzyme và thúc đẩy các hoạt động của các enzym tiêu hóa ở động vật, và thúc đẩy sự tăng trưởng của vật nuôi để cải thiện việc sử dụng thức ăn. Mặt khác khi các vi khuẩn này tồn tại trong ao nuôi chúng sẽ phân hủy các thức ăn thừa của tôm, giúp cải thiện chất lượng ao nuôi tôm [15] 3, Kích thích tăng trưởng ở vật nuôi và phát triển các cơ quan miễn dịch để kích hoạt các lymphoT, B. Nâng cao mức globulin miễn dịch và kháng thể, tăng cường miễn dịch trung gian tế bào và chức năng miễn dịch dịch thể, nâng cao khả năng miễn dịch của vật nuôi [20] 3. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus Dựa vào những đặc điểm đã được nghiên cứu về các chủng vi khuẩn Bacillus người ta thấy rằng các vi khuẩn Bacillus này đều không độc hại, dễ nuôi cấy, dễ tồn tại trong môi trường đất và nước nghèo dinh dưỡng. Đặc biệt chúng có khả năng phân hủy thức ăn thừa của tôm, phế thải hữu cơ, làm sạch môi trường nhờ enzyme do chúng tổng hợp được. Ngoài ra chúng có khả năng chúng có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn như , Bacitracin, Iturins, polymyxin, nystatin, gramicidin (Bacillus subtilis) và Bacitracin (Bacillus licheniformis) là các chất kháng sinh được dùng trong chăn nuôi để nâng cao hiệu suất tăng trưởng, hiệu suất sử dụng thức ăn cho gia súc, làm giảm sự phát triển của vi sinh vật có hại. Lợi dụng những đặc điểm này người ta đã sản xuất một số chế phẩm vi sinh cải thiện cải thiện môi trường nước nuôi tôm. Các chủng Bacillus có hoạt tính protease cao được dùng trong công nghiệp chế biến sữa, làm mềm thịt, tăng hương vị thịt sau khi chế biến. Các chủng thuộc loài B. subtilis và B. Licheniformis có hoạt tính enzyme proteaza cao nên được bổ sung vào các loại nước tẩy rửa và bột giặt nhằm loại bỏ các chất bẩn có nguồn gốc protein. [22] B. subtilis được ứng dụng làm thuốc chống rối loạn tiêu hóa cho người và động vật 4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn + Nguồn dinh dưỡng: C, N, muối khoáng. Nito được cung cấp vào môi trường nuôi cấy như cao thịt, peptone, cao men. Các nguyên tố đa lượng và vi lượng cho vi sinh vật cung cấp dưới dạng muối khoáng + Sự sinh trưởng và phát triển của VSV không những phụ thuộc vào thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy mà còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố: nhiệt độ, pH, oxy hòa tan…Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus là khả năng chịu nhiệt, chịu axit, chịu kiềm. Bacillus có thể phát triển ở nhiệt độ cao, nhưng phát triển tốt ở nhiệt độ 28- 370C. pH cũng ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, thay đổi pH làm diện tích màng tế bào thay đổi vì thế ảnh hưởng đến sự hấp thụ thức ăn và cũng làm thay đổi nhiều phản ứng sinh hóa trong tế bào. pH thích hợp cho Bacillus là 7, lactic thì thấp hơn (6-6,5) [2] III- QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM [8] 1. Vai trò của quy hoạch thực nghiệm Nhiều công trình nghiên cứu khoa học công nghệ thường dẫn đến giải bài toán cực trị, tìm điều kiện tối ưu để tiến hành các quá trình hoặc lựa chọn thành phần tối ưu để tiến hành quá trình. Chẳng hạn, khi xem xét các quá trình CN hóa học mới, nhiệm vụ nghiên cứu thường là thay đổi nhiệt độ, áp suất và tỉ lệ các chất phản ứng để tìm hiệu suất phản ứng cao nhất, tính toán, lựa chọn giá trị thích hợp nhất của các thông số cấu trúc và động học nhằm đạt đến chất lượng làm việc và hiệu quả kinh tế cao nhất. Những bài toán này thường giải quyết ở mức độ nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hệ, lập mô hình biểu diễn mối phụ thuộc giữa các phần tử của hệ, điều khiển hệ theo mục đích cho trước, hoặc đưa về trạng thái tối ưu theo những chỉ tiêu đánh giá đã chọn. Thông thường các hệ cần điều khiển và tối ưu rất phức tạp, đối tượng nghiên cứu ngày càng đa dạng, hệ thống trở lên phức tạp hơn với số yếu tố tác động và chỉ tiêu đánh giá ngày càng lớn. Mối quan hệ giữa các thành phần trong hệ thống càng không thể mô tả bằng hàm lý thuyết. Vì vậy đa số các bài toán cực trị được giải quyết bằng thực nghiệm. [8] Ngày nay người ta thường đề cập tới phương pháp kết hợp lý thuyết và thực nghiệm. Có thể nói, lý thuyết quy hoạch thực nghiệm từ khi ra đời đã thu hút sự quan tâm và nhận được nhiều đóng góp hoàn thiện của các nhà khoa học. Vai trò của quy hoạch thực nghiệm so với thực nghiệm cổ điển là: + Giảm đáng kể số lượng thí nghiệm cần thiết. + Hàm lượng thông tin nhiều hơn rõ rệt, nhờ đánh giá được vai trò qua lại giữa các yếu tố và ảnh hưởng của chúng đến hàm mục tiêu. Nhận được mô hình toán học thống kê thực nghiệm theo các tiêu chuẩn tối ưu, đánh giá được sai số của quá trình thực nghiệm theo các tiêu chuẩn thống kê cho phép xét ảnh hưởng của các yếu tố với mức độ tin cậy cần thiết. + Cho phép xác định được điều kiện tối ưu đa yếu tố của đối tượng nghiên cứu một cách chính xác bằng các công cụ toán học, thay cho cách giải gần đúng, tìm tối ưu cục bộ như các thực nghiệm thụ động. 2. Những khái niệm cơ bản của quy hoạch thực nghiệm 2.1. Định nghĩa quy hoạch thực nghiệm + Là tập hợp các tác động nhằm đưa ra chiến thuật làm thí nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình làm thí nghiệm( từ nhận thông tin mô phỏng đến việc tạo mô hình toán, xác định các điều kiện tối ưu), trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng[8] 2.2. Đối tượng của quy hoạch thực nghiệm trong các ngành công nghệ + Là một quá trình hoặc hiện tượng nào đó có tính chất, đặc điểm chưa biết cần nghiên cứu. Người nghiên cứu có thể chưa hiểu biết đầy đủ về đối tượng , nhưng đã có một số thông tin tiên nghiệm, ảnh hưởng đến tính chất đốiy tượng. Ta có thể hình dung chúng như một hộp đen Qúa trình làm việc hệ thống Z Y 2.3. Các phương pháp quy hoạch thực nghiệm + Thực nghiệm sàng lọc: là thực nghiệm mà nhiệm vụ của nó là tách những yếu tố ảnh hưởng đáng kể ra khỏi những yếu tố đầu vào để tiếp tục nghiên cứu chúng trong các thực nghiệm cần thiết. [8] + Thực nghiệm mô phỏng: là thực nghiệm liên quan tới việc mô phỏng hiện tượng cần nghiên cứu. Có nhiều dạng mô phỏng, ở đây chỉ quan tâm đến dạng thực nghiệm được hoàn tất bằng mô hình hồi quy đa thức. [8] + Thực nghiệm cực trị: là thực nghiệm được phát triển từ thực nghiệm mô phỏng. Nhiệm vụ của nó là xây dựng mô hình toán thực nghiệm, theo đó xác định giá trị tối ưu của hàm mục tiêu và các tọa độ tối ưu của hàm. Nói cách khác là xác định bộ kết hợp giá trị các yếu tố mà tại đó hàm tiêu đạt được cực trị. Đây chính là phương pháp được lựa chọn trong đề tài này. [8] 2.4. Ma trận kế hoạch thực nghiệm + Là dạng mô tả chuẩn các điều kiện tiến hành thí nghiệm( các điểm thí nghiệm) theo bảng chữ nhật, mỗi hàng là một thí nghiệm( còn gọi là phương án kết hợp các yếu tố đầu vào), các cột ứng với các yếu tố đầu vào. [8] 2.5. Các nguyên tắc cơ bản của quy hoạch thực nghiệm 2.5.1. Nguyên tắc không lấy toàn bộ trạng thái đầu vào + Để có thông tin toàn diện về tính chất hàm mục tiêu về nguyên tắc cần tiến hành vô số các thí nghiệm trong miền quy hoạch Về lý thuyết nếu không tiến hành tất cả các thí nghiệm đó có thể bỏ sót đặc điểm nào đó của hàm mục tiêu, tuy nhiên thực tế không thể thực hiện được điều này. Do vậy người nghiên cứu chỉ có thể lấy những giá trị rời rạc, chọn mức biến đổi nào đó cho các yếu tố. Sự lựa chọn này cần có cơ sở khoa học, nó gắn liền với sự lựa chọn dạng hàm, tức dạng mô phỏng của bề mặt đáp ứng. Dạng thông thường là bậc một hoặc bậc 3 và số mức biến đổi thường là bậc 2 hoặc bậc 3. [8] 2.5.2. Nguyên tắc phức tạp dần mô hình toán học Khi chưa có thông tin ban đầu về các tính chất của hàm mục tiêu, thì không xây dựng mô hình phức tạp của đối tượng để tránh lãng phí vô ích về thời gian, phương tiện vật chất nếu không dùng đến mô hình đó. Vì thế lý thuyết quy hoạch thực nghiệm hướng dẫn nên bắt đầu từ những mô hình đơn giản nhất, ứng với những thông tin ban đầu đã có về đối tượng. [8] + Logic tiến hành thực nghiệm là nên làm ít thí nghiệm để có mô hình đơn giản( ví dụ mô hình tuyến tính), kiểm tra tính tương hợp của mô hình Nếu mô hình tương hợp, kiểm tra tính tương hợp của mô hình Nếu mô hình không thì tiến hành giai đoạn tiếp theo của thực nghiệm: làm những thí nghiệm mới, bổ sung để rồi nhận được mô hình phức tạp hơn ( ví dụ mô hình phi tuyến), kiểm tra mô hình mới cho đến khi đạt được mô hình hữu dụng. 2.5.3. Nguyên tắc đối chứng với nhiễu + Độ chính xác của mô hình phải tương xứng với cường độ nhiễu ngẫu nhiên mà chúng tác động lên kết quả đo hàm mục tiêu. Trong cùng điều kiện như nhau, độ nhiễu càng nhỏ thì mô hình càng phải chính xác, phải phức tạp hơn. [8] + Bằng các công cụ thống kê toán học, người ta xây dựng hoàn chỉnh các quy trình chuẩn theo các tiêu chuẩn thống kê để giải quyết các nhiệm vụ xác định tính tương hợp của mô hình tìm được, hiệu chỉnh dạng mô hình, kiểm tra tính đúng đắn của các giả thiết, các tiên đề mà từ đó tìm ra các mô hình. [8] 2.6. Các bước quy hoạch thực nghiệm cực trị Trong bài toán tối ưu hóa này ta lựa chọn phương pháp quy hoạch thực nghiệm cực trị . Vậy trước khi tiến hành quy hoạc thực nghiệm ta cần biết các bước quy hoạch thực nghiệm cực trị. 2.6.1. Chọn thông số nghiên cứu + Lựa chọn các yếu tố ảnh hưởng chính, loại bớt những yếu tố không cần thiết, nhằm đảm bảo tính khả thi và hiệu quả thí nghiệm + Lựa chọn chỉ tiêu( mục tiêu) đánh giá đối tượng, sao cho các chỉ tiêu này vừa đáp ứng các yêu cầu của phương pháp quy hoạch thực nghiệm, vừa đại diện nhất cho các điều kiện tối ưu của đối tượng nghiên cứu. + Căn cư vào số yếu tố ảnh hưởng chính, chỉ tiêu đánh giá, mục đích nhiệm vụ thực nghiệm, vì tính hiệu quả và khả năng làm việc của các mô hình hồi quy phụ thuộc nhiều vào kết quả xác định yếu tố đầu vào của chúng [8] 2.6.2 . Lập kế hoạch thực nghiệm + Chọn dạng kế hoạch thí nghiệm phù hợp với điều kiện tiến hành thí nghiệm và với đặc điểm các yếu tố của đối tượng. + Mỗi dạng kế hoạch thí nghiệm đặc trưng bởi các chuẩn tối ưu và tính chất khác nhau 2.6.3. Tiến hành thí nghiệm nhận thông tin 2.6.4. Xây dựng và kiểm tra mô hình thực nghiệm + Sử dụng phương pháp phân tích hồi quy, phân tích phương sai để xác định các hệ số trong phương trình hồi quy đa thức, kiểm tra mô hình theo độ tương thích và khả năng làm việc. Tùy theo dạng thực nghiệm mà mô hình là tuyến tính hay phi tuyến. + Mô hình bậc hai phi tuyến: Trong đó B= [bo, b1 ,b2, bk, b11, b12, …bjj…] là các hệ số hồi quy + Mô hình thống kê thực ngiệm chỉ có thể sử dụng sau khi đã thỏa mãn các tiêu chuẩn thống kê ( Student và Fisher). [8] 3. Phần mềm quy hoạch thực nghiệm Design Expert + Đây là phần mềm thiết kế thí nghiệm được ứng dụng rộng rãi trong các nghành khoa học như: hóa học, thực phẩm& sinh học, vật liệu, cơ khí + Phần mềm được thiết kế dựa trên những ứng dụng của lý thuyết xác suất thống kê và thống kê toán học và lý thuyết quy hoạch thực nghiệm[21] Ưu điểm của phần mềm là: + Giúp người nghiên cứu giảm bớt đáng kể số lượng thí nghiệm cần thiết, điều này rất quan trọng vì giúp ta tiết kiệm công sức, chi phí nguyên vật liệu ,thời gian thí nghiệm có ý nghĩa lớn về mặt kinh tế. + Design Expert cho phép lựa chọn được các mô hình toán học trong đó có sự tương tác giữa các biến( các yếu tố) đến hàm mục tiêu bằng phương pháp đáp ứng bề mặt mô phỏng bằng không gian 3 chiều , cho biết mô hình có thực tế hay không thông qua cảnh báo mà các phần mềm khác như MS.Excel hay IRRISTAT không làm được. Đặc biệt có thể phân tích tối đa 999 hàm mục tiêu cùng với số biến lên đến 50 . [21] + Design expert đưa ra hàng loạt các dự báo xác định được điều kiện tối ưu cho cả bài toán 1 mục tiêu hay đa mục tiêu giúp người thực nghiệm có thể tìm được đáp án phù hợp với điều kiện thí nghiệm của mình. [21] Hình 4. Giao diện của phần mềm Design Expert 8.0.4 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu: + Do những ưu điểm nổi bật của B. subtillis và B. licheniformis như đã nêu ở trên nên ta chọn 2 chủng là Bacillus subtillis ATCC 6633 và Bacillus licheniformis ATCC 14580 làm đối tượng nghiên cứu. Các chủng này do Viện Vi Sinh Vật và Công Nghệ Sinh Học( IMBT) của Đại học Quốc Gia Hà Nội cung cấp 2. Hóa chất và thiết bị: - Các loại hóa chất chính dùng trong nghiên cứu: Glucose ( Việt Nam) Peptone ( Trung Quốc) Agar ( Việt Nam) Tinh bột tan ( Việt Nam) MgSO4.7H2O ( Việt Nam) NaCl ( Việt Nam) CMC( Việt Nam) Sữa gầy ( Việt Nam) KH2PO4 ( Việt Nam) MnSO4 ( Việt Nam) - Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu STT Tên thiết bị Nhãn hiệu 1 Máy đo pH Niko, Nhật Bản 2 Nồi hấp Hirayama, Nhật Bản 3 Cân điện tử 2 số Đức 4 Tủ cấy vô trùng 5 Máy đo quang Model 80-2088, Anh 6 Tủ sấy 7 Máy lắc 8 Tủ lạnh thường 9 Lò vi sóng Samsung Hàn Quốc Tủ ấm, nồi hấp, cân điện tử 2 số, tủ cấy vô trùng, tủ sấy, tủ lạnh, máy đo quang, máy đo pH Các dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm: bình tam giác, ống nghiệm, hộp peptri, đèn cồn, que cấy… 3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật - Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Peptone- glucose Thành phần Khối lượng( g/l) Glucose 8 peptone 3 KH2PO4 0.2 NaCl 30 H2O 1000ml NB( Nutrient Broth) Thành phần Khối lượng( g/l) Glucose 3 peptone 5 MgSO4.7H2O 0.2 NaCl 30 Agar 18 H2O 1000ml pH= 7-7,5. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút + Môi trường thử hoạt tính enzyme protease Thành phần Khối lượng( g/l) Sữa gầy 5 NaCl 30 Agar 10 H2O 1000ml pH= 7-7,5. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút + Môi trường thử hoạt tính enzyme amylase Thành phần Khối lượng(g/l) Tinh bột tan 10 NaCl 30 Agar 10 H2O 1000ml pH= 7-7,5. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút + Môi trường thử hoạt tính enzyme cellulose Thành phần Khối lượng(g/l) CMC 5 NaCl 30 Agar 10 H2O 1000ml + Môi trường peptone glucose Thành phần Khối lượng( mg/l) Glucose 8 Peptone 3 KH2PO4 0,2 NaCl 30 H2O 1000ml pH= 7-7,5. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Phương pháp tuyển chọn chủng có hoạt tính cao. 1.1.Tuyển chọn chủng có hoạt tính protease Kiểm tra khả năng sinh enzyme protease trên môi trường thạch bổ sung 5% sữa gầy, 3% NaCl và thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau đó đổ vào hộp peptri đã thanh trùng. Các chủng vi khuẩn được cấy chấm điểm trên đĩa thạch. Nuôi trong tủ ấm 30-350C. Theo dõi ở 48h và 72h, tại mỗi thời điểm này đem các hộp peptri có cấy chấm điểm các chủng cần thử hoạt tính xác định vòng phân giải. khi VK phát triển trên môi trường thạch sẽ sinh ra protease ngoại bào, enzyme này thủy phân casein có trong sữa thành các peptide và axid min. Do vậy xung quanh vùng thủy phân sẽ tạo thành một vòng tròn thủy phân có màu trong suốt so với nền đục xung quanh( do sữa tạo thành). Tiến hành đo đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng phân giải.[2] 1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính amylase cao Kiểm tra khả năng sinh amylase trên môi trường thạch bổ sung 1% tinh bột, 3% NaCl và thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau đó đổ vào hộp peptri đã thanh trùng. Các chủng vi khuẩn được cấy chấm điểm trên đĩa thạch. Nuôi trong tủ ấm 30-350C. Theo dõi ở 48h và 72h, tại mỗi thời điểm này đem các hộp peptri có cấy chấm điểm các chủng cần thử hoạt tính nhỏ dung dịch I2 0,1N để xác định vòng phân giải. Khi vi khuẩn phát triển trên môi trường thạch sẽ giải phóng ra các enzyme amylase ngoại bào, enzyme này sẽ thủy phân tinh bột tan thành đường. Do vậy khi nhỏ I2 vào đĩa thạch xung quanh vùng thủy phân sẽ tạo thành vòng tròn thủy phân có màu môi trường trong suốt so với nền xanh đen xung quanh( do I2 kết hợp với tinh bột tạo thành). Tiến hành đo đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng phân giải tạo thành. [2] 1.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao: Kiểm tra hoạt tính enzyme môi trường thạch có bổ sung 0,5% CMC, 3% NaCl thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau đó đổ vào hộp peptri đã thanh trùng. Các chủng vi khuẩn được cấy chấm điểm trên đĩa thạch. Nuôi trong tủ ấm 30-350C. Theo dõi ở 48h và 72h, tại mỗi thời điểm này đem các hộp peptri có cấy chấm điểm các chủng cần thử hoạt tính nhỏ dung dịch Lugol 0,1N để xác định vòng phân giải. Khi vi khuẩn phát triển trên môi trường thạch sẽ giải phóng ra enzyme cellulose ngoại bào, enzyme này thủy phân cellulose tan trong môi trường thành đường. Do vậy khi nhỏ Lugol vào đĩa thạch xung quanh vùng thủy phân sẽ tạo thành 1 vòng tròn thủy phân có mầu môi trường trong suốt so với màu nâu xung quanh( do KI kết hợp với tinh bột tạo thành). Tiến hành đo đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng phân giải tạo thành[14] 1.4. Xác định khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn Do môi trường nước nuôi tôm là nước lợ và nước mặn nên việc xác định khả năng chịu muối của các chủng rất quan trọng. Nó quyết định khả năng tồn tại của các vi khuẩn trong môi trường nước nuôi tôm đồng thời ảnh hưởng đến hiệu quả sử dụng chế phẩm Môi trường kiểm tra khả năng chịu mặn là môi trường NB có bổ sung NaCl với các nồng độ tương ứng là 0%, 1%, 3%, 5%, 7%, 9%. Sau 36h đánh giá khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn Bacillus thông qua chỉ só mật độ OD 620nm và CFU/ml[14] 2. Phương pháp nhân giống, lên men, thu sinh khối 2.1. Một số quy trình đã được dùng để tạo chế phẩm + Quy trình tạo chế phẩm của Đặng Đình Kim và cộng sự [7]: ống giống Nhân giống cấp 1 Nhân giống cấp 2 Lên men thu sinh khối Làm khô Đóng gói Phối trộn Nghiền 2.2. Quy trình tạo chế phẩm trong phòng thí nghiệm: Căn cứ vào quy trình tạo chế phẩm của một số tác giả và điều kiện của Phòng thí nghiệm tôi đề xuất quy trình tạo chế phẩm trong PTN như sau: Chủng giống gốc 30-350C 150-180v/p Nhân giống cấp 1 Nhân giống cấp 2 Lên men thu sinh khối→ tối ưu hóa: chất dinh dưỡng, to, pH Ly tâm ly tâm lạnh 40C; 10 000v/p Phối trộn với chất mang Sấy Nghiền thành bột Đóng gói Bảo quản Các chủng Bacillus được giữa trong tủ lạnh, hoạt hóa trên môi trường tương ứng với môi trường lên men thu sinh khối( peptone glucose) Nhân giống cấp 1: cấy các chủng trên môi trường hoạt hóa peptone glucose trong bình tam giác. Nuôi lắc các bình này với tốc độ 150-180 v/p ở 30-350C, trong 24h Nhân giống cấp 2: giống cấp 1 được chuyển sang bình nhân giống cấp 2 có chứa môi trường lên men(peptone glucose). Nuôi lắc các bình này với tốc độ 150-180 v/p ở 30-350C, trong 24h Sau khi nhân giống cấp 2, ta tiến hành lên men thu sinh khối trong các bình tam giác loại 250 ml trên môi trường peptone – glucose . Đây chính là công đoạn ta cần tối ưu hóa để thu lượng sinh khối lớn nhất ( mật độ tế bào sống là lớn nhất tại nhiệt độ nào? pH là bao nhiêu? Thành phần dinh dưỡng thế nào? thời điểm thu sinh khối là bao nhiêu giờ kể từ khi tiếp giống ? 3. Phương pháp đặt một bài toán tối ưu trong hóa học và thực phẩm 3.1. Tối ưu hóa là gì? + Là quá trình tìm kiếm điều kiện tốt nhất ( điều kiện tối ưu) của hàm số được nghiên cứu. + Là quá trình xác định cực trị của hàm hay tìm điều kiện tối ưu tương ứng để thực hiện một quá trình cho trước 3.2.Cách biểu diễn bài toán tối ưu + Giả sử một hệ thống công nghệ được biểu diễn dưới dạng sau : Y= F( x1,x2,...xk) x1,x2,xk : thành phần của vecto thông số đầu vào + Hàm mục tiêu: I= I (x1,x2,...xk) Bài toán được biểu diễn Iopt = opt I(x1,x2,...xk)= I( x1opt, x2 opt,...xk opt) Hoặc I opt = max I (x1,x2,...xk): đối với bài toán max. I opt = min I (x1,x2,...xk): đối với bài toán min. I opt: hiệu quả tối ưu x1opt, x2 opt,...xk opt nghiệm tối ưu hoặc phương án tối ưu 3.3.Thành phần cơ bản của bài toán tối ưu 3.3.1.Hàm mục tiêu + Là hàm phụ thuộc + Được thiết lập trên cơ sở tiêu chuẩn tối ưu đã được lựa chọn. → Hàm mục tiêu là hàm thể hiện kết quả mà người thực hiện phải đạt được- là tiêu chuẩn tối ưu dạng hàm, phụ thuộc vào các yếu tố đầu vào, giá trị của nó cho phép đánh giá chất lượng của 1 nghiên cứu 3.3.2.Quan hệ giữa các đại lượng + Các biểu thức toán học mô tả quan hệ giữa tiêu chuẩn tối ưu hóa( hàm mục tiêu) và các thông số ảnh hưởng( thông số cần tối ưu) đến giá trị tiêu chuẩn tối ưu hóa này. + Các quan hệ này thường được biểu diễn bằng phương trình cơ bản hoặc mô hình thống kê thực nghiệm( phương trình hồi quy). + Quan hệ giữa các yếu tố ảnh hưởng với nhau được biểu diễn bằng đẳng thức hoặc bất đẳng thức[8] 3.3.3.Các điều kiện ràng buộc + Để bài toán công nghệ có ý nghĩa thực tế , các biểu thức mô tả điều kiện ràng buộc bao gồm: - Điều kiện biên - Điều kiện ban đầu Các bước giải bài toán tối ưu: 1. Đặt vấn đề công nghệ: xem xét công nghệ cần được giải quyết là gì và chọn ra những yếu tố ảnh hưởng chính Chỉ ra được hàm mục tiêu Y: Y→Max hoặc Y→ Min 2. Xây dựng mối quan hệ giữa các yếu tố ảnh hưởng và hàm mục tiêu theo quy luật biết trước hoặc mô hình thống kê thực nghiệm 3. Tìm thuật giải: là phương pháp để tìm nghiệm tối ưu của các bài toán công nghệ trên cơ sở các mô tả toán học tương thích đã được thiết lập. Đa số dẫn đến tìm cực trị của các hàm mục tiêu 4. Phân tích và đánh giá kết quả thu được + Nếu phù hợp → kiểm chứng bằng thực nghiệm + Nếu không phù hợp→ xem lại từng bước hoặc làm lại từ việc đặt vấn đề. [5] PHẦN III: KẾT QUẢ 1. Kết quả thử hoạt tính enzyme của các chủng Để khẳng định các chủng vi khuẩn Bacillus này có hoạt tính enzyme không có khả năng tạo chế phẩm probiotic trong nuôi tôm tú nhằm tăng khả năng cải thiện môi trường nước nuôi tôm. Các chủng này được cấy chấm điểm trên môi trường thạch có chất chỉ thị tương ứng trong đĩa peptri để kiểm tra sơ bộ hoạt tính enzyme protease, amylase và cellulose sau 24h nuôi cấy, đo đường kính vòng phân giải . Hình ảnh thử hoạt tính của các chủng Hình 5: Khả năng sinh protease của Hình 6: Khả năng sinh protease của B. subtilis ATCC 6633 B. licheniformis ATCC14580 Hình 7. Khả năng sinh amylase của Hình 8. Khả năng sinh amylase của B. subtilis ATCC 6633 B. licheniformis ATCC14580 Hình 9. Khả năng sinh cellulase Hình 10. Khả năng sinh cellulase B. subtilis ATCC 6633 B. licheniformis ATCC14580 Bảng 3. Kết quả thử hoạt tính của các chủng Bacillus Hoạt tính enzyme (D- d, mm) tại t= 24h protease amylase celluase Chủng B1 Chủng B2 Chủng B1 Chủng B2 Chủng B1 Chủng B2 26 25 22 23 23 25 Chủng B1= (Bacillus subtillis ATCC 6633) và chủng B2= Bacillus licheniformis ATCC 14580. Nhận xét: Từ bảng 11 ta nhận thấy nhìn chung tại thời điểm 24h hoạt tính enzyme của các chủng tương đối đồng đều nhau. Điều đó khẳng định chúng đều có hoạt tính enzyme phân giải nên việc lựa chọn các chủng này làm chế phẩm nuôi tôm là hợp lý. 2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng & phát triển của các chủng Bacillus subtilis ATCC 6633 và Bacillus licheniformis ATCC14580 + Như chúng ta đã biết có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thu sinh khối như thời gian, nhiệt độ, pH, dinh dưỡng, nồng độ muối... Do vậy trước khi tiến hành tối ưu hóa điều kiện thu sinh khối ta cần khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện thu sinh khối của các chủng. 2.1. Thời gian: + Thời gian là yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến lượng sinh khối . Xác định thời điểm thu sinh khối của các chủng vi khuẩn nhiều nhất có ý nghĩa thực tế trong việc tạo chế phẩm sinh học + Các chủng Bacillus này được nuôi trên môi trường peptone- glucose ở nhiệt độ 30oC, tốc độ lắc 150v/p, tỉ lệ tiếp giống 7%. Theo dõi kết quả đo OD ở các thời điểm 6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 36h, 42h, 48h cho phép ta đánh giá mật độ tế bào thu được lớn nhất ở thời điểm nào. Đây chỉ là phương pháp mang tính tương đối và ta không xác định được lượng tế bào sống là bao nhiêu. Còn để xác định chính xác lượng tế bào sống thu được cần tiến hành cấy trang trên hộp peptri rồi đếm khuẩn lạc. Tuy nhiên do thời gian có hạn nên tôi chỉ dừng lại ở việc xác định tốc độ sinh trưởng qua giá trị đo OD. Bảng 4. Khả năng sinh trưởng của các chủng B. subtillis ATCC 6633 và B. licheniformis ATCC 14580 theo thời gian Thời gian(h) B, subtilis ATCC 6633 B, licheniformis ATCC 14580 0 0,105 0,112 4 0,236 0,203 8 0,746 0,617 12 1,124 1,241 16 1,378 1,533 20 1,719 1,982 24 2,223 2,064 28 2,217 2,055 32 2,191 1,982 36 2,032 1,897 40 1,976 1,816 44 1,874 1,778 48 1,836 1,764 Đồ thị 1 : Khả năng sinh trưởng của các chủng B. subtillis ATCC 6633 theo thời gian → Nhận xét: ở thời điểm 24h nuôi cấy, tốc độ sinh trưởng của các chủng là cao nhất. Vậy ta lựa chọn thời điểm thu sinh khối cho các chủng là 24h. 2.2.Nhiệt độ: Có thể nói nhiệt độ là một trong những những yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Xác định ở nhiệt độ nào chúng phát triển tốt là vấn đề mà tôi quan tâm, để từ đó thu được lượng sinh khối lớn nhất. + Nguyên tắc: Các chủng được nuôi lắc trên môi trường peptone- glucose ở các nhiệt độ 200C, 250C, 300C, 350C,400C, 500C, tỉ lệ tiếp giống 7%, tốc độ lắc 150v/p. Bảng 5 : Khả năng sinh trưởng của B.subtilis ATCC 6633 theo nhiệt độ Thời gian(h) 200C 250C 300C 350C 400C 500C 0 0,113 0,129 0,132 0,311 0,357 0,092 4 0,152 0,252 0,361 0,463 0,604 0,261 8 0,341 0,726 0,917 0,923 0,935 0,502 12 0,655 0,915 1,113 1,131 1,229 0,612 16 1,033 1,254 1,326 1,528 1,458 0,923 20 1,102 1,545 1,614 1,807 1,815 1,227 24 1,314 1,782 1,928 2,115 2,198 1,454 28 1,308 1,78 1,924 2,113 2,193 1,421 32 1,296 1,776 1,918 2,109 2,182 1,403 36 1,217 1,723 1,873 2,003 2,15 1,284 40 1,198 1,598 1,747 1,998 1,983 1,167 44 1,162 1,474 1,719 1,875 1,964 1,125 48 1,143 1,443 1,624 1,668 1,874 1,028 52 1,02 1,381 1,592 1,61 1,769 0,987 56 0,898 1,305 1,428 1,487 1,596 0,863 Đồ thị 2: Khả năng sinh trưởng của B.subtilis ATCC 6330 theo nhiệt độ Bảng 6: Khả năng sinh trưởng theo nhiệt độ của B.licheniformis ATCC14580 Thời gian(h) 200C 250C 300C 350C 400C 500C 0 0,085 0,095 0,103 0,127 0,118 0,103 4 0,202 0,312 0,421 0,603 0,717 0,318 8 0,421 0,854 0,962 0,958 0,997 0,501 12 0,787 1,137 1,246 1,148 1,336 0,872 16 1,025 1,235 1,357 1,524 1,627 1,018 20 1,233 1,653 1,615 1,827 1,905 1,126 24 1,301 1,982 2,153 2,278 2,183 1,406 28 1,294 1,98 2,149 2,282 2,275 1,401 32 1,265 1,953 2,138 2,189 2,267 1,382 36 1,232 1,927 2,116 2,155 2,23 1,295 40 1,198 1,876 2,02 2,131 2,205 1,231 44 1,167 1,743 1,984 1,994 2,102 1,201 48 1,123 1,65 1,968 1,887 1,997 1,197 52 1,082 1,487 1,911 1,772 1,892 1,113 56 0,968 1,364 1,833 1,695 1,798 0,872 Đồ thị 3. Khảo sát sự sinh trưởng của B.licheniformis ATCC 14580 theo nhiệt độ → Nhận xét: Qua việc khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng thuộc B. subtilis& B. licheniformis ta nhận thấy ở nhiệt 25oC, 30 oC, 35 oC,40 oC các chủng này phát triển tốt hơn so với các nhiệt độ 20 oC và 50 oC 2.3.pH Mặc dù khoảng giá trị pH mà vi khuẩn Bacillus có thể sống để sinh trưởng và phát triển được dao động rất rộng tử 6- 8,5 nhưng để tạo chế phẩm sinh học nuôi tôm chúng tôi vẫn tiến hành khảo sát giá trị pH thích nhất đối với các chủng này. Bởi vì môi trường nuôi tôm thích hợp có pH= 7-8 , cho nên nếu ở pH này mà vi khuẩn Bacillus không tồn tại được sẽ không phát huy được tối ưu các đặc tính sinh học của nó Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường peptone- glucose ở nhiệt độ t= 30oC, tốc độ lắc 150v/p, tỉ lệ tiếp giống 7%, vùng pH được lựa chọn khảo sát là từ 5,6,7,8,9. Theo dõi kết quả đo OD thu được như sau Bảng 7 : Khả năng sinh trưởng theo pH của B. subtilis ATCC 6330 Thời gian(h) pH=5 pH=6 pH=7 pH=8 pH=9 0 0,087 0,107 0,127 0,115 0,091 6 0,312 0,621 0,745 0,632 0,563 12 0,564 1,252 1,321 1,268 0,872 18 0,841 1,574 1,682 1,581 1,135 24 1,024 1,885 2,105 1,903 1,264 30 0,976 1,876 2,11 1,896 1,26 36 0,951 1,853 2,08 1,887 1,252 42 0,943 1,847 1,987 1,874 1,25 48 0,937 1,841 1,874 1,864 1,248 Đồ thị 4: Khả năng sinh trưởng theo pH của B. subtilis ATCC 6330 Bảng 8: Khả năng sinh trưởng theo pH của B. licheniformis ATCC 14580 Thời gian(h) pH=5 pH=6 pH=7 pH=8 pH=9 0 0,075 0,094 0,114 0,106 0,086 6 0,426 0,678 0,811 0,721 0,567 12 0,871 1,125 1,231 1,16 0,924 18 0,994 1,542 1,602 1,348 1,253 24 1,124 1,821 1,95 1,792 1,396 30 1,113 1,819 2,012 1,912 1,402 36 1,09 1,792 1,987 1,905 1,391 42 0,987 1,786 1,964 1,898 1,387 48 0,972 1,772 1,958 1,881 1,362 Đồ thị 5. Khả năng sinh trưởng theo pH của B.licheniformis ATCC 14580 → Nhận xét: Từ kết quả ở bảng, chúng tôi nhận thấy trong khoảng pH dao động từ 6-8 thì các chủng này đều phát triển rất tốt, ở môi trường có pH 8 thì khả năng sinh trưởng của các chủng này giảm xuống. Điều này đồng nghĩa với việc khẳng định sự có mặt của vi khuẩn Bacillus trong chế phẩm là hợp lý, kết hợp với đặc tính phân hủy chất hữu cơ của chúng sẽ cải thiện hiệu quả môi trường nước nuôi tôm, góp phần ngăn chặn dịch bệnh cho tôm. 2.4. Peptone: Để xác định ảnh hưởng của nồng độ peptone đến sự tạo thành sinh khối của vi khuẩn ta sẽ thay đổi thành phần peptone là 1g/l; 1,5g/l; 2g/l; 2,5g/l so với mẫu đối chứng là môi trường peptone –glucose chuẩn có hàm lượng peptone là 0g/l. Tiến hành nuôi ở 30oC, tốc độ lắc 150v/p. Đo mật độ tế bào ở các thời điểm 6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 36h, 42h, và 48h Bảng 9: Ảnh hưởng của peptpone đối tới khả năng sinh B.subtilis ATCC 6330 Thời gian(h) 1g/l 1,5g/l 2g/l 2,5g/l 0 g/l 0 0,06 0,071 0,087 0,097 0,043 6 0,324 0,635 0,526 0,684 0,211 12 0,512 0,813 0,918 0,823 0,408 18 0,875 1,134 1,284 1,308 0,612 24 1,107 1,318 1,456 1,525 0,911 30 1,093 1,311 1,413 1,511 0,887 36 0,976 1,298 1,389 1,483 0,864 42 0,964 1,287 1,287 1,386 0,795 48 0,951 1,274 1,265 1,322 0,781 Đồ thị 6: Ảnh hưởng của peptpone đối tới khả năng sinh trưởng của B. subtilis ATCC 6330 Bảng 10: Ảnh hưởng của peptpone đối với khả năng sinh trưởng của B. licheniformis ATCC 14580 Thời gian(h) 1g/l 1,5g/l 2g/l 2,5g/l 0 g/l 0 0,062 0,084 0,097 0,102 0,052 6 0,334 0,626 0,526 0,784 0,223 12 0,612 0,793 0,915 0,903 0,417 18 0,885 1,124 1,273 1,311 0,617 24 1,117 1,298 1,417 1,519 0,914 30 1,085 1,217 1,373 1,511 0,897 36 0,977 1,196 1,287 1,479 0,863 42 0,896 1,177 1,195 1,387 0,786 48 0,881 1,164 1,174 1,351 0,761 Đồ thị 7: Ảnh hưởng của peptpone đối với khả năng sinh trưởng của B. licheniformis ATCC 14580 → Nhận xét: Ở nồng độ peptone là 1,5g/l; 2g/l; 2.5g/l thì các chủng này phát triển tốt so với nồng độ peptone là 0g/l; 1g/l , điều này cho phép ta khoảng peptone thích hợp mà các chủng phát triển tốt là 1.5g/l đến 2.5g/l. 3. Giải bài toán tối ưu sinh khối + Bài toán đặt ra là : tối ưu hóa bằng thực nghiệm quá trình nuôi thu sinh sinh khối của các chủng Bacillus. + Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến việc thu sinh khối ta lựa chọn các yếu tố chính ảnh hưởng trực tiếp đến điều kiện thu sinh khối là : nhiệt độ, pH và peptone + Bài toán có dạng như sau: Ymax= Y(X1,X2,X3) Trong đó:Y hàm mục tiêu- lượng sinh khối thu được Ymax: lượng sinh khối lớn nhất ( là độ hấp thụ quang lớn nhất) X1: nhiệt độ ( 0C); X2: peptone ( g/l); X3: pH Miền biến thiên: X1 = 25- 40 X2 = 1,5- 2,5 X3 = 6 -8 + Chọn phương án quy hoạch: Phương án quy hoach trực giao cấp I chỉ biểu diễn sự tác động của các yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu theo dạng tuyến tính, mặt khác khi số yếu tố ảnh hưởng tăng lên k ≥ 3, thì sự tác động đến hàm mục tiêu theo dạng phi tuyến ( tức là mặt cong- hay đáp ứng bề mặt) và sau khi tiến hành thí nghiệm , kiểm tra sự tương thích của mô hình với thực nghiệm thì trong trường hợp mô hình không tương thích, ta phải chuyển sang quy hoạch trực giao cấp II. Như vậy việc lựa chọn quy hoạch trực giao cấp II là hợp lý, vừa tiết kiệm được số thí nghiệm, vừa mô tả sự tác động qua lại giữa các yếu tố đến hàm mục tiêu. Do vậy: + Phương trình hồi quy có dạng : Y= bo+ b1X1+ b2X2+ b3X3+b12X1X2+ b23X2X3+ b13X1X3+ b11X12 + b22X22 + b33X32 Trong đó: bo là hệ số hồi quy tại tâm b1,b2,b3 là hệ số tuyến tính b12, b23, b13 là hệ số tương tác b11, b22, b33 là các hệ số bậc hai Mỗi hệ số b đặc trưng cho ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thu sinh khối của Bacillus. Hệ số nào có giá trị tuyệt đối lớn nhất thì yếu tố tương ứng sẽ ảnh hưởng đến quá trình nhiều nhất + Số thí nghiệm được tiến hành N= 2k + 2k+ no Trong đó k: số yếu tố ảnh hưởng, ở đây k= 3 2k số thí nghiệm của quy hoạch trực giao cấp I 2k thí nghiệm tại các điểm sao, tức là số thí nghiệm tại các điểm giới hạn trên và giới hạn dưới của các biến ( cụ thể ở đây là: X1 = 25- 40 ; X2 = 1.5- 2.5, X3 = 6 -8 ) no: số thí nghiệm tại tâm, tâm thí nghiệm ở đây là (X1= 32,5; X2=2; X3= 7) (no: chính là số thí nghiệm lặp tại tâm, thường no= 3 đến 5, ở đây chọn no= 3) Vậy số thí nghiệm được tiến hành sẽ là N= 23 + 2×3+ 3= 17 Với sự hỗ trợ của phần mềm thiết kế thí nghiệm Desgin Expert 8.0 ta có bảng ma trận thí nghiệm như sau: + Ma trận thực nghiệm được thiết kế như sau: Bảng 11. Bảng thiết kế ma trận thực nghiệm TN Nhiệt độ (C) peptone(g/l) pH OD 620nm( 24h) 1 25 1,5 6 2 40 1,5 6 3 25 2,5 6 4 40 2,5 6 5 25 1,5 8 6 40 1,5 8 7 25 2,5 8 8 40 2,5 8 9 23,4 2 7 10 41,6 2 7 11 32,5 1,4 7 12 32,5 2,6 7 13 32,5 2 5,8 14 32,5 2 8,2 15 32,5 2 7 16 32,5 2 7 17 32,5 2 7 3.1.Tối ưu hóa mật độ sinh khối B. subtilis ATCC 6330 trên môi trường peptone- glucose + Tiến hành thí nghiệm theo ma trận thực nghiệm ta thu được kết quả như sau: Bảng 12. Mật độ sinh khối của B. subtilis ATCC 6330 tại các điểm thí nghiệm TN Nhiệt độ (C) Peptone(g/l) pH OD 620nm( 24h) 1 25 1,5 6 1,398 2 40 1,5 6 1,672 3 25 2,5 6 1,435 4 40 2,5 6 2,314 5 25 1,5 8 1,467 6 40 1,5 8 1,695 7 25 2,5 8 1,628 8 40 2,5 8 2,425 9 23,4 2 7 2,117 10 41,6 2 7 2,382 11 32,5 1,4 7 1,523 12 32,5 2,6 7 2,406 13 32,5 2 5,7 1,815 14 32,5 2 8,2 2,012 15 32,5 2 7 2,319 16 32,5 2 7 2,254 17 32,5 2 7 2,22 Nhận thấy mật độ sinh khối theo (OD) tăng trong khoảng từ 1,398 đến 2,425 tương ứng với các số nghiệm 1 và 8. Mật độ tế bào lớn nhất đạt tại 400C, peptone 2,5g/l và pH=8. Trong khi ở nhiệt độ 250C, peptone 1,5g/l và pH= 6 thì mật độ sinh khối thấp nhất. Kết quả phân tích phương sai của mô hình trong hình cho thấy cho thấy nhiệt độ và nồng độ peptone là các yếu tố ảnh hưởng mạnh đến mật độ tế bào, còn pH ảnh hưởng ít hơn. Giá trị F của mô hình là 13,41 ứng với p= 0,0012 < 0,05 cho thấy mô hình đã chọn là có nghĩa. Giá trị Lack of Fits là 0,0959 > p= 0,05 cho thấy mô hình đã chọn là phù hợp với thực nghiệm khi tiến hành thí nghiệm Hình 11: Phân tích phương sai ANOVA của mô hình tối ưu sinh khối B. subtilis ATCC 6330 Phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của các yếu tố độc lập ( A, B,C) tới mật độ tế bào biểu diễn như sau Hình 12: Phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng các yếu tố tới sinh khối B. subtilis ATCC 6330 Xem xét ảnh hưởng của từng yếu tố đến mật độ sinh khối ( 0D) đạt cực đại tại 40oC, peptone 2,5 g/l và pH=8. Xem xét sự tương tác của các cặp yếu tố tới hàm mục tiêu : sinh khối ta có thể thấy qua các đồ thị 3D- bề mặt đáp ứng. Hình 13a: Tương tác giữa nhiệt độ vàpH tới sinh khối B. subtilis ATCC 6330 Hình 13b: Tương tác giữa nhiệt độ và pH tới sinh khối B. subtilis ATCC 6330 Hình 14c: Tương tác giưa pH và peptone tới sinh khối của B. subtilis ATCC 6330 + Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu hóa mật độ tế bào trên môi trường nuôi cấy peptone – glucose bằng phần mềm quy hoạch thực nghiệm Design Expert. Kết quả ta tìm được phương án tối nhất để cực đại hàm mục tại nhiệt độ 38,49 0C, peptone 2,42 g/l, pH= 7,2; với mật độ sinh khối cực đại là 2, 587. Kết quả này có tính tương thích cao so với kết quả bằng thực nghiệm. Kết quả được trình bày trong hình sau, Hình 15: Hàm kì vọng và điều kiện tối ưu mật độ sinh khối B. subtilis ATCC 6330 2.2. Tối ưu hóa mật độ sinh khối B. licheniformis ATCC 14580 trên môi trường peptone- glucose Bảng 13: Mật độ sinh khối của B. licheniformis ATCC 14580 TN Nhiệt độ Peptone(g/l) pH OD 620nm ( 24h) 1 25 1,5 6 1,521 2 40 1,5 6 1,823 3 25 2,5 6 1,692 4 40 2,5 6 2,326 5 25 1,5 8 1,487 6 40 1,5 8 1,867 7 25 2,5 8 1,425 8 40 2,5 8 2,269 9 23,4 2 7 1,942 10 41,6 2 7 2,436 11 32,5 1,4 7 1,491 12 32,5 2,6 7 2,408 13 32,5 2 5,7 1,852 14 32,5 2 8,2 1,924 15 32,5 2 7 2,208 16 32,5 2 7 2,325 17 32,5 2 7 2,218 Nhận thấy mật độ tế bào ( theo OD) trong khoảng thí nghiệm từ 1,425 đến 2,436 tương ứng với số thí nghiệm 7 và 10. Mật độ tế bào lớn nhất tại nhiệt độ 41,60C, peptone 2 g/l và pH= 7. Trong khi ở nhiệt độ 250C, peptone 2,5g/l và pH=8, mật độ tế bào thấp nhất. Kết quả phân tích phương sai của mô hình trong hình cho thấy cho thấy nhiệt độ và nồng độ peptone là các yếu tố ảnh hưởng mạnh đến mật độ tế bào, còn pH ảnh hưởng ít hơn. Giá trị F của mô hình là 8,30 ứng với p= 0,054 p= 0,05 cho thấy mô hình đã chọn là phù hợp với thực nghiệm khi tiến hành thí nghiệm Hình 16: Phân tích phương sai ANOVA của mô hình tối ưu sinh khối B. licheniformis ATCC 14580 Phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của các yếu tố độc lập ( A, B,C) tới mật độ sinh khối biểu diễn như sau Hình 17: Phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng các yếu tố tới sinh khối B. licheniformis ATCC 14580 Xem xét ảnh hưởng của từng yếu tố đến mật độ sinh khối ( OD) đạt cực đại tại nhiệt độ 41,60C, nồng độ peptone 2g/l và pH = 7. Hình 18a: Tương tác giữa nhiệt độ và peptone tới sinh khối của B. licheniformis ATCC 14580 Hình 18b. Tương tác giữa nhiệt độ và pH tới sinh khối B. licheniformis ATCC 14580 Hình 18c. Tương tác giữa peptone và pH tới sinh khối B. licheniformis ATCC 14580 Tối ưu hóa mật độ tế bào B. licheniformis ATCC 14580 + Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu hóa mật độ sinh khối trên môi trường nuôi cấy peptone – glucose bằng phần mềm quy hoạch thực nghiệm Design Expert. Kết quả ta tìm được phương án tối nhất để cực đại hàm mục tiêu là 2,460 tại nhiệt độ là 37,420C, nồng độ peptone 2,45g/l và pH= 6,65. Kết quả này có tính tương thích cao so với kết quả bằng thực nghiệm. Kết quả được trình bày ở hình 19 Hình 19: Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu mật độ tế bào B. licheniformis ATCC 14580 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I- KẾT LUẬN + Khảo sát được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối của các chủng Bacillus: nhiệt độ, peptone, pH, thời gian. Và đã chọn được 3 yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối gồm : nhiệt độ, peptone và pH + Tối ưu hóa điều kiện thu sinh khối các chủng Bacillus cụ thể: B. subtilis ATCC 6330 đạt sinh khối ymax= 2, 587 tại nhiệt độ là 38,49 0C, peptone là 2,42 g/l và pH= 7,2 trên môi trường peptone- glucose với tỉ lệ tiếp giống 7%, tốc độ lắc 150v/p. B. licheniformis ATCC 14580 đạt sinh khối ymax= 2,460 tại nhiệt độ 37,420C, peptone 2,45g/l và pH= 6,65 trên môi trường peptone- glucose với tỉ lệ tiếp giống 7%, tốc độ lắc 150v/p. II- KIẾN NGHỊ: Để tiếp tục nghiên cứu đề tài tối ưu hóa điều kiện thu sinh khối, tôi đề nghị: + Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện tạo chế phẩm : tỉ lệ phối trộn chất mang với sinh khối, nhiệt độ sấy, chế độ sấy. Tối ưu hóa mật độ tế bào trong chế phẩm là lớn nhất. + Nghiên cứu điều kiện bảo quản chế phẩm để tăng tính ổn định của chế phẩm. + Thử nghiệm chế phẩm trên đầm nuôi tôm thực tế để kiểm tra hiệu quả của chế phẩm. PHẦN IV: TÀI LIỆU THAM KHẢO: Tài liệu tiếng việt 1. Bùi Thị Kim Anh, Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh vật để xử lý ô nhiễm nền đáy ao nuôi tôm cao sản. Luận văn ngành thạc sĩ ngành công nghệ môi trường, ĐHBK Hà Nội, 2004 2. Nguyễn Liêu Ba, La Thị Nga, Trương Ba Hùng, Nguyễn Minh Dương, Đặc điểm của một số chủng Bacillus và Lactobacillus có khả năng ứng dụng để xử lý môi trường nuôi tôm cá. Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội, 2003 3. Nguyễn Lân Dũng, Thực tập vi sinh vật, NXB Đại học và trung học chuyên nghiệp Hà Nội, 1983 4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học. NXB Giáo dục, 1997. 5. Hoàng Đình Hòa, Tối ưu hóa trong công nghiệp thực phẩm. NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, 1999 6. Trịnh Lê Hùng, Kỹ thuật xử lý nước thải, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, Hà Nội 2009 7. Đặng Đình Kim, Nguyễn Văn Năm, Lại Thị Chí, Trần Văn Tựa, Nguyễn Đức Thọ, Đặng Thanh Thủy, Lê Thu Thủy, Bùi Kim Anh, Vũ Văn Dũng, Nguyễn Văn Quyển, nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật xử lý nền đáy ao nuôi tôm cao sản, hội nghị toàn quốc về nuôi trồng thủy sản, NXB Nông nghiệp, tháng 11/2003. 8. Giang Thị Kim Liên, Bài giảng quy hoạch thực nghiệm ( các phương pháp thống kê xử lý số liệu thực nghiệm ), Đà Nẵng, 2009. 9. Trần Văn Nhân, Ngô Thị Nga, Giáo trình công nghệ xử lý nước thải, NXBKHKT, 2003. 10. Nguyễn Thanh Phương, Trần Ngọc Hải, Dương Nhựt Long, giáo trình nuôi trồng thủy sản, trường đại học Cần Thơ, khoa Thủy sản, 2009. 11. Lương Đức Phẩm, Công nghệ xử lý nước thải bằng biện pháp sinh học. NXB Giáo dục,2009 12. Bùi Quang Tề, Bệnh của tôm và biện pháp phòng trị. NXB Nông nghiệp, 2003. 13. Nguyễn Thị Tươi, Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic dùng cho nuôi tôm kinh tế và cải thiện môi trường nước nuôi tôm, Luận văn thạc sĩ khoa học ngành Công nghệ sinh học, 2005 14. Võ Thị Tứ, hoàn thiện và triển khai công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ xử lý môi trường nuôi trồng thủy sản, Báo cáo khoa học và kĩ thuật, Hà Nội, 2006. Võ Thị Tứ, Trương Ba Hùng, Nguyễn Minh Dương, La Thị Nga, Lê Thị Thu Hiền, Phạm Thị Minh Hà, Lê Doanh Tại, Nguyễn Trường Sơn, Đào Thị Thanh Xuân, Nguyễn Liêu Ba, Nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus licheniforms, Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học Biochie xử lý nước nuôi thủy sản. Tuyển tập hội thảo toàn quốc về nghiên cứu khoa học công nghệ trong nuôi trồng thủy sản, Vũng Tàu, 2004. Tài liệu nước ngoài 15. D.J.W. Moriarty, O.Decamp” Bacillus as aquaculture probiotics potential and limitations”,2010 16. L. Korsten N. Cook, “Optimizing Culturing Conditions for Bacillus Subtilis”, 1996 17. Maloy Kumar Sahu ,N.S. Swarnakumar ,K. Sivakumar ,T.Thangaradjou , L. Kannan” Probiotics in aquaculture: importance and future perspectives”,2008. 18. Nermeen A. El-Sersy, Hassan A.H. Ebrahim and Gehan M. Abou-Elela, “Response Surface Methodology as a Tool for Optimizing the Production of Antimicrobial Agents from Bacillus licheniformis SN2”, 2010. 19. Sirirat Dengripat et al, ”Effects of probiotic bacterium on black tiger shimp penaeus monodon survival and growth in Aquaculture “, 1998 20. S.C. Ng, MRCP, A.L. Hart, PhD, M.A. Kamm, MD, A.J. Stagg, PhD, and S.C. Knight, PhD, Mechanisms of Action of Probiotics: Recent Advances, 2009. 21. 22.