Tóm tắt Luận án Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể cá đối mục (mugil cephalus linnaeus, 1758) ở Việt Nam

n trong nghiên cứu đa dạng di truyền và vùng gen này đã được xác định là “mã vạch di truyền” ở cá (FISH-BOL). Thêm vào đó, theo kết quả nghiên cứu của Heras et al. (2009) cho thấy mức độ đa dạng di truyền của các quần thể cá Đối mục là khá cao từ 3,5 đến 5,9% khi nghiên cứu trên gen Cytb. Mặt khác, gen Cytb được lựa chọn sử dụng trong nghiên cứu di truyền, xác định loài vì quá trình đột biến ở gen này xảy ra chậm, tỷ lệ đột biến im lặng xẩy ra rất cao. Với những mẫu đồng hình gen Cytb là lựa chọn hữu hiệu trong việc xác định loài. 1.4.5.Một số kỹ thuật sinh học phân tử thường được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền động vật - Kỹ thuật Isozyme: là kỹ thuật nghiên cứu sự đa hình enzyme. Ưu điểm kỹ thuật này dễ sử dụng, chi phí thấp, thích hợp với các nghiên cứu xác định mức độ biến đổi di truyền ở cấp độ thấp. Ngoài ra việc kết hợp kỹ thuật isozyme với các kỹ thuật nghiên cứu đa hình DNA cho phép phân tích, so sánh những đặc tính bền vững (hoặc thay đổi) theo điều kiện khác nhau của môi trường - Kỹ thuật RAPD: là kỹ thuật phát hiện tính đa hình của DNA nhân bản ngẫu nhiên. Kỹ thuật này dễ sử dụng, thực hiện nhanh, đơn giản, giá thành thấp và không cần biết trước trình tự DNA để thiết kế mồi, DNA làm khuôn không cần độ tinh sạch quá cao và bộ mồi 6 có thể sử dụng đánh giá đa dạng di truyền với nhiều loài khác nhau. Nhược điểm RAPD là chỉ thị trội nên không thể nhận biết các cá thể dị hợp tử. - Kỹ thuật RELP: là kỹ thuật được thực hiện dựa vào độ đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn (retriction enzyme-RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. Kỹ thuật RFLP có ưu điểm là marker đồng trội nên cho phép phân biệt được các cá thể đồng hợp và dị hợp. Do kích thước DNA khảo sát trong phương pháp RFLP lớn vì vậy dấu phân tử (marker) tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Trong khi nhược điểm của kỹ thuật này là quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với người nghiên cứu (vì sử dụng chất phóng xạ), tốn thời gian, sử dụng nhiều enzyme nên kinh phí lớn. - Kỹ thuật AFLP: tương tự như kỹ thuật RAPD nhưng mồi được sử dụng gồm một phần cố định dài hơn 5bp chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn và một phần thay đổi ngắn 2- 4bp. Phần cố định dài tạo ra sự ổn định của sản phẩm được nhân lên, phần thay đổi ngắn sẽ tạo ra nhiều locus, có thể lên đến hơn 100 locus được nhân với mồi AFLP đơn. AFLP phát hiện sự khác nhau của các đoạn DNA bởi sự nhân có chọn lọc các trình tự DNA hệ gen đã được gắn với các đoạn tiếp hợp (adapter). Ưu điển kỹ thuật AFLP là sự kết hợp những ưu điểm của RFLP và RAPD nên chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự DNA của gen cần nghiên cứu, không cần sự dụng nhiều loại “primer” và khá hiệu quả trong việc phân tích đa hình một cách nhanh chóng, ổn định ít tốn kém, ít độc hại cho người thực hiện và đáng tin cậy. Tuy nhiên nhược điểm của kỹ thuật AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế sự phân biệt các cá thể đồng hợp, dị hợp, mặt khác quá trình thực hiện dài, phức tạp, tốn nhiều thời gian thực hiện. - Kỹ thuật SSR: là kỹ thuật nghiên cứu dựa trên trình tự lặp các đoạn đơn giản, đây là những trình tự ngắn (từ 2 đến 6 cặp ba zơ) có thứ tự lặp lại liên tiếp dao động từ 2 đến 40 đơn vị. Kỹ thuật SSR có tiềm năng lớn do có khả năng phát hiện tính đa hình cao, có thể xác định được sự sai khác mà không xác định được bằng các chỉ thị khác như RADP hay AFLP. Phản ứng không quá tốn kém, tiêt kiệm được thời gian và hoá chất. Vì vậy SSR là công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen cũng như lập bản đồ hệ gen ở sinh vật. SSR là loại chỉ thị đồng trội nên đã nhanh chóng thay thế AFLP và RAPD và trở thành công cụ hữu hiệu trong các ứng dụng chọn giống thực vật và nghiên cứu di truyền. Nhược điểm của kỹ thuật này là quá trình thiết kế mồi đắt, mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một locus đa hình. 1.4.6. Một số thành tựu nghiên cứu sinh học phân tử đối với cá 1.4.6.1. Thế giới Năm 2013, các nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario (Canada) đề xuất “mã vạch DNA” như là một cách để xác định loài. Với kết quả nghiên cứu của Zhao et al.(2011), Zhang et al.(2011) khi sử dụng gen CO1 phân loại các loài cá biển Trung Quốc, họ đã xác định được 121 loài cá biển với khoảng cách di truyền trung bình 15,742% giữa các loài và 0,319% giữa các cá thể trong loài. Tác giả Jumawan et al. (2011) sử dụng gen CO1 phân định 2 loài cá da trơn Pterygolichthy spardalis và Pterygolichthy disjunctivus đã định danh loài và xác định mã vạch 2 loài riêng biệt. Tiếp tục hướng nghiên cứu này, Pereira et al. (2013) đã phân tích 254 loài cá nước ngọt ở lưu vực sông Parama và xác định 7 được 252 loài bằng mã vạch di truyên với độ chính xác 99,2%. Tiếp đó khi nghiên cứu đa dạng di truyền của họ cá Đối Mugilidae của Heras et al. (2009) phân tích các đoạn gen Phenylalanine, 12S rRNA, cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1), cytochrome b (Cytb), đã xác định hai loài giống nhau về hình thái M. platanus và M. liza là hai loài riêng biệt, có quan hệ gần gũi với loài cá Đối mục (M.cephalus). Tác giả Avise et al. (1989), Ke et al. (2009), đã sử dụng gen CO1 và Cytb để nghiên cứu cá Đối mục tai khu vực biển Đài Loan và phía đông biển Hoa Đông (Trung Quốc), kết quả đã xác định được loài cá Đối mục (Mugil cephalus L.) có 3 dòng (NWP1, NWP2, NWP3) và dòng 3 (NWP3) luôn xuất hiện ở khu vực Đài Loan và biển Hoa Đông, trong khi dòng 1 (NWP1) và 2 (NWP2) là dòng di cư có thể đến từ vùng biển Nhật Bản. Mới đây, tác giả Durand et al. (2012b) xác định sự thay đổi của các giống trong họ Mugilidae bằng gen 16S và CO1, kết quả là đã xác định được họ Mugilidae có 20 giống. Cũng tác giả Durand et al. (2012a) sử dụng gen Cytb phân tích di truyền và xác định được họ Mugilidae có 25 giống (15 giống đã biết, 7 giống có sự thay đổi và 3 giống mới). Còn tác giả Polyakava et al. (2013) sử dụng gen CO1 xác định thành công mã vạch cho 9 loài cá trong giống Mugil. Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể cá Đối mục ở các vùng biển khác như Địa Trung Hải, Đại Tây Dương, Thái Bình Dương, Ấn Độ Dương được thực hiện dựa trên các chỉ thị sinh hóa của Heras et al. (2009); chỉ thị SSR (microsatellites) của tác giả Rasmussen et al. (2009) và Xu et al. (2010) các kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ đa dạng di truyền trong quần thể cá Đối mục cao nhất là 5,9% và thấp nhất là 2,7% ở vùng biển Thái Bình Dương. Kết quả nghiên cứu đã và đang phục vụ cho công tác bảo tồn loài, bảo vệ tài nguyên thiên nhiên và phát triển bền vững. 1.4.6.2.Việt Nam Nghiên cứu đa dạng di truyền về gen đối với cá biển rất hiếm và riêng với Họ Mugilidae rất ít. Năm 2003 tác giả Phạm Anh Tuấn sử dụng chỉ thị RFLP nghiên cứu biến dị của đàn cá tra Việt Nam nhằm khuyến cáo cho việc bảo tồn gen đàn cá tra nuôi ở Việt Nam. Cũng hướng nghiên cứu này tác giả Nguyễn Thu Thúy và cs., 2004 đã sử dụng 54 chỉ thị AFLP để phân tích tính đa hình tập đoàn mẫu của hai nhóm cá Tra cho thấy tỷ lệ đa hình trong đàn tương đối thấp, trung bình 1,35%. Trong khi, Nguyễn Ngọc Hoàng Anh và cs., 2005 lại sử dụng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE cho kết quả vùng gen của loài cá Nhái (Hà Tiên) và cá Lìm Kìm (Cần Thơ) khá đồng nhất và chúng đang có nguy cơ tuyệt chủng cao. Mặt khác, dựa vào phổ điện di protein các tác giả đã phân loại và đặt tên khoa học cho cá Nhái (Hà Tiên) là Hemiramphus hatienensis và cá Lìm Kìm (Cần Thơ) là Hemiramphus canthoensis. Gần đây tác giả Bùi Thị Liên Hà và cs., 2011 đã sử dụng chỉ thị SSR đánh giá đa dạng của 4 dòng cá rô phi đỏ (Orochromis spp.) nhập nội và kết quả là việc lai chéo giữa các dòng cá rô phi là giải pháp hữu hiệu cho việc tăng tính di truyền, hạn chế tác động tiêu cực của hiện tượng lai cận huyết, giữ được ưu thế lai của các dòng cá nhập nội. Với nghiên cứu của Dương Thúy Yến và cs., 2014 sử dụng gen Cytb đánh giá đa dạng di truyền cho cá rô đồng và cá rô đầu vuông (2 loài đồng hình) để xác định chính xác tên loài. Trong khi tác giả Dang Thuy Binh et al., 2012, Hoàng Kim Quỳnh, 2011-2013 đánh giá đa dạng nguồn gen di truyền bằng chỉ thị CO1 đối với 25 cá thể cá Ngựa đen 8 (Hippocampus kuda) đã xác được 7 haplotype cho loài cá Ngựa đen Việt Nam, xác định loài cá Ngựa đen Việt Nam tương đồng với loài cá Ngựa đen vùng Ấn Độ-Thái Bình Dương. Cũng chính tác giả Đặng Thúy Bình và cs., 2014 đã sử dụng gen 16S đánh giá đa dạng di truyền quần thể cá Trích tại vùng biển Việt Nam với 4 quần thể (80 cá thể) đã xác định được 31 haplotype Việt Nam. Còn tác giả Vũ Đặng Hạ Quyên và cs., 2014a lại sử dụng gen 16S để kiểm chứng nhận dạng về hình thái của 22 loài cá nước ngọt thuộc 17 giống ở Đồng bằng sông Cửu Long. Cũng như nhiều loại sinh vật khác, song song với nguồn lợi sản xuất thì việc tiến hành các nghiên cứu cơ bản (đa dạng di truyền nguồn gen, nhận dạng loài ở mức độ phân tử...) nhằm “chọn giống” vừa có năng suất, chất lượng, khả năng kháng tốt với một số loại bệnh đồng thời đánh giá bảo tồn nguồn gen của loài cần được thực hiện. Ở Việt Nam chưa có một nghiên cứu nào đề cập đến việc đánh giá đa dạng di truyền cá Đối mục phục vụ cho công tác chọn giống, bảo tồn và phát triển nhân nuôi bền vững một loài cá biển có giá trị kinh tế. CHƯƠNG II. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Thời gian và địa điểm 2.1.1. Thời gian - Ngoài thực địa: từ 7/2012 đến 6/2015 - Trong phòng thí nghiệm : thực hiện tại Phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen - Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam - 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.(trước và sau các chuyến đi thực địa) 2.1.2. Địa điểm - Thu mẫu cá bằng cách đi cùng đăng đáy với các thuyền nhỏ có công suất từ 50 đến 450 mã lực và chủ yếu sử dụng lưới kéo đáy để bắt cá. - Thu mẫu tại các chợ cá, cảng cá - Thu mẫu ở 16 tỉnh/thành phố từ Bắc đến Nam Việt Nam 2.2.Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu Mẫu cơ lưng/vây cá đối thu thập dọc biển Việt Nam được bảo quản trong ethanol từ 70%. Với 270 mẫu nghiên cứu, cụ thể 150 mẫu được xác định bằng hình thái và 120 mẫu không xác định bằng hình thái, hỗ trợ nhận dạng bằng kỹ thuật SHPT. Thông tin từ các trình tự trên Genbank được sử dụng trong luận án: KF375131, KP200024, JQ060540, JQ060553, JQ060541, JN292505, EU505089, JQ623956, EU392296, GU260294, KC500935, EU595054, JQ060284, JQ060300, JQ060285, HM628583, HM628584, HM628585, HM628586, HM628587, HM628588, HM628589, HM628590 đến HM628615 ... 2.2.2. Hóa chất, thiết bị 2.2.2.1.Hóa chất 9 Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp bởi các hãng hóa chất uy tín trên thế giới như Fementas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merck (Đức). Mồi được đặt mua của hãng Invitrogen, sử dụng Kit tinh sạch của QIAGEN 2.2.2.2. Thiết bị Thiết bị chuyên dụng hiện có tại Phòng thí nghiệm - Phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen như : máy đo pH (Đức), máy ly tâm lạnh (Nhật), máy quang phổ khả kiến Lobomed (Mỹ), tủ sấy (Pháp), bể ổn nhiệt (Đức), bộ điện di đứng (Anh), máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ) được sử dụng cho luận án này. 2..2.2.3. Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu Sử dụng cặp mồi tự thiết kế MuCF-MuCR từ vùng gen (CO1) với kích thước lý thuyết 180bp và cặp mồi MuBF-MuBR từ vùng gen (Cytb) với kích thước lý thuyết 275bp. Cặp mồi tự thiết kế sẽ xác định các mẫu cá Đối đồng hình (SL<20cm) không định loại chính xác bằng phương pháp hình thái. Lựa chọn cặp mồi CO1 (Ward et al. 2005) với kích thước lý thuyết 650bp nhân PCR với mẫu cá Đối mục được nhận dạng bằng hình thái ngoài. Lựa chọn cặp mồi Cytb (Durand et al.2012) với kích thước lý thuyết 1000bp nhân PCR với mẫu cá Đối mục được nhận dạng bằng hình thái ngoài. Phân tích đa dạng di truyền, sử dụng 12 chỉ thị SSR được công bố trên Genbank với các mã số từ HM060969 đến HM060980 2.1. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp khảo sát ngoài thực địa Phỏng vấn dân chài, đăng đáy tại khu vực khảo sát. Chụp ảnh, đánh số, đo mẫu với các chỉ số ghi nhận bởi tác giả Tessuji Nakabo. Định loại mẫu thu bằng hình thái ban đầu với sự hỗ trợ của các chuyên gia hình thái và các tài liệu chuyên ngành như Sách Đỏ Việt Nam, Động vật chí, Fao... 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm - Tách DNA tổng số từ mẫu cơ/vây cá Đối được thực hiện theo quy trình của Zang and Shi,1989 có cải tiến theo quy trình của phòng thí nghiệm. - Đo OD trên máy quang phổ khả kiến Lobomed 2700 - UVS (Mỹ) - Nhân DNA với cặp mồi quan tâm - Điện di kiểm tra trên gel agarose hoặc polyacrylamid - Thôi gel tinh sạch sản phẩm PCR - Giải trình tự gen 2.2.3.Phương pháp xử lý số liệu Phân tích đa dạng di truyền ở mức độ loài của cá Đối mục được xác định: số alen trung bình (Na), số alen hiệu quả (Ne), chỉ số đa dạng di truyền Shannon (I), hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He), hệ số khác biệt di truyền (Fst), mức độ di nhập gen (Nm) của từng chỉ thị SSR. Các số liệu thu nhận sẽ được xử lý bằng các chương trình phần mềm máy tính chuyên dụng như : ChromasPro1.7.6, Bioedit version 4.0, ClustalX version 1.81, GeneDoc 10 2.7, DNAstar, PAUP 4.0, MEGA5 version 5.1, NJ (Neighbor Joining, 1973, NTSYS 2.0, GENALEX 6.4.1 Đa dạng di truyền giữa các loài được so sánh bằng haplotype vì haplotype là một biến thể duy nhất của một gen tại cùng một locus trong bộ gen. Trong khi đa dạng nucleotide chính là việc so sánh sự khác nhau của nucleotide trong chuỗi dữ liệu của cùng một loài. CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Hiện trạng loài cá Đối mục (M.cephalus L.) Việt Nam 3.1.1. Khảo sát thu mẫu cá Đối mục Việt Nam Với 19 chuyến nghiên cứu thực địa thu mẫu cá Đối dọc biển Việt Nam trong thời gian từ tháng 7/2012 đến tháng 6/2015, NCS đã thu thập được tổng số 1.017 mẫu cá Đối thuộc họ Mugilidae từ 16 tỉnh/thành phố của Việt Nam, đã xác định được 162 mẫu (chiếm 15,9%) là cá Đối mục (M. cephalus L.). Vị trí các điểm khảo sát và thu được mẫu cá Đối mục được trình bày chi tiết ở bảng 3.1 Bảng 3.1. Điểm thu mẫu và tần suất bắt gặp cá Đối mục ở Việt Nam TT Nơi thu Số điểm khảo sát Họ Mugilidae Mugil cephalus Tỷ lệ (%) 1 Quảng Ninh 6 55 37 67,3 2 Hải Phòng 7 114 13 11,4 3 Nam Định 9 86 42 48,8 4 Hà Nội 2 12 6 50,0 5 Hà Tĩnh 3 11 2 18,2 6 Quảng Bình 6 59 9 8,5 7 Thừa Thiên Huế 5 16 6 37,5 8 Phú Yên 3 45 4 8,9 9 Bà Rịa Vũng Tàu 4 18 9 50,0 10 Thành phố HCM 4 23 9 39,1 11 Cần Thơ 8 32 15 46,9 12 Kiên Giang 27 388 10 3,0 13 Nghệ An 3 73 0 0 14 Khánh Hòa 6 41 0 0 15 Bạc Liêu 3 29 0 0 16 Cà Mau 3 15 0 0 Tổng cộng 99 1.017 162 15,9 3.1.2. Một số đặc điểm hình thái loài cá Đối mục (M.cephalus) Việt Nam Tên khoa học: Mugil cephalus Linnaeus, 1758 Tên tiếng Anh là Flathead grey mullet Tên Việt Nam: cá Đối mục Đặc trưng hình thái: Kết quả đo mẫu (n=20) cá Đối mục có chỉ số đo trung bình như sau: SL = 260 - 620 mm; HL = 62 - 110 mm; HB = 65 mm; O = 9,32 – 22 mm; OO = 27,84 -53 mm. D1.V; D2.VIII (I,7); A.8; P.16; V.I,5; C.14; Squ.38-42; số lượng vảy quanh cuống đuôi = 9. Vert.24. 11 Mô tả: (hình 3.1) Thân dài, hình thoi, phần giữa hơi tròn, phần đuôi dẹp bên. Đầu tương đối ngắn, đỉnh đầu bằng phẳng. Mõm hơi rộng nhưng ngắn. Mắt tròn và lớn vừa. Màng mỡ mắt đặc biệt phát triển, rất dày, che lấp cả mắt chỉ trừ con ngươi. Môi trên rất dày, môi dưới mỏng. Phía trước của hàm dưới có một gai thịt tương đối lớn. Môi trên có một vài hàng răng nhỏ.Vây lưng có 2 cái, khởi điểm của vây lưng thứ nhất nằm gần ngang mút vây ngực, khởi điểm của vây lưng thứ hai nằm sau khởi điểm của vây hậu môn. Vây ngực ngắn, không đạt đến khởi điểm của vây lưng thứ nhất, vây ngực nằm 2 bên thân. Gốc vây ngực có vảy nách. Vây bụng rộng và dài. Vây hậu môn có 8 tia vây mềm. Vây đuôi dạng chẻ, chia thành hai thùy. Vảy đường bên có 38 – 42 chiếc. Bên thân có 6 – 7 sọc nâu chạy dọc thân. Là loài duy nhất trong họ cá đối có 24 đốt sống, trong khi các loài khác có từ 25->35 đốt sống. Lưng màu xanh nhạt, mặt bụng màu sáng bạc. Dài thân tối đa 62 cm, trọng lượng trung bình 350g, lớn nhất 3kg. Hình 3.1. Mẫu cá Đối mục Việt Nam Theo công bố 2015 của FAO về phân bố của loài cá Đối mục (M.cephalus L.), Việt Nam là một trong 121 quốc gia trên thế giới được xác nhận có loài cá Đối mục. 3.2. Kết quả nghiên cứu giải mã vùng gen CO1 và Cytb 3.2.1. Tách DNA tổng số Quy trình tách DNA tổng số từ mẫu cơ lưng hoặc vây bụng cá Đối mục được thực hiện theo quy trình của Zang and Shi, 1989 có cải tiến với thành phần đệm chiết, tinh sạch DNA bằng bộ kít Genomic DNA Purification kit (#KO512, Fermentas). Xác định nồng độ DNA bằng máy quang phổ hấp thụ (Labormed – Mỹ) ở bước sóng 260nm và 280nm, nồng độ DNA của 270 mẫu cá đối dao động từ 650-100 ng/µl. Tỷ lệ OD260/OD280 thể hiện độ tinh sạch của các mẫu DNA dao động từ 1,82 đến 2 (số liệu không chỉ ra ở đây). Kết quả trên khẳng định các mẫu DNA tách chiết được hoàn toàn đủ tiêu chuẩn cho những phân tích tiếp theo. Hình 3.2 kết quả tách DNA một số mẫu đại diện. Hình 3.2. Hình ảnh DNA tổng số đại diện của một số mẫu cá Đối 3.2.2. Kết quả xác định nhanh loài cá Đối mục với 2 cặp mồi MuCF-MuCR và MuBF- MuBR Thực hiện phản ứng PCR từ 120 mẫu (đồng hình) với 2 cặp mồi ngắn MuBF- MuBR và MuCF-MuCR dùng để xác định nhanh loài cá Đối mục bằng kỹ thuật PCR phức. Với 120 cá đối (SL<20cm), mẫu không xác định được loài bằng hình thái ngoài (đồng hình), sau khi nhân PCR với các cặp mồi phức MuBF-MuBR và MuCF-MuCR đã xác định 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 12 34/120 mẫu có thể là cá Đối mục, với tỷ lệ thành công 28%, cách làm này giảm chi phí và thời gian thực nghiệm. 3.2.3. Kết quả giải mã vùng gen CO1 Nhân gen đích: Các mẫu cá đối thu thập được, bước đầu đã xác định tên loài bằng hình thái hoặc nhân PCR với mồi tự thiết kế cho kết quả là cá Đối mục sẽ được lựa chọn nhân gen đích, giải trình tự gen với cặp mồi CO1 (Ward et al, 2005) để xác định tên loài. Việc lựa chọn 184 mẫu (150 mẫu định tên bằng hình thái và 34 mẫu định tên bằng kỹ thuật SHPT) tiếp tục nhân gen với mồi CO1, kết quả đã nhân thành công với mẫu nghiên cứu đạt kích thước là 650bp đúng như kích thước lý thuyết của mồi. Từ kết quả sản phẩm PCR của 184 mẫu được lựa chọn (nhân gen CO1) được tinh sạch và gửi đọc trình tự. Kết quả giải trình tự: Các đỉnh huỳnh quang thu được rất rõ, tương ứng với từng loại nucleotit cụ thể. Với 184 mẫu nhân gen CO1 được BLAST trên NCBI và so sánh với 10 trình tự (loài tương tự) đã công bố trên Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov), kết quả 184 mẫu giải trình tự đã xác định được 162 mẫu có mức tương đồng 99 -100% mẫu cá đối mục (M. cephalus L.) được công bố trên ngân hàng Genbank với các mã hiệu JQ060540 = NWP1, JQ060553 = NWP2, JQ060541 = NWP3. Xây dựng cây phát sinh chủng loại : Với 184 mẫu nghiên cứu chỉ xác định được 162 mẫu là cá Đối mục. Cá Đối mục Việt Nam thuộc 3 dòng NWP1, NWP2, NWP3 và 22 mẫu không phải loài cá Đối mục đã xác định thuộc 5 giống khác nhau (Liza, Ellochelon, Valamugil, Molgarda, Paramugil) trong họ Mugilidae. Sử dụng kỹ thuật SHPT đã xác định được chính xác 162 mẫu là cá Đối mục, cụ thể: 150 mẫu xác định bằng hình thái là cá Đối mục, được kiểm chứng bằng cặp mồi CO1 (Ward et al.2005), khẳng định chỉ có 139/150 mẫu là cá Đối mục (mức tương đồng 92,7%) và 34 mẫu không xác định được bằng phương pháp hình thái nhưng đã sử dụng nhân gen với cặp mồi thiết kế MuBF-MuBR và MuCF-MuCR để hỗ trợ nhận dạng nhanh (có thể là cá Đối mục) những mẫu này khi xác định bằng cặp mồi CO1 (Ward et al.2005) đã xác định được 23/34 mẫu là cá Đối mục (67,6%). So sánh mối quan hệ họ hàng của 162 mẫu cá Đối mục Việt Nam, nhận thấy mẫu nghiên cứu được phân thành 3 nhóm tương ứng với 3 dòng cá Đối mục, cụ thể : dòng NWP1 gồm 60 mẫu thu từ 9/12 tỉnh/thành phố có mẫu cá Đối mục tương ứng với 3 khu vực Vịnh Bắc Bộ, miền Trung, miền Nam; tiếp đến dòng NWP2 gồm 54 mẫu thu từ 8/12 tỉnh có mẫu cá Đối mục tương ứng với 3 khu vực Vịnh Bắc Bộ, miền Trung, miền Nam; cuối cùng là dòng NWP3 gồm 48 mẫu thu từ 8/12 tỉnh có mẫu cá Đối mục tương ứng với 3 khu vực Vịnh Bắc Bộ, miền Trung, miền Nam. Các mẫu thuộc dòng NWP1 đều có trình tự nucleotide giống nhau 100%, trong khi các mẫu thuộc dòng NWP2 chỉ ra 16 vị trí biến đổi nucleotide và các mẫu thuộc dòng NWP3 là 31 vị trí. Cây phát sinh chủng loại (hình 3.3) với 162 mẫu cá Đối mục Việt Nam, trong đó 60 mẫu cá Đối mục (dòng NWP1) mẫu thu nằm rải rác từ Bắc đến Nam Việt Nam (9/12 tỉnh), không ghi nhận mẫu cá Đối mục nào ở tỉnh Hà Tĩnh, Phú Yên và Cần Thơ, mẫu thu được nhiều nhất của dòng này ở Quảng Ninh 33/60 mẫu và ít nhất ở Thừa Thiên Huế 1/60. Tiếp đến 54 mẫu cá Đối mục (dòng NWP2) cũng không ghi nhận mẫu cá Đối mục nào thu được từ Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh, Cần Thơ và Kiên Giang, mẫu thu được nhiều nhất của 13 dòng này ở Nam Định 20/54 mẫu và ít nhất ở miền Trung (Quảng Bình, Thừa Thiên Huế, Phú Yên) mỗi tỉnh chỉ có 1 mẫu. Cuối cùng là 48 mẫu cá Đối mục (dòng NWP3) không có ghi nhận nào mẫu cá Đối mục ở Hải Phòng, Hà Nội, Hà Tĩnh và Thành phố Hồ Chí Minh, mẫu thu được nhiều nhất của dòng này ở Cần Thơ 15/48 mẫu và ít nhất ở Quảng Ninh, Quảng Bình và Bà Rịa Vũng Tàu mỗi tỉnh chỉ có 1 mẫu. Hình 3.3. Mối quan hệ họ hàng của 162 mẫu cá Đối mục Việt Nam với các mẫu tương tự công bố trên Genbank khi phân tích Maximum parsimony với vùng gen CO1. Số ở gốc là giá trị bootstrap. 3.2.4. Kết quả giải mã vùng gen Cytb Nhân gen đích: Với 184 mẫu sử dụng nhân gen CO1 được tiếp tục kiểm chứng với cặp mồi Cytb (Durand et al, 2012) để xác định tên loài. NCS sử dụng 184 mẫu nhân gen với mồi Cytb, kết quả sản phẩm PCR đã nhân đạt kích thước là 1000bp đúng như kích thước lý thuyết của mồi. Từ kết quả trên cho thấy sản phẩm PCR nhân với cặp mồi Cytb được tiếp tục lựa chọn để giải trình tự nucleotide. Kết quả giải trình tự: Các đỉnh huỳnh quang thu được rất rõ, tương ứng với từng loại nucleotit cụ thể. Với 184 mẫu nhân gen Cytb được BLAST trên NCBI và so sánh với 10 trình tự đã công bố trên Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov), kết quả 184 mẫu giải trình tự xác định được 162 mẫu có mức tương đồng 99 -100% mẫu cá Đối mục được công bố trên ngân hàng Genbank với các mã hiệu JQ060284 = NWP1, JQ060300 = NWP2, JQ060285 = NWP3. Kết quả chi tiết không chỉ ra ở đây, tên 162 mẫu nhân gen Cytb trùng tên 162 mẫu xác định bằng chỉ thị CO1. T 1 4 S2 W 1 9 Q37 14 A B C Hình 3.4. Mối quan hệ họ hàng của 162 mẫu cá Đối mục nhân gen Cytb, (hình ảnh nhóm 1(A), nhóm 2 (B), nhóm 3 (C) trên cơ sở phân tích NJ, số ở gốc là giá trị bootstrap) Xây dựng cây phát sinh chủng loại : Với 184 mẫu nghiên cứu chỉ xác định được 162 mẫu là cá Đối mục. Kết quả so sánh trình tự vùng gen Cytb của 162 mẫu cá Đối mục được thể hiện trong hình 3.4, với 162 mẫu cá Đối mục Việt Nam được chia thành 3 nhóm : nhóm 1 (hình 3.4A) tưng ứng với dòng NWP1 (60 mẫu); nhóm 2 (hình 3.4B) tương ứng với dòng NWP2 (54 mẫu); nhóm 3 (hình 3.4C) tương ứng với dòng NWP3 (48 mẫu). Dòng NWP1 không có sự sai khác hay đột biến nucleotide nào, trong khi dòng NWP2 có 39 vị trí biến đổi so với dòng NWP1 và dòng NWP3 có 51 vị trí biến đổi so với dòng NWP1. Mặt khác khi so sánh giữa 2 dòng NWP2 và NWP3 cũng đã chỉ ra được 58 vị trí sai khác nucleotide. Khi so sánh trình tự vùng gen Cytb với 162 mẫu cá Đối mục nghiên cứu nhận thấy có nhiều vị trí nucleotide biến đổi hơn khi phân tích cùng mẫu này với vùng gen CO1, điều này có thể cho biết vùng gen Cytb có tính bảo thủ cao hơn vùng gen CO1. Mẫu cá Đối mục Việt Nam thuộc 3 dòng (NWP1, NWP2, NWP3) trong nghiên cứu này đều phù hợp với công bố của Durand et al., 2012a. Cụ thể: dòng NWP2 tương đồng với mẫu JQ060300 ở Đảo Hải Nam Trung Quốc với mã hiệu mẫu Mugil sp.I; dòng NWP3 tương đồng với mẫu JQ060285, JQ060316, EU083898, AM265627 phân bố ở Đảo Hải Nam và Đài Loan phù hợp với công bố gần đây của Durand and Borsa., 2015 về các dòng cá Đối mục với mã hiệu Mugil sp.L và dòng NWP1 tương đồng với mẫu công bố ở Bắc Thái Bình Dương và biển Nhật Bản với mã hiệu Mugil sp.C. Tác giả Shen et al., 2011 cho rằng nhiệt độ bề mặt nước biển sẽ tác động mạnh đến phân bố hiện tại của cá đối mục và còn nhiều còn bí ẩn cũng như các dòng chảy đại dương hiện nay tác động đến phân bố của 3 dòng NWP1, MWP2, NWP3. Điều này cũng phù hợp nghiên cứu về dòng chảy bề mặt đại dương khu vực Biển Đông theo gió mùa của tác giả Đặng Thúy Bình, 2014. 15 Cá Đối mục Việt Nam có 3 dòng NWP1, NWP2 và NWP3, đối chiếu với công bố mới đây, dòng NWP1 được cho là dòng có nguồn gốc ôn đới, ở Việt Nam chia theo vùng địa lý thì (vùng 61) được cho là vùng ôn đới giới hạn từ Bắc Vịnh Bắc Bộ đến Mũi đèo Cả (Phú Yên), mẫu cá Đối mục đại diện cho dòng NWP1 thuộc khu vực Vịnh Bắc Bộ gồm các tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Nam Định; khu vực miền Trung gồm các tỉnh Quảng Bình, Thừa Thiên Huế; khu vực miền Nam gồm các tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu, Thành phố Hồ Chí Minh, Kiên Giang; kết quả nghiên cứu chỉ ra khu vực tỉnh Hà Tĩnh, Phú Yên Cần Thơ không có mẫu cá Đối mục nào thuộc dòng này. Trong khi dòng NWP2 được cho là dòng nhiệt đới thuộc (vùng 71) nghĩa là từ Phú Yên trở vào miền Nam, dòng NWP2 có mẫu cá Đối mục ở Vịnh Bắc Bộ (Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định), khu vực miền Trung (Hà Tĩnh, Quảng Bình, Thừa Thiên Huế, Phú Yên), khu vực miền Nam (Vũng Tàu); còn dòng NWP3 được coi và giao thoa giữa dòng NWP1 và NWP2 có nguồn gốc ôn đới và nhiệt đới có số lượng mẫu không nhiều nhưng ghi nhận về tần xuất xuất hiện ở cả 3 khu vực: Vịnh Bắc Bộ (Quảng Ninh, Nam Định), miền Trung (Phú Yên, Thừa Thiên Huế, Quảng Bình) và miền Nam Việt Nam (Kiên Giang, Cần Thơ, Vũng Tàu). 3.3. Bổ sung hoàn thiện khóa định loại các giống thuộc họ Mugilidae Việt Nam Xây dựng khóa định loại cho họ Mugilidae Việt Nam với 8 giống như sau: 1 (2).Vây ngực mầu đen, vây đuôi dạng bằng có màu vàng.. Ellochelon 2 (1). Vây ngực không có mầu đen, vây đuôi chẻ và không có mầu Vàng ................... 3 3 (4) Gốc vây ngực có một vệt mầu xanh đen, màng mỡ mắt rất phát triển ................ Mugil 4 (3) Gốc vây ngực không có vệt mầu xanh đen, màng mỡ mắt ít phát triển.... ................. 5 5 (6) Gốc vây ngực có 1 điểm chấm đầu vây ....................................................................... 7 6 (5) Gốc vây ngực không có 1 điểm chấm đầu vây............................................................ 9 7 (8) Chiều dài vây ngực (dọc thân) bằng chiều dài đầu ..... Paramugil 8 (7) Chiều dài vây ngực (dọc thân) không bằng chiều dài đầu ............................. Molgarda 9 (10) Vây ngực có vảy nách ...............................................................................................11 10 (9) Vây ngực không có vẩy nách ....................................................................................13 11(12) Môi trên mỏng và có nhiều ria thịt ........................................................... Crenimugil 12 (11) Môi không có ria thịt .............................................................................. Valamugil 13 (14) Mút cuối xương hàm dưới cong đột ngột, viền dưới không có răng cưa .......... Liza 14 (13) Mút cuối xương hàm dưới cong đột ngột, viền dưới có răng cưa .................. Chelon 3.4. Đa dạng di truyền cá Đối mục Việt Nam 3.4.1. Đa dạng vùng sinh thái Lựa chọn 110/162 mẫu cá Đối mục đại diện các điểm thu để tiếp tục đánh giá về di truyền và biến đổi của các loài trong 3 dòng NWP1, NWP2, NWP3. Dòng NWP1 cá Đối mục xuất hiện 9/12 tỉnh trừ 3/12 tỉnh là Cần Thơ, Phú Yên, Hà Tĩnh không có ghi nhận mẫu cá Đối mục nào; dòng NWP2 xuất hiện 8/12 tỉnh trừ Hà Nội, Tp Hồ Chí Minh, Kiên Giang và Cần Thơ; dòng NPW3 chỉ xuất hiện 8/12 tỉnh, không có ghi nhận nào của dòng này với mẫu thu ở Hà Nội, Hải Phòng, Hà Tĩnh, Tp Hồ Chí Minh. Rất khó lý giải về sự dịch chuyển của các dòng NWP1, NWP2, NWP3 trong khu vực Biển Đông, thực tế cho thấy nhóm có nguồn gốc ôn đới (dòng NWP1) xuất hiện phổ 16 biến ở Vịnh Bắc Bộ, Vịnh Thái Lan hiện tại chúng tôi chưa tìm ghi nhận mẫu nào thuộc nhóm NWP1 ở khu vực Hà Tĩnh và Phú Yên (miền Trung). Tương tự với nhóm có nguồn gốc nhiệt đới (dòng NWP2) các mẫu thuộc nhóm này xuất hiện trong phổ khá rộng từ Vịnh Bắc Bộ (Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định), miền Trung (Hà Tĩnh, Quảng Bình, Thừa Thiên Huế, Phú Yên), miền Nam (Bà Rịa Vũng Tàu, Kiên Giang). Dòng NWP3 được coi là nhóm giao thoa giữa dòng NWP1 và NWP2 hay là những mẫu cá giao thoa giữa ôn đới và nhiệt đới, những mẫu thuộc dòng này được phát hiện nhiều nhất trong khu vực Vịnh Thái Lan (Kiên Giang), Cần Thơ, ngoài ra còn tìm thấy ở Bà Rịa Vũng Tàu (miền Nam), Thừa Thiên Huế, Quảng Bình (Miền Trung), Nam Định và Quảng Ninh (miền Bắc). Số lượng mẫu cá Đối mục thuộc dòng NWP3 không nhiều chỉ chiếm 31,8% tổng số mẫu nghiên cứu. 3.4.2. Đa dạng haplotype 3.4.2.1.Vùng gen CO1 Đa dạng haplotype được thực hiện với loài cá Đối mục Việt Nam khi so sánh với vùng gen CO1, nhận thấy hầu hết các haplotype quan sát thấy trong các mẫu cá Đối mục Việt Nam (NWP1, NWP2, NWP3) phù hợp với những công bố của Ke et al., 2009. Phân tích với vùng gen CO1, trong 10 haplotype quan sát thấy xuất hiện trong loài cá Đối mục Việt Nam (hình 3.5A) đã xác định được 3 haplotype đặc hữu của Việt Nam (HT37, HT38, HT39) và 3 haplotype này đều thuộc dòng NWP1. Ba haplotype (HT37, HT38, HT39) có quan hệ chặt chẽ với haplotype HT2 và là haplotype đặc trưng dòng NWP1 (Ke et al., 2009). Tương tự các haplotype dòng NWP2 (HT17, HT17*, HT20, HT24, HT25) và NWP3 (HT32) phù hợp với công bố của Ke et al., 2009. 3.4.2.2.Vùng gen Cytb Đa dạng haplotype được thực hiện với loài cá Đối mục Việt Nam khi so sánh với vùng gen Cytb cho kết quả là trong số 25 haplotype xác định cho loài cá Đối mục Việt Nam (hình 3.5B), trong đó 10 haplotype không quan sát thấy trong khu vực Tây Bắc Thái Bình Dương, haplotype (H45 đến H54) không tương ứng với bất kỳ haplotype đã được mô tả trước đó của Shen et al. (2011). Cụ thể: dòng NWP1 có 4 haplotype (H48, H49, H50, H51), dòng NWP2 có 3 haplotype (H45, H46, H47), dòng NWP3 có 3 haplotype (H52, H53, H54). Các haplotype cá Đối mục Việt Nam thuộc dòng NWP1 có quan hệ chặt chẽ với haplotype H26, H27, H29, H31; dòng NWP2 có quan hệ chặc chẽ với haplotype H22, H19-16-3; dòng NWP3 có quan hệ chặt chẽ với haplotype H26-29-31, H34-H43. Haplotype mẫu cá Đối mục Việt Nam từ H44 đến H47 có liên quan chặt chẽ với dòng NWP2 với haplotype H22 và H19-16-3 có nguồn gốc biển Thái Bình Dương, trong khi H48 đến H51 có liên quan chặt chẽ đến H26-29-31 và H52 để H54 có liên quan đến H34- H43. So sánh với công bố của Shen et al., 2011 chúng tôi đã xác định được 1-7 đột biến với cùng loài trong khu vực Tây Bắc Thái Bình Dương. 17 Hình 3.5. Các mối quan hệ phát sinh loài khi phân tích với vùng gen CO1 (A) và Cytb (B) (Dòng đầu tiên ký hiệu tỉnh có mẫu cá Đối mục - 1: Quảng Ninh, 2: Hải Phòng, 3: Nam Định, 4: Hà Nội, 5: Hà Tĩnh, 6: Quảng Bình, 7: Thừa Thiên Huế, 8: Phú Yên, 9: Bà Rịa Vũng Tàu, 10: Thành phố Hồ Chí Minh, 11: Cần Thơ, 12: Kiên Giang; Haplotype các mẫu cá Đối mục Việt Nam khi nhân gen CO1 ký hiệu HT, trong khi cũng mẫu này nhân gen Cytb được ký hiệu H. Cây phát sinh được xây dựng bằng phương pháp ML, với giá trị bootstrap từng nhánh trên 70%) Không có minh chứng rõ ràng nào về khu vực ngăn cách hay ảnh hưởng của các dòng hải lưu trong khu vực Biển Đông. Vì vậy cả 3 dòng NWP1, MWP2, NWP3 cá Đối mục Việt Nam có gen đồng nhất trên phạm vi địa lý rộng và cũng có thể lý giải việc dòng NWP1 đã di chuyển từ vùng biển Nhật Bản đến vùng biển Đài Loan và Biển Đông để sinh sản. Nhưng ghi nhận về phân bố của loài cũng như các khu vực phân bố của 3 dòng NWP1, NWP2 và NWP3 đặt ra giả thiết là nguồn gốc của ba dòng NWP1, MWP2, NWP3 bắt nguồn từ sự tồn tại của một khu vực băng giá như tác giả Ke et al., 2009 đã ghi nhận và việc mở rộng số lượng cá thể vượt qua khỏi các vùng phân bố truyền thống có thể liên quan đến sinh cảnh, di cư, dòng chảy, nhiệt độ nước bề mặt ... Khu vực Biển Đông vẫn còn rất ít các nghiên cứu về cá biển nói chung và loài cá Đối mục nói riêng. Các kết quả nghiên cứu gần Việt Nam nhất là nghiên cứu của tác giả Sun et al. (2011) khi đánh giá đa dạng nguồn gen quần thể cá Đối mục phía Bắc và phía Nam đảo Hải Nam (Trung Quốc) bằng chỉ thị CO1, đã xác định được 33 haplotype đặc trưng cho 2 khu vực Bắc và Nam đảo Hải Nam từ 84 mẫu cá Đối mục nghiên cứu. Kết quả công bố của Eleanor et al. 2007; Phạm Văn Ninh và cs., 2009; Đặng Thúy Bình và cs., 2014 về dòng chảy khu vực Biển Đông thì hiện tượng gió mùa, thủy triều, nồng độ muối có thể là những nhân tố ảnh hưởng đến di cư, cấu trúc quần thể đàn. Một nguyên nhân khác 18 gây ảnh hưởng đến di cư của đàn cá biển là do biến đổi khí hậu, nhiệt độ tăng cao, mực nước biển dâng, bão, lũ ... Kết quả phân tích đã dạng di truyền từ 110 mẫu cá Đối mục Việt Nam với 2 vùng gen CO1 và Cytb, so sánh kết quả công bố của Việt Nam với công bố của Chen et al., 1986; Ke et al., 2009; Durand & Borca, 2015 một lần nữa cho thấy cá Đối mục Việt Nam thuộc 3 dòng NWP1, NWP2, NWP3 hiện diện dọc biển Việt Nam với dòng NWP1 khá phổ biến, dòng NWP2 xuất hiện chủ yếu ở Vịnh Bắc Bộ trong khi Shen et al., 2011 cho rằng dòng NWP2 chỉ có ở khu vực Tây Bắc Thái Bình Dương phân vùng theo dòng chẩy và địa lý. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền cá biển Việt Nam là hiếm, ghi nhận của chúng tôi khi tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền Đối mục Việt Nam với quy mô sâu, cố gắng tìm hiểu sự tiến hóa loài và những nguyên nhân biến đổi đa dạng sinh học ở Biển Đông. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã phần nào khỏa lấp những thiếu hụt về nghiên cứu tại Biển Đông nói chung cũng như điểm nóng sinh học biển Châu Á vẫn chưa được khám phá. Đánh giá đa dạng di truyền dọc biển Việt Nam đối với loài cá Đối mục chúng tôi cho rằng: cá Đối mục Việt Nam thuộc 3 dòng NWP1, NWP2, NWP3 và được cho là phù hợp với loài này tại khu vực Tây Bắc Thái Bình Dương, không có sự biến đổi gen hay thoái hóa gen. Theo Shen et al., 2011 dòng NWP1 xuất hiện ở phía bắc khu vực Tây Bắc Thái Bình Dương, biển Nhật Bản và biển Đông Trung Quốc; dòng NWP2 phân bố dọc theo dòng chẩy Kuroshio (Từ biển Thái Bình Dương-Nhật Bản-Pilippin); dòng NWP3 có phân bố hẹp hơn, chỉ giới hạn trong khu vực Tây Bắc Thái Bình Dương (Đài Loan, đảo Hải Nam) và theo Durand et al., 2012a dòng NWP3 đã xuất hiện ở khu vực New Caledonia và Fiji. Còn tác giả Shen et al., 2011 lại cho rằng các loài cá xuất hiện trong khu vực Tây Bắc Thái Bình Dương đều có liên quan mật thiết với nhiệt độ. Tác giả Shen et al., 2011 cho rằng với nhiệt độ từ 19-21oC có thể là dòng ôn đới, khi nhiệt độ tăng lên từ 28-30oC có thể là dòng nhiệt đới. Trong khi Durand et al., 2012b cho rằng dòng NWP3 xuất hiện cả ở bán cầu bắc và bán cầu nam, chính sự phân bố của loài không theo tính nhiệt đới hay nhiệt độ đã tạo ra sự tranh luận về nguồn gốc nhóm loài và đa dạng di truyền nguồn gen cho từng dòng. Các kết quả nghiên cứu thực tế cho thấy sự phức tạp và sự thật là cả 3 dòng (NWP1, NWP2, NWP3) đều hiện diện tại vùng Biển Đông. Chính từ kết quả nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy cả 3 dòng NWP1, NWP2, NWP3 được duy trì trên phạm vi địa lý rộng, cụ thể dòng NWP1 được cho là dòng có nguồn gốc ôn đới xuất hiện ở Vịnh Bắc Bộ và miền Nam Việt Nam, còn với Chen et al, 1986 thì dòng NWP1 có thể di chuyển từ Bắc đến Nam Việt Nam và có thể sinh sản tại vùng biển Đài Loan (cùng dòng NWP3). Kết quả nghiên cứu Shen et al., 2011 khi sử dụng chỉ thị microsatellite phân tích đa dạng di truyền nguồn gen cho thấy sự tương đồng về gen của cá Đối mục trong cả 3 dòng NWP1, NWP2, NWP3 ở khu vực biển phía Đông Trung Quốc và khu vực Đài Loan. 19 Hình 3.6. Cây phát sinh các dòng cá Đối mục được xây dựng bằng phương pháp ML. Chúng tôi cho rằng sự di chuyển của loài cá Đối mục có liên quan đến khu vực Tây Bắc Thái Bình Dương vì ranh giới biển với “Pleistocene” khi mực nước biển hạ thấp do biến đổi khí hậu, địa lý. Cuối kỷ băng hà mực nước biển hạ thấp kỷ lục và cá Đối mục đã mở rộng phạm vi điều này phù hợp với những tín hiệu tăng về quần thể quan sát được của các nhà nghiên cứu gần đây. Do vậy cơ cấu đàn, quần thể cá Đối mục không thể xác định được vì phụ thuộc vào trạng thái trôi dạt và cân bằng. Trong nghiên cứu này, sự đa dạng của cá Đối mục Việt Nam rất phức tạp, sự phân bố 3 dòng (NWP1, NWP2, NWP3) tại Việt Nam chồng chéo lên nhau, nhiệt độ bề mặt nước biển dọc bờ biển Việt Nam có lẽ không phải là một giới hạn sinh lý cho bất kỳ nguồn gốc của ba nhóm trên. Kết quả nghiên cứu định tên chính xác 162 mẫu cá Đối mục Việt Nam, chúng tôi lựa chọn 3 mẫu đại diện cho 3 dòng (NWP1, NWP2, NWP3) để tiếp tục so sánh với các mẫu cùng dòng này được công bố tại vùng Tây Bắc Thái Bình Dương (Shen et al., 2011), Đông Bắc Đại Tây Dương, Địa Trung Hải (Durand & Borsa, 2015), xây dựng bằng phương pháp Maximum-likelihood (ML) phân tích từ 1569 nucleotide liên kết của 2 vùng gen CO1 và Cytb. Trên thế giới giống Mugil được xác định có 13 dòng (ký hiệu lần lượt là Mugil spp.A, B, C, D, E, F, J, I, L, Q, G, H, K), được định tên, mã hiệu loài Mugil sp. A, B, D, J, G và Q thuộc nhóm phía đông bắc Đại Tây Dương và Địa Trung Hải; loài Mugil sp.C = dòng NWP1 thuộc Thái 20 Bình Dương; loài Mugil sp.I = dòng NWP2 thuộc Thái Bình Dương; loài Mugil sp.L = dòng NWP3 thuộc Thái Bình Dương; loài Mugil sp.E thuộc dòng Đại Tây Dương; loài Mugil sp.F, H, K thuộc dòng Ấn Độ Dương (Durand & Borsa 2015). Giá trị bootstrap cho các dòng cá Đối thể hiện trên hình 3.6 đạt trên 75%. Mẫu cá Đối mục Việt Nam thuộc dòng NWP1 tương đồng với mẫu cùng loại thu tại Đài Loan và Chi Lê 100%. Mẫu cá Đối mục Việt Nam thuộc dòng NWP2 giống 100% mẫu cùng loài thu tại phía đông vùng biển Trung Quốc, Đài Loan và Nhật Bản. Mẫu cá Đối mục Việt Nam thuộc dòng NWP3 giống 98% mẫu cùng loại thu tại Đài Loan, Fiji, New Caledonia. 3.4.3. Khoảng cách di truyền So sánh trình tự nucleotide 110 mẫu cá Đối mục Việt Nam với 2 vùng gen CO1 và Cytb, nhận thấy mức độ tương đồng nucleotide các loài có quan hệ di truyền rất gần nhau từ 0 đến 0,27 (gen CO1); từ 0 đên 0,43 (gen Cytb), như vậy hệ số di truyền với 2 gen CO1 và Cytb đều < 0,5. Chỉ số đa dạng di truyền đã phản ánh những mức độ biển đổi rất nhỏ giữa các cá thể nghiên cứu. Sự sai khác về địa điểm thu mẫu từ 12 tỉnh/thành phố trong khu vực Vịnh Bắc Bộ, miền Trung, miền Nam là rất nhỏ, sự sai khác về địa lý không ảnh hưởng đến cá Đối mục trong khu vực Biển Đông. Với 636 vị trí có giá trị phân tích đối với gen CO1, xác định được 509 vị trí bảo thủ (không biến đổi), vị trí biến đổi 120 và 415 vị trí mang thông tin di truyền, vị trí singleton 1/636. Tương tự với 860 vị trí có giá trị phân tích với gen Cytb, xác định được 644 vị trí bảo thủ (không biến đổi), vị trí biến đổi 296 và 599 vị trí mang thông tin di truyền, vị trí singleton 1/860, chi tiết bảng 3.2 Bảng 3.2. Một số thống kê biến đổi nucleotide khi so sánh với 2 vùng gen CO1 và Cytb TT Nội dung Gen CO1 Gen Cytb 1 Vị trí bảo thủ 509/636 644/860 2 Vị trí biến đổi 120/636 296/860 3 Vị trí mang thông tin tiến hóa 415/636 599/860 4 Vị trí singleton (Si) 1/636 1/860 Đa dạng nucleotide là sự khác biệt ở mỗi vị trí trình tự và về mức độ dị hợp tử ở mức nucleotide của quần thể giao phối ngẫu nhiên (Nei, 1987). Sự khác nhau giữa các cá thể trong một loài được phân tích theo mô hình Kimura 2. Trong nghiên cứu phân tử, sử dụng trình tự gen CO1 có mức độ khác biệt trong loài giữa các mẫu trong từng vùng nghiên cứu là rất nhỏ p<0,02. Chỉ số đa dạng di truyền đã phản ánh những mức độ biển đổi rất nhỏ giữa các cá thể nghiên cứu. Sự sai khác về địa điểm thu mẫu từ 12 tỉnh/thành phố trong khu vực Vịnh Bắc Bộ, miền Trung, miền Nam là rất nhỏ, sự sai khác về địa lý không ảnh hưởng đến cá Đối mục trong khu vực Biển Đông. 3.5. Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen cá Đối mục Việt Nam bằng chỉ thị SSR 3.5.1. Kết quả phân tích SSR Kết quả nhân gen từ 70/110 mẫu cá Đối mục lựa chọn nhân PCR với 12 chỉ thị SSR, chúng tôi đã xác định 35 alen khác nhau,với kích thước dao động từ 45bp đến 344bp. Mười hai chỉ thị SSR phân tích với mẫu cá Đối mục Việt Nam cho thấy tỷ lệ phân đoạn đa hình dao động từ 50% đến 100%, trong đó có đến 5/12 chỉ thị có tỷ lệ phân đoạn đa hình là 21 100% (chỉ thị Muce 16, Muce 26, Muce 38, Muce 55, Muce 80). Mười locus đa hình được tìm thấy cho loài cá Đối mục Việt Nam. Số alen trung bình 2,91 cho một locus, dao động từ 2 (Muce 9, Muce 37, Muce 55) đến 4 (Muce 14, Muce 38, Muce 51). Các giá trị PIC được xác định cho 10 locus đa hình. Giá trị PIC cao nhất (0,5918) được tìm thấy ở cặp mồi Muce 51và thấp nhất (0,0289) ở cặp mồi Muce 55. Hàm lượng thông tin đa hình (PIC) trung bình của 12 cặp mồi là 0,2899 (<0,5) cho thấy mức độ khác nhau về di truyền giữa các cá thể trong loài là rất thấp. 3.5.2. Một số thông số tính đa dạng di truyền của 70 mẫu cá Đối mục Việt Nam khi phân tích với chỉ thị SSR Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng giá trị alen quan sát trung bình (Na) thay đổi từ 2,333 (quần thể Vịnh Bắc bộ) đến 2,50 (quần thể miền Trung) với giá trị trung bình của 3 quần thể là 2,417. Số alen hiệu quả (Ne) dao động từ 2,039 (quần thể Vịnh Bắc bộ) đến 2,128 (quần thể miền trung) với giá trị trung bình là 2,084. Giá trị của hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho) khác nhau giữa các quần thể, trung bình 0,942 dao động từ 0,929 ở quần thể miền Trung đến 0,951 ở quần thể Vịnh Bắc bộ. Trong khi giá trị hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He) dao động từ 0,508 ở quần thể Vịnh Bắc bộ đến 0,525 ở quần thể miền trung. Giá trị Uhe>0,5 và chỉ số cố định trung bình (F=-0,828). Với chỉ số F<0 cho thấy tổng đàn cá Đối mục Việt Nam chưa gặp nguy hiểm. Giá trị chỉ số đa dạng di truyền Shannon (I) được tính toán cao nhất ở quần thể miền trung (I = 0,782), sau đó đến quần thể miền Nam (I = 0,758) và thấp nhất là quần thể Vịnh Bắc bộ (I = 0,735). Chỉ số đa dạng di truyền theo Shannon và theo Nei cho thấy tính đa dạng di truyền của các loài này đều ở mức chưa đáng lo ngại. Hệ số (trung bình) Fis =-0,8211 đồng nghĩa với việc quần thể cá Đối mục có hệ số giao phối cận huyết rất thấp. Trong khi mức độ di nhập gen (Nm) lại rất cao ở một số locus, chảng hạn Nm=323,48 và Fst=0,0008 đối với chỉ thi Muce 26 hoặc Nm=356,23 và Fst=0,0007 đối với chỉ thi Muce 51. Theo Nei, 1987 nếu chỉ số Fst<0,05 được cho là có sự sai khác di truyền giữa các quần thể là nhỏ. Mặt khác mức độ di nhập gen trung bình Nm=11,22 và chỉ số Fit =-0,7815 và Fst=0,0218 cho phép nhận định mức độ đa dạng di truyền quân thể cá Đối mục Việt Nam chưa đáng lo ngại. Kết quả phân tích mức biến lượng phân tử (AMOVA) giữa 3 quần thể cá đối mục (M.cephalus) Việt Nam cho thấy sự khác biệt giữa các quần thể và giữa các cá thể trong cùng quần thể với tổng mức độ thay đổi phân tử là rất thấp giữa các quần thể (29%), giữa các cá thể trong quần thể (71 %). 3.5.3. Hệ số tương đồng di truyền giữa 3 quần thể cá Đối mục Việt Nam Hệ số tương đồng di truyền giữa 3 quần thể cá Đối mục Việt Nam là rất cao (>0,9), trung bình 0,9642. Trong đó quần thể Miền Trung/miền Nam có mối quan hệ di truyền gần gũi 0,9529; quần thể Vịnh Bắc bộ/Miền Trung có mối quan hệ di truyền 0,9668. Khoảng cách di truyền giữa Miền Trung/miền Nam là 0,0274, giữa Miền Trung/Vịnh Bắc bộ là 0,0338. Phân tích NJ (Neighbor Joining) trên cơ sở khoảng cách di truyền theo Nei (1973) tìm thấy mối quan hệ giữa các nhóm quần thể với nhau (Hình 3.7). Các quần thể cá Đối mục Việt Nam hình thành hai nhóm: nhóm I là quần thể cá Đối mục Vịnh Bắc bộ và miền Trung, nhóm II là quần thể cá Đối mục miền Nam. 22 Hình 3.7. Phân tích NJ trên cơ sở khoảng cách di truyền giữa các quần thể cá Đối mục Việt Nam 3.5.4. Mối quan hệ di truyền 70 mẫu cá Đối mục Việt Nam từ 3 quần thể phân tích với 12 chị thị SSR Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu cá Đối mục Việt Nam từ 3 khu vực Vịnh Bắc bộ, miền Trung và miền Nam khi phân tích với 12 chỉ thị SSR được thể hiện ở hình 3.8. Kết quả chỉ ra quần thể cá Đối mục Việt Nam chia thành hai nhánh chính: Nhánh I với 2 nhóm (A) và (B); nhánh II với nhóm (C). Nhóm(A) với 27 mẫu thuộc khu vực Vịnh Bắc bộ nằm trọn thành một nhóm, có hệ số gen tương đồng từ 0,79 đến 1, mẫu S1 và S2 giống 97%, Q17 giống 100% Q18, E33 giống 100% E3. Tương tự nhóm (B) với 21 mẫu thuộc khu vực miền Trung nằm thành một nhóm, có hệ số gen tương đồng 0,87 đến 1, mẫu QB52, QB53 giống nhau đến 100%. Nhánh 2 với nhóm (C) với 22 mẫu thuộc khu vực miền Nam nằm thành một nhóm. Nhóm này chia thành 2 nhóm nhỏ II(a) với 17 mẫu rải đều 4 vùng thu ở miền Nam như Kiên Giang, Cần Thơ, Vũng Tàu và Cần Giờ (Thành phố Hồ Chí Minh), nhánh II (b) với 5 mẫu thu tại Phú Quốc và Vũng Tàu có hệ số gen tương đồng từ 0,85 đến 1. Hình 3.8. Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu cá đối mục (M.cephalus) Việt Nam phân tích với chỉ thị SSR tính theo hệ số di truyền của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA. 23 Hình 3.9. Biểu đồ tọa độ phân tích mức độ đa dạng di truyền quần thể 70 mẫu cá Đối mục Việt Nam với 12 chỉ thị SSR. (P1- Vịnh Bắc Bộ, P2-Miền Trung, P3- Miền Nam). Biểu đồ phân tích tọa độ (hình 3.9) của 70 mẫu cá Đối mục Việt Nam cũng phản ánh kết quả tương tự như biểu đồ hình cây (hình 3.8) đó là các mẫu thu có sự đan xen lẫn nhau giữa các vùng (địa lý) Vịnh Bắc bộ, miền Trung và miền Nam. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1. Đã xác định chính xác 162 mẫu cá Đối mục ở 12tỉnh/thành phố, với 3 khu vực: Vịnh Bắc Bộ, miền Trung, miền Nam trên tổng số 1017 mẫu cá Đối thu tại 99 điểm ở Việt Nam bằng việc kết hợp giữa phương pháp hình thái học và SHPT (giải mã 2 vùng gen CO1 và Cytb). 2. Cá Đối mục Việt Nam (Mugil cephalus L.) thuộc 3 dòng NWP1 (ôn đới), NWP2 (nhiệt đới) và NWP3 (giao thoa giữa ôn đới và nhiệt đới). Mẫu cá Đối mục thuộc dòng NWP1 tương đồng 100% mẫu cùng loại thu tại Đài Loan và Chi Lê. Dòng NWP2 tương đồng 100% mẫu thu tại Đài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản. Dòng NWP3 tương đồng 98% mẫu cùng loại thu tại Đài Loan, Fiji, New Caledonia. 3. Đã xác định 10 haplotype (vùng gen CO1), 25 haplotype (vùng gen Cytb) cho khu vực Biển Đông, 03 haplotype đặc hữu (vùng gen CO1) cho cá Đối mục Việt Nam là HT37, HT38, HT39 (NWP1), 10/25 haplotype (vùng gen Cytb) của cá Đối mục Việt Nam không quan sát thấy ở khu vực Thái Bình Dương. Đa dạng di truyền giữa các mẫu cá Đối mục thuộc 3 dòng NWP1, NWP2 và NWP3 là thấp. 4. Nghiên cứu di truyền 70 mẫu/110 mẫu cá Đối mục (Mugil cephalus) Việt Nam với 12 chỉ thị SSR cho kết quả 10/12 locus cho kết quả đa hình, tổng số 35 alen được ghi nhận cho tất cả các locus nghiên cứu. Chỉ số PIC trung bình cho từng chỉ thị là 0,2889 (0,0289-0,5918). Hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho) khác nhau giữa các quần thể: Vịnh Bắc bộ là 0,951, miền Trung là 0,929, miền Nam là 0,947. Trong khi giá trị hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He) dao động ở quần thể Vịnh Bắc bộ là 0,508); quần thể miền Trung là 0,525 và quần thể miền Nam là 0,158 (He>0,5). Giá trị Fst trung bình là 0,216 cho thấy sự khác biệt về di truyền giữa các quần thể là rất nhỏ, đồng thời mức độ thay đổi phân tử rất thấp giữa các quần thể (29%) và giữa các cá thể trong cùng quần thể (71%). Biểu đồ hình cây 24 thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu cá Đối mục Việt Nam một lần nữa cho thấy cá Đối mục Việt Nam chia thành 3 nhóm, các cá thể trong từng vùng địa lý có sự đan xen lẫn nhau giữa các vùng Vịnh Bắc bộ, miền Trung và miền Nam. 5. Đã đăng ký thành công 181 trình tự lên ngân hàng Genbank với mã số đăng ký KT188953 - KT189133 cho loài cá Đối mục Mugil cephalus ở Việt Nam. Công bố 193 thông tin của 13 loài thuộc 5 giống trong họ cá đối Mugilidae thu thập ở Việt Nam lên FISH-BOL. Kiến nghị (1) Dựa vào kết quả nghiên cứu đa dạng nguồn gen các loài cá trong họ cá Đối Mugilidae, cùng với việc phân tích hình thái, hoàn thiện khóa định loại cho các loài cá Đối Việt Nam. (2) Tiếp tục mở rộng nghiên cứu đa dạng di truyền các loài cá đối thuộc họ Mugilidae bằng gen CO1 và Cytb. (3) Ứng dụng kết quả của luận án trong xác định chính xác loài cũng như lựa chọn giống từ các quần thể khác nhau phục vụ cho công tác nhân nuôi, phát triển bền vững cá Đối mục ở Việt Nam. NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Thanh Thi Viet Tran, Long Phan Ke and Jean – Dominique Durand (2016). Diversity and distribution of cryptic species within the Mugil cephalus species complex in Vietnam. Mitochondrial DNA Part A (SCI). ISSN: 2470-1734. Published online 17th, Ferbuary 2016. 2. Trần Thị Việt Thanh, Phan Kế Long (2015). Hiện trạng, phân bố cá đối mục (Mugil cephalus) ở Việt Nam. Proceeding Hội nghị khoa học lần thứ 6 về sinh thái và tài nguyên sinh vật (tháng 10). ISBN 978-604-913-408-1 (850-854). 3. Trần Thị Việt Thanh, Vũ Thị Thu Hiền, Trần Thị Liễu, Phan Kế Long (2015). Sử dụng mã vạch DNA trong việc định loại cá biển tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam. Proceeding Hội nghị khoa học lần thứ 6 về sinh thái và tài nguyên sinh vật (tháng 10).ISBN 978-604-913-408-1 (855-864). 4. Trần Thị Việt Thanh, Phan Kế Long, B. Deivasigamani (2015). Xây dựng khóa định loại cho họ cá đối (Mugilidae) Việt Nam. Tạp chí sinh học 37(1): 1-9. ISSN 0886-7160. 5. Đăng ký thành công 181 trình tự lên ngân hàng Genbank với mã số đăng ký KT188953 – KT189133 cho loài cá Đối mục Mugil cephalus ở Việt Nam. Công bố 193 thông tin của 13 loài thuộc 5 giống trong họ cá đối Mugilidae thu thập ở Việt Nam lên FISH-BOL.