Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây na (annona squamosa l.) và cây dủ dẻ trâu (melodorum fruticosum lour .) thuộc họ na (annonaceae) ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH BÙI THỊ MINH NGUYỆT NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY NA (ANNONA SQUAMOSA L.) VÀ CÂY DỦ DẺ TRÂU (MELODORUM FRUTICOSUM LOUR .) THUỘC HỌ NA (ANNONACEAE) Ở VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 62. 44. 01. 14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGHỆ AN - 2014 Công trình được hoàn thành tại: Phòng thí nghiệm Chuyên đề Hữu cơ, khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Trần Đình Thắng 2. PGS. TS. Ping Chung Kuo Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Thư viện Quốc gia Việt Nam 2. Trung tâm Thông tin & Thư viện Nguyễn Thúc Hào – Trường Đại học Vinh 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Thực vật ở nước ta rất đa dạng và phong phú, số liệu thống kê gần đây về thực vật bậc cao ở nước ta cho biết có hơn 13.000 loài, đến năm 2002 đã biết được có 2.270 chi và 305 họ trong đó có khoảng 4.000 loài cây được sử dụng làm thuốc [9], và 600 loài cây cho tinh dầu [6]. Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên rất quý báu của đất nước. Hiện nay, có nhiều nghiên cứu về thực vật mà chủ yếu là nghiên cứu về hóa thực vật. Theo thống kê cho thấy, có khoảng 80% dân số thế giới tin vào y học cổ truyền để chăm sóc sức khoẻ. Trong thập kỉ qua, có gần 121 sản phẩm thuốc được tạo nên dựa trên kiến thức về y học truyền thống từ các nguồn khác nhau [106]. Có nhiều sản phẩm thuốc được tạo ra trực tiếp hoặc dẫn xuất hoặc tổng hợp bắt chước theo bộ khung từ sản phẩm thiên nhiên [9]. Nhiều bệnh nhân mắc bệnh nan y đặc biệt là ung thư đã được chữa khỏi nhờ sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên [41]. Đặc biệt trong 20 năm trở lại đây, các hợp chất thiên nhiên còn được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả trong sản xuất các thực phẩm chức năng, bổ sung dinh dưỡng hay thực phẩm thuốc là các sản phẩm nâng cao sinh lực, phòng và hỗ trợ điều trị bệnh tật, nâng cao tuổi thọ [8]. Chính vì thế, việc nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên để làm thuốc chữa bệnh vô cùng quan trọng bởi vì khi sử dụng các loại thuốc có nguồn gốc từ hoá tổng hợp gây tác dụng phụ và làm cho môi trường ngày càng ô nhiễm hơn, các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên hạn chế được những nhược điểm đó. Trong đó việc xác định cấu trúc của chúng là khâu then chốt trong việc giải mã cơ chế tương tác giữa thuốc với tác nhân gây bệnh. Ở Việt Nam, các cây thuốc được sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm, chỉ có khoảng 20-30% số loài được xác minh khoa học về giá 2 trị, cơ chế chữa bệnh và chỉ dùng để chữa các bệnh thông thường: cảm sốt, cảm lạnh, cầm máu, làm lành vết thương, ăn uống khó tiêu, bong gân, hoặc một số bệnh nan y như: tim mạch, gan, thận, thần kinh, dị ứng,Trong một số công bố gần đây về 920 loài cây thuốc có khả năng điều trị 64 loại bệnh chứng theo cách cổ truyền [4]. Các cây họ Na nói chung và các cây thuộc chi Na và chi Dủ dẻ nói riêng, có giá trị kinh tế cao, không chỉ dùng để làm cảnh, quả một số loài ăn rất ngon mà nó còn được sử dụng nhiều trong thuốc y học dân tộc bởi những hoạt tính sinh học đáng quý của chúng. Ngoài ra, một số cây có mùi thơm đặc biệt nên được dùng trong các ngành hương liệu. Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về cây na, nhưng ở Việt Nam vẫn chưa được nghiên cứu nhiều. Còn đối với dủ dẻ trâu, các báo cáo về nó vẫn còn khiêm tốn, ở Việt Nam chưa tìm thấy một công trình nghiên cứu nào về loài cây này. Vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học của loài cây này giúp đánh giá được giá trị của nguồn tài nguyên thiên nhiên của nước ta. Kết quả nghiên cứu về loài cây này sẽ mang lại ý nghĩa to lớn đối với ngành dược liệu. Chính bởi những ưu điểm như thế, chúng tôi nhận thấy sự cần thiết để nghiên cứu về thành phần hóa học của các cây này. Với những lí do quan trọng nêu trên chúng tôi thực hiện luận án với tên “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây na (Annona squamosa L.) và cây dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) thuộc họ Na (Annonaceae) ở Việt Nam”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Với những lí do nêu trên, chúng tôi xác định mục tiêu nghiên cứu của luận án gồm những nội dung như sau: - Xác định được thành phần hóa học và cấu trúc các hợp chất được phân lập từ cây na và cây dủ dẻ trâu. - Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được 3. Đối tượng nghiên cứu 3 Đối tượng nghiên cứu của luận án là lá cây na (Annona squamosa L.) thuộc chi Na (Annona) và lá cây dủ dẻ trâu (Melodrum fruticosum Lour.) thuộc chi Dủ dẻ (Melodorum), hai loài này cùng thuộc họ Na (Annonaceae). 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Với mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, chúng tôi xác định các nhiệm vụ cần thực hiện gồm: - Lựa chọn các dung môi thích hợp để chiết được hỗn hợp các hợp chất từ lá của cây na và lá cây dủ dẻ trâu. - Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ các cao thu được từ lá cây na và lá cây dủ dẻ trâu - Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được. 5. Những đóng góp mới của luận án Đây là công trình khoa học báo cáo về thành phần hóa học và cả về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ lá cây na (Annona squamosa L.) và lá cây dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) lần đầu tiên ở Việt Nam. - Đã phân lập và xác định cấu trúc của 05 hợp chất ent-kauran và 02 hợp chất steroit. Trong đó, có một hợp chất ent-kauran ditecpenoit lần đầu tiên được phân lập từ loài na. - Từ dịch chiết của lá cây dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) đã phân lập và xác định được 01 hợp chất amit thơm mới, 08 hợp chất flavonoit, 01 hợp chất ancaloit, 01 hợp chất tannin, 02 hợp chất steroit. Ngoại trừ 02 hợp chất steroit, các hợp chất còn lại đều là các hợp chất lần đầu tiên phân lập từ loài dủ dẻ. - Xác định được các thông số cấu trúc tinh thể của hợp chất amit thơm mới. Các số liệu về tinh thể học của hợp chất này (CCDC 872 187) hiện được lưu trữ tại Trung tâm dữ liệu Cambridge. - Trong số các hợp chất ent-kauran ditecpenoit phân lập từ lá na có một hợp chất lần đầu tiên báo cáo về hoạt tính gây độc dòng tế 4 bào ung thư vú (MCF-7). Có ba hợp chất phân lập từ lá dủ dẻ trâu lần đầu tiên được nghiên cứu hoạt tính kháng viêm dựa trên khả năng ức chế sự tạo thành O2 - khi cho bạch cầu trung tính phản ứng với formyl-L- methionyl-L-leucyl-L-phenylalanin/cytochalasin B (FMLP/CB). 6. Bố cục của luận án Luận án gồm 124 trang với 24 bảng số liệu, 23 hình và 6 sơ đồ với 144 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (27 trang), phương pháp và thực nghiệm (14 trang), kết quả và thảo luận (60 trang), kết luận (2 trang), danh mục công trình công bố (1 trang) và tài liệu tham khảo (16 trang). Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 114 phổ của các hợp chất (62 trrang) và các dữ liệu tinh thể học của melodamit A (6 trang) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tổng quan về cây na (Annona squamosa L.) và cây dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) được trình bày với các mục gồm: - Đặc điểm thực vật - Thành phần hoá học - Sử dụng và hoạt tính CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất, thiết bị 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chiết tách Sử dụng các dung môi thích hợp để chiết hỗn hợp các chất từ cao metanol trích từ lá na và lá dủ dẻ trâu 2.2.2. Sắc kí lớp mỏng Thực hiện trên bản mỏng đã được tráng sẵn silica gel Merck 60 F254, độ dày 0,2 mm. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và hiện màu với hơi iot 5 2.2.3. Sắc kí cột Sử dụng phương pháp sắc kí trên cột thông thường với pha tĩnh là silica gel 70-230/mesh và sắc kí cột pha đảo RP-18. 2.2.4. Kết tinh phân đoạn Phương pháp kết tinh phân đoạn dùng để làm sạch các hợp chất thu được ở các phân đoạn sắc kí 2.2.5. Phương pháp xác định cấu trúc Sử dụng các phương pháp phổ hiện đại để chứng minh cấu trúc gồm phổ tử ngoại (UV), hồng ngoại (IR), phổ khối (ESI-MS, HR-ESI- MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H-COSY), X-ray và đo độ quay cực riêng 2.2.6. Phương pháp thử hoạt tính sinh học - Hoạt tính gây độc tế bào được tiến hành tại phòng Công nghệ Sinh học, Viện hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Hoạt tính kháng viêm được tiến hành tại trường Đại học Cheng Kung, Đài Loan. 2.3. Thu hái mẫu thực vật Mẫu lá cây na (Annona squamosa L.) được thu hái ở Đồng Tháp vào tháng 8/2010 và lá cây dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) thu hái ở Huế vào tháng 5/2009, cả hai mẫu thực vật đều được PGS. TS Trần Huy Thái (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học và các tiêu bản được lưu giữ tại khoa Sinh-Trường Đại học Vinh. 2.4. Kết quả nghiên cứu chiết tách và xác định cấu trúc các thành phần hóa học trong lá na 2.4.1. Chiết tách cao 6 Sơ đồ 1: Quy trình chiết tách cao từ lá na 2.4.2. Phân lập các chất (*): CC, silica gel; CHCl3: CH3OH (30:1, 20:1; 10:1; 4:1; 2:1) (**): CC, silica gel; CHCl3: CH3OH (25:1, 15:1; 10:1; 4:1; 2:1) Sơ đồ 2: Quy trình phân lập các chất từ cao etyl axetat của lá na - Phân bố trong nước - Chiết lần lượt với hexan, etyl axetat, butanol Lá na (10 kg) Cao metanol (786 g) Cao etyl axetat (358 g) Dịch nước Cao butanol (145 g) - Ngâm với metanol - Cất thu hồi metanol Cao hexan (287 g) Cao etyl axetat (358g) F-2 (95 g) F- 7 F-3, -4 F-1 (44 g) F-5 ASE3 (349 mg) ASE5 (294 mg) ASE6 (125 mg) CC, silica gel CHCl3:CH3OH (50:1; 30:1; 20:1; 10:1; 4:1) ASE1 (1027 mg) ASE4 (328 mg) ASE2 (246 mg) F-6 ASE7 (342 mg) (*) (**) 7 2.5. Kết quả nghiên cứu chiết tách và xác định cấu trúc các thành phần hóa học trong lá dủ dẻ trâu 2.5.1. Chiết tách cao Sơ đồ 3: Quy trình chiết tách cao từ lá dủ dẻ trâu 2.5.2. Phân lập các chất 2.5.2.1. Cao hexan Sơ đồ 4: Quy trình phân lập các chất từ cao hexan của lá dủ dẻ trâu 2.5.2.2. Cao etyl axetat Lá cây dủ dẻ (9,8 kg) Cao metanol (716 g) Cao hexan (38 g) Cao butanol (192 g) Cao etyl axetat (267 g) - Ngâm với metanol - Cất thu hồi metanol Cao hexan (38 g) F-2 (3 g) F-3 F-5 F-1 MFH2 (321mg) CC, silica gel hexan: axeton (9:1) CC, silica gel hexan : axeton (9:1, 5:1, 3:1, 1:1) F-4 F 6 8 Sơ đồ 5: Quy trình phân lập các chất từ cao etyl axetat của lá dủ dẻ trâu 2.5.2.3. Cao butanol Sơ đồ 6: Quy trình phân lập các chất từ cao butanol của lá dủ dẻ trâu CC, silica gel hexan:axeton (7:1) Cao etyl axetat (267 g) F-1 F-2 F-3 F-4 F-5 F-6 (14,2 g) F-10 (15,9 g) MFE3 (52 mg) MFE6 (58 mg) MFE1 (99 mg), MFE4 (70 mg), MFE5 (71 mg), MFE7 (35 mg) CC, silica gel hexan:axeton (19:1, 12:1, 7:1, 3:1, 1:1) CC, silica gel hexan:axeton (19:1) CC, silica gel hexan:axeton (15:1, 10:1, 7:1, 5:1) F-9 (35,7 g) F-7, -8 Cao butanol (192 g) CC, silica gel CHCl3:CH3OH:H2O (4:1:0,05) F-1 F-2 F-3 (5,0 g) F-4 (18,6 g) F -6 (30,6 g) F-7 (10,4 g) MFB8 (39 mg) MFB11 (14 mg) MFB9 (12 mg) MFB10 (87 mg) MFB12 (45 mg) CC, silica gel CHCl3:MeOH ( 0 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90 %, và 100 %) CC, silica gel CHCl3:CH3OH (19:1) CC, silica gel CHCl3:CH3OH (15:1) MFB13 (97 mg) F-5 CC, silica gel CHCl3:CH3OH:H2O (9:1:0,05) F-8, F-9, F -10 9 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Lá cây na (Annona squamosa L.) 3.1.1. Các hợp chất được phân lập Cặn chiết etyl axetat từ lá na đã phân lập và xác định được cấu trúc của 7 hợp chất được kí hiệu từ ASE1 đến ASE7. Bảng 3.1: Các hợp chất phân lập từ lá cây na STT Kí hiệu hợp chất Tên hợp chất Công thức phân tử Khối lượng hợp chất (mg) 1 ASE1 Axit-ent-kaur-16- en-19-oic C20H30O2 1027 2 ASE2 Axit 16-hydro- 17-axetoxy-ent- kauran-19-oic C22H34O4 246 3 ASE3 Axit-16- hydro-ent kauran-17,19-dioic C20H30O4 349 4 ASE4 Axit-16-hydro-19- al-ent-kauran-17-oic C20H30O3 328 5 ASE5 16,17-dihydroxy- ent-kauran-19-al C20H32O3 294 6 ASE6 β-sitosterol C29H50O 125 7 ASE7 -sitosterol-3-O-- D-glucopyranozit C35H60O6 342 3.1.3. Điểm nổi bật từ kết quả phân lập các hợp chất trên lá na 3.1.3.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập 10 3.1.3.2. Những đóng góp từ kết quả thu được Những hợp chất ent-kauran ditecpenoit phân lập được đã từng tìm thấy trong nhiều loài thuộc chi Na (Annona) cùng với hai hợp chất steroit β-sitosterol (ASE6) và -Sitosterol-3-O--D-glucopyranozit (ASE7) thường bắt gặp trong hầu hết các loài thực vật. Theo thống kê các tư liệu tham khảo cho thấy hầu hết các hợp chất đã phân lập được của luận án đều đã từng được phân lập và công bố trên đối tượng cây na ngoại trừ hợp chất axit 16-hydro-17-axetoxy-ent-kauran-19-oic (ASE2) chỉ tìm thấy trong các loài khác thuộc chi này. Cấu trúc các hợp chất tuy đã được xác định nhưng đây là lần đầu tiên các hợp chất này được phân lập và xác định cấu trúc từ lá na phân bố ở Việt Nam và cũng là lần đầu tiên kết quả nghiên cứu từ đối tượng lá na Việt Nam được công bố. 3.2. Lá cây dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) 1 2 3 4 5 6 7 89 10 CHO OH 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 OH (ASE5) 16,17-Dihydroxy- ent-kauran-19-al 1 2 3 4 5 6 7 89 10 CHO COOH 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 H (ASE4) Axit 16- hydro-19-al-ent- kauran-17-oic 1 2 3 4 5 6 7 89 10 COOH 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 OCCH3 O H (ASE2) axit 16- hydro-17-axetoxy-ent- kauran-19-oic 1 2 3 4 5 6 7 89 10 COOH 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 (ASE1) axit ent- kaur-16-en-19-oic 2 3 5 7 8 9 10 11 12 131 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 4 6 14 HO (ASE6) β-Sitosterol O OH HO HO HOH2C 1' 2' 3' 4' 5' 6' 2 3 5 7 8 9 10 11 12 131 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 4 6 14 O (ASE7) -Sitosterol-3-O--D-glucopyranozit 1 2 3 4 5 6 7 89 10 COOH COOH11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 (ASE3) axit 16- hydro-ent-kauran- 17,19-dioic 11 3.2.1. Các hợp chất được phân lập Các cao chiết ứng với dung môi khác nhau gồm: hexan đã phân lập được 1 hợp chất, cao etyl axetat phân lập được 6 hợp chất và cao butanol phân lập được 6 hợp chất, các chất với tên cụ thể được nêu ở bảng 3.9. Bảng 3.9: Danh mục các chất phân lập từ cây dủ dẻ trâu ST T Kí hiệu hợp chất Tên hợp chất Công thức Phân tử Khối lượng hợp chất (mg) 1 MFE1 Melodamit A C17H17NO3 99 2 MFH2 β-Sitosterol C29H50O 321 3 MFE3 Flavokawain A C18H18O5 52 4 MFE4 2',6'-Dihydroxy-4'- metoxychalcon C16H 14O4 70 5 MFE5 2',4'-Dihydroxy-4,6'- dimetoxydihydrochalcon C17H18O5 71 6 MFE6 4',5-Dimetoxy-7- hydroxyflavanon (Tsugafolin) C17H16O5 58 7 MFE7 5-O-Metylnaringenin (7,4′-dihydroxy-5- metoxyflavanon) C16H14O5 35 8 MFB8 Naringenin - 4',7- dimetylete C17H16O5 39 9 MFB9 Kaempferol 3-O- {-D-apiofuranozyl- (12)- [-L-rhamnopyranozyl- (16)]- -D-glucopyranozit} C32H38O19 12 10 MFB10 Rutin C27H30O16 87 11 MFB11 Oxoanolobin C17H10NO4 14 12 MFB12 Axit 3, 3', 4'-trimetoxy ellagic C17H12O8 45 13 MFB13 -sitosterol-3-O--D- glucopyranozit C35H60O6 97 12 3.2.2. Xác định cấu trúc các hợp chất 3.2.2.1. Hợp chất MFE1 Hợp chất MFE1 đã được phân lập có dạng chất bột không màu, đ.n.c 183–185°C. Độ quay cực   8,28D = 0,001 (CH3OH, c 1,53) cho thấy hợp chất này không quang hoạt. Phổ ESI-MS (positive) cho pic ion giả phân tử [M+H]+ ở m/z 284, còn phổ ESI-MS (negative) cho pic ion giải phân tử [M-H]- ở m/z 282, từ đó xác định được khối lượng phân tử của MFE1 là 283, kết hợp với dữ liệu phổ 1H-, 13-NMR, DEPT giúp dự đoán được công thức phân tử của MFE1 là C17H17NO3 (xem hình 3.1 và hình 3.2). Phổ HR-ESI-MS cho cho pic ion giả phân tử m/z 284,1289 [M+H]+ giúp khẳng định công thức phân tử của MFE1 là C17H17NO3N (hình 3.3) Trên phổ IR cũng cho thấy sự xuất hiện các pic hấp thụ mạnh đặc trưng cho dao động hoá trị của nhóm OH (3.441 cm-1), N–H (3.257 cm-1), nhóm cacbonyl liên hợp (1.662,3 cm-1), C=Colefin (1.609,6 cm -1) và C=Cvòng thơm (1.573,2 cm -1) (hình 3.4). Trên phổ 1H-NMR, quan sát thấy có tín hiệu tại  8,09 (1H, t, J=5,5 Hz) được nhận định là tín hiệu đặc trưng của proton nhóm amit và tín hiệu tại  5,83 (1H, s) là tín hiệu của proton nhóm -OH. Một bộ gồm 5 proton thơm cho các tín hiệu doublet tại vùng  7,55 ppm với J=8,5 Hz (có tương tác octo) được gán cho hai proton H-5, H-9 và cụm tín hiệu của 3 proton còn lại tại  7,39 (3H, m) được xác nhận là của H- 6, H-7, H-8, các tín hiệu này đặc trưng cho vòng benzen một lần thế. Tín hiệu của hai proton thuộc trans-olefin cũng được quan sát, trong đó, tín hiệu của một proton bị chồng lấp với các proton thơm tại  7,39 (1H, d, J=15,5 Hz) được quy kết cho H-3 và tín hiệu doublet của H-2 tại  6,56 với J=15,5 Hz (đặc trưng cho kiểu liên kết trans-olefin). Thêm vào đó, sự xuất hiện các tín hiệu doublet của 4 proton olefin tại  6,94 (2H, d, J=8,5 Hz);  6,09 (2H, d, J=8,5 Hz) được quy kết lần lượt 13 cho H-4' và H-8'; H-5' và H-7'. Ngoài ra còn nhận thấy sự xuất hiện của các tín hiệu multilet ở vùng trường cao của 4 proton thuộc nhóm metylen cho thấy có tương tác bậc cao tại  3,18 (2H, m) và 1,86 (2H, m) được cho là của H-1' và H-2' (xem hình 3.5 – hình 3.7 và bảng 3.10). Phổ 13C-NMR, DEPT và kết hợp với phổ HSQC cho thấy tín hiệu của 17 cacbon gồm một nhóm xeton liên hợp ( 185,2 ppm), một amit liên hợp ( 164,8 ppm), hai tín hiệu cacbon olefin ( 138,6 và 122,1 ppm), hai cacbon olefin liên hợp đối xứng ( 152,8, 126,8 ppm), tín hiệu của sáu cacbon thơm (δ 134,9, 129,4, 129,4, 128,9, 127,5, 127,5 ppm) một cacbon bậc bốn có gắn oxi (δ 67,8 ppm), hai nhóm metylen (δ 39,0 và 34,2 ppm). Xác định vị trí các nhóm thế dựa vào phổ HMBC, mối tương quan giữa H-2 (δ 6,56 ppm) với C-1 (δ 164,8 ppm)/ C-3 (δ 138,6 ppm)/ C-4 (δ 134,9 ppm) từ đó xác định được thứ tự amit cinnamic của hợp chất MFE1. Tương quan của proton nhóm amit ( 8,09 ppm) với C-1 ( 164,8 ppm)/C-1' (34,2 ppm), proton nhóm hydroxyl  5,83 ppm với C-2' ( 39,0 ppm)/C-3' ( 67,8 ppm)/C-4' ( 152,8 ppm)/C-8' (152,8 ppm). Ngoài ra, vòng B có cấu trúc của một cyclohexadienon xuất hiện tại tín hiệu H-5'/H-7' (δ 6,09 ppm) và H-4'/H-8' (δ 6,94 ppm) đều có tương quan với C-3' (δ 67,8 ppm) và C-6' (δ 185,2 ppm). Thêm vào đó, các pic giao nhau của H-1' (δ 3,18 ppm) tương quan với C-1 (δ 164,8 ppm)/C-2′ (δ 39,0 ppm)/C-3′ (δ 67,8 ppm) và của H-2′ (δ 1,83 ppm) với C-1′ (δ 34,2 ppm)/ C-3′ (δ 67,8 ppm)/C-4′ (δ 152,8 ppm)/C-8′ (δ 152,8 ppm), phổ HMBC cho thấy amit liên hợp và vòng B liên kết với C-1' và C-2' (hình 3.8 – hình 3.17 và bảng 3.10). Bảng 3.10: Số liệu phổ DEPT và HMBC của hợp chất MFE1 Vị trí H (ppm) C (ppm) HMBC 1 164,8 2 6,56 (1H, d, J = 15,5 Hz) 122,1 C-1, C-3, C-4 14 3 7,39 (1H, d, J = 15,5 Hz) 138,6 C-1, C-2, C-4, C-5, C-9 4 134,9 5 7,55 (1H, d, J = 8,5 Hz) 127,5 C-3, C-7, C-9 6 7,39 (1H, m) 128,9 C-4, C-8 7 7,39 (1H, m) 129,4 C-5, C-6, C-8, C-9 8 7,39 (1H, m) 128,9 C-4, C-6 9 7,55 (1H, d, J = 8,5 Hz) 127,5 C-3, C-5, C-7 1' 3,18 (2H, dd, J = 14,0, 7,0 Hz) 34,2 C-1, C-2', C-3' 2' 1,86 (2H, t, J = 7,0Hz) 39,0 C-1', C-3', C-4', C-8' 3' 67,8 4' 6,94 (1H, d, J = 8,5 Hz) 152,8 C-3', C-6' 5' 6,09 (1H, d, J = 8,5 Hz) 126,8 C-3', C-6' 6' 185,2 7' 6,09 (1H, d, J = 8,5 Hz) 126,8 C-3', C-6' 8' 6,94 (1H, d, J = 8,5 Hz) 152,8 C-3', C-6' CONH 8,09 (1H, br s) - C-1, C-1' 3'-OH 5,83 (1H, s) - C-2', C-3', C-4', C-8' C (Đo ở 125 MHz trong DMSO-d6) Qua các số liệu phân tích từ phổ đồ của hợp chất MFE1 cho phép khẳng định đây là hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên và được đặt tên là melodamit A. Hình 3.18: Tương tác HMBC và cấu trúc của Melodamit A (MFE1) Bên cạnh đó, cấu trúc của hợp chất melodamit A còn được khẳng định qua kết quả về tinh thể học được xác định bằng nhiễu xạ tia X. Sau đây là các thông tin về tinh thể của MFE1. Bảng 3.11: Một số thông số về hình học của tinh thể MFE1 Dữ liệu tinh thể Hệ tinh thể: monoclinic Dc = 1,283 mg/m3 Nhóm điểm không gian: P 1 21/n 1 Z = 4 N O O HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7'8' H HMBC 15 a = 8,6116 Å T = 100 K b = 10,3693 Å F000 = 640 c = 17,8352 Å Dạng bức xạ CuK\a  = 90,0o λ = 1,54178 Å β = 101,716 (100)o θ = 4,96 – 66,38o  = 90,0o  = 0,751 mm-1 V = 1559,44 Å3 Kích thước tinh thể: 0,18 x 0,15 x 0,12 mm3 Ghi nhận dữ liệu Máy nhiễu xạ Bruker APEX DUO Rint = 0,0199 Nguồn bức xạ: fine-focus sealed tube R1 = 0,032 với I > 2 (I) Phản xạ đã dùng 8662 θmax = 66,38 o Phản xạ tự do 2619 θmin = 4,96 o Máy đơn sắc: graphite h = -9  10 Dạng hiệu chỉnh hấp thụ: multi-scan k = -12  12 T = 100 K l = -21  24 Cấu trúc tinh tế wR (F2) = 0,0857 S = 1,036 w = 1/[2(Fo 2) + (0,0495P)2 + 0,4542P] trong đó: P = (Fo 2 + 2 Fo 2)/3 Số thông số: 200 Các thông số về độ dài liên kết và góc liên kết (xem phụ lục trang PL-64-67) Hình 3.19: Cấu trúc đơn tinh thể nhiễu xạ tia X của melodamit A 3.2.3. Điểm nổi bật từ kết quả phân lập các hợp chất trên lá dủ dẻ trâu 3.2.3.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập 16 2 3 5 7 8 9 10 11 12 131 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 4 6 14 HO (MFH2) β-Sitosterol 5 1 2 4 1' 2' 3' 4' 5' 6' OH OOH H3CO 3 67 89 (MFE4) 2,6'-Dihydroxy-4'-metoxychalcon NH O O HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7'8' (MFE1) Melodamit A (chất mới) 5 6 1 2 3 4 OCH 3 OCH OOH H CO3 3 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7 89 (MFE3) Flavokawain A 5 1 2 4 1'2' 3' 4' 5' 6' OCH3 OOH HO 3 6   OCH3 (MFE5) 2',4'-Dihydroxy-4,6'- dimetoxydihydrochalcon OCH3 HO O OOCH3 1 2 34 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' (MFE6) Tsugafolin hay 4',5-dimetoxy-7-hydroxyflavanon) OH HO O OOCH3 1 2 34 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6' (MFE7) 5-O-Metylnaringenin (7,4′-dihydroxy-5-metoxyflavanon) OCH3 H3CO O OOH 1 2 34 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' (MFB8) Naringenin – 4',7- dimetylete 1 3 2 45 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' O HO O HO HO CH3 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 1''' 2'''3'''4''' 5''' 6''' 1'''' 2'''' 3'''' 4'''' 5'''' O OOH HO O OH O OH OH O CH2OH O HO HO (MFB9) Kaempferol 3-O- {-D-apiofuranozyl-1 [-L-rhamnopyranozyl (16)]- -D-glucopyranozit} 1 2 34 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' OH O OH HO OH O O O O OH HO HO O HO HO HO H3C 1' '' 2'''3''' 4''' 5'''6''' 1''2'' 3'' 4'' 5'' 6'' (MFB10) Rutin 17 3.2.3.2. Những đóng góp từ kết quả thu được Từ các tư liệu thu thập về hóa thực vật của loài dủ dẻ trâu cho biết, các kết quả về phân lập và xác định cấu trúc còn hạn chế, trong số các tư liệu tìm thấy, tác giả vẫn chưa chưa tìm thấy công trình nào công bố về loài dủ dẻ trâu phân bố ở Việt Nam. Chính vì vậy kết quả việc xác định cấu trúc các hợp chất từ loài này chính là điểm nổi bật của luận án. Theo phần tổng quan tư liệu cho thấy các hợp chất phân lập được từ các loài thuộc chi Dủ dẻ nói riêng và loài dủ dẻ trâu nói chung phần nhiều là các hợp chất heptene và một số ít hợp chất khác. Qua đó cho thấy, các hợp chất phân phân lập được của luận án gồm melodamit A (MFE1), flavokawain A (MFE3), 2,6’-dihydroxy-4’-metoxychalcon (MFE4), 2’,4’-dihydroxy-4,6’-dimetoxydihydrochalcon (MFE5), tsugafolin (MFE6), 5-O-metylnaringenin (MFE7), naringenin - 4',7- dimetylete (MFB8), kaempferol 3-O-{-D-apiofuranozyl-(12)-[-L- rhamnopyranozyl-(16)]--D-glucopyranozit} (MFB9), rutin (MFB10), oxoanolobin (MFB11), axit 3,3’,4’- trimetoxy ellagic (MFB12) O OH HO HO HOH2C 1' 2' 3' 4' 5' 6' 2 3 5 7 8 9 10 11 12 131 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 4 6 14 O (MFB13) -Sitosterol-3-O--D- glucopyranozit O O O O O OH O CH3 O CH3 CH3 1 2 3 4 5 6 7 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' (MFB12) 3, 3', 4'- trimethoxy ellagic acid N O O O OH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 11a 1a 1b 3a 6a 7a 1 (MFB11) Oxoanolobin 18 là lần đầu tiên được phân lập từ các loài thuộc chi Dủ dẻ, đặc biệt hợp chất MFE1 là hợp chất lần đầu tiên được phân lập và xác định cấu trúc từ sản phẩm thiên nhiên. Hai hợp chất là β-sitosterol (MFH2) và - sitosterol-3-O--D-glucopyranozit (MFB13) có cấu trúc giống với hai hợp chất ASE6 và ASE7 được phân lập từ lá na và cũng đã từng được phân lập từ loài dủ dẻ trâu. 3.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chất phân lập được 3.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào Bốn hợp chất ent-kauran tinh khiết phân lập từ lá na (Annona squamos L.) gồm: axit ent-kaur-16-en-19-oic (ASE1), axit 16-hydro- 17-axetoxy-ent-kauran-19-oic (ASE2), axit 16-hydro-19-al-ent-kauran- 17-oic (ASE4), 16,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al (ASE5) được tiến hành thử hoạt tính in vitro với ba dòng tế bào ung thư trên người: ung thư gan (Hep-G2- Human hepatoma), ung thư phổi (Lu- Human lung carcinoma) và ung thư vú (MCF-7- Human breast adenocarcinoma). Các giá trị trong bảng 3.22 cho thấy các hợp chất ASE4 và ASE2 thể hiện hoạt tính với các dòng tế bào thử nghiệm đều có các giá trị % CS > 50%, điều đó có nghĩa là khả năng gây độc tế bào của chúng rất yếu nên xem như không thể hiện hoạt tính với thử nghiệm này. Các hợp chất với giá trị % CS < 50% sẽ được chọn để tiếp tục thử nghiệm. Bảng 3.22: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào theo công thức Ducan Dòng tế bào Cell survival (%) T T KH mẫu Nồng độ (g/ml) Hep-G2 Lu MCF-7 Kết luận DMSO 100,0  0,0 100,0  0,0 100,0 0,0 Chứng (+) 5 0,0  0,0 1,3  0,1 1,5  0,06 Dương tính 1 ASE1 5 16,5  0,08 61,1  0,7 1,6  0,2 Dương tính với Hep- G2 và MCF-7 19 2 ASE2 5 70,6  0,4 88,20,6 68,5  1,0 Âm tính 3 ASE4 5 85,6  1,2 92,5  1,2 95,1  0,6 Âm tính 4 ASE5 5 69,3  0,4 90,8  1,1 38,7  0,5 Dương tính với MCF-7 Bảng 3.23: Kết quả IC50 theo chương trình Table curve Dòng tế bào Cell survival (%) TT KH mẫu Hep-G2 Lu MCF-7 Kết luận Chứng (+) 0,256 0,305 0,287 Dương tính 1 ASE1 3,140 > 5 1,799 Dương tính với dòng Hep-G2 và MCF-7 2 ASE5 > 5 > 5 2,594 Dương tính với dòng MCF-7 Hợp chất ASE5 ức chế mạnh dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) với IC50 là 2,594, còn hợp chất ASE1 ức chế mạnh dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư vú (MCF-7) với giá trị IC50 tương ứng là 3,14 và 1,799. Như vậy, hai hợp chất này đều có khả năng ức chế mạnh các dòng tế bào ung thư, trong đó, cả hai hợp chất ASE1 và ASE5 đều ức chế được tế bào ung thư vú, nhưng hợp chất ASE1 có khả năng ức chế mạnh hơn hợp chất ASE5 vì IC50 (ASE1) < IC50 (ASE5). 3.3.2. Hoạt tính tạo ra các anion peroxit và giải phóng elastase Trong các hợp chất sạch được phân lập từ lá dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) có 8 hợp chất gồm: MFE1, MFE3, MFE7, MFE4, MFE6, MFB8, MFB10, MFB12 được tiến hành thử nghiệm để đánh giá khả năng kháng viêm dựa trên khả năng ức chế sự giải phóng elastase, sự tạo thành các anion peroxit (O2 -) trên các bạch 20 cầu trung tính khi cho chúng phản ứng với formyl-L-methionyl-L- leucyl-L-phenylalanin/cytochalasin B (FMLP/CB), từ đó đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất này. Kết quả thử nghiệm được trình bày cụ thể qua các giá trị ở bảng 3.24. Bảng 3.24: Hiệu quả của các hợp chất trong quá trình tạo ra anion peroxit và giải phóng elastase Hợp chất Anion peroxit IC50 (µM) a hoặc (Inh %) Giải phóng elastase (Inh %) MFE1 5,25 ± 0,48 (39,17 ± 6,87)** MFE3 8,65 ± 1,93 (40,22 ± 6,72)** MFE4 8,40 ± 2,19 (25,14 ± 5,22)** MFB6 (2,50 ± 1,43) (10,14 ± 6,49) MFE7 (2,20 ± 1,68) (2,11 ± 7,91) MFE8 (7,69 ± 5,72) (-4,54 ± 1,44)* MFB10 (39,46 ± 2,29)*** (10,06 ± 4,75) MFB12 (3,08 ± 0,88)* (14,91 ± 5,97) Sorafenibb 3,44 ± 0,29 1,00 ± 0,60 SB202190b 6,73 ± 0,65 (5,53 ± 3,50) Percentage of inhibition (Inh %) ở nồng độ 10 µM. Các kết quả được biểu thị bằng giá trị trung bình ± SEM (n =3). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 so sánh với giá trị đối chứng. a Nồng độ cần thiết để ức chế 50% (IC50). b Sorafenib tosylate và SB202190 được sử dụng làm chất đối chứng dương. Từ các số liệu thu được ở bảng 3.23 cho ta biết chỉ có ba hợp chất MFE1, MFE3, MFE4 thể hiện khả năng ức chế sự tạo thành anion peoxit và không có hợp chất nào thể hiện khả năng ức chế quá trình giải phóng elastase. Cụ thể, hợp chất MFE1 với IC50 = 5,25 ± 0,48 µM, hợp chất MFE3 với IC50 = 8,65 ± 1,93 µM và MFE4 là IC50 = 8,40 ± 2,19 µM. Như vậy, hợp chất MFE1 thể hiện hoạt tính cao hơn vì có giá trị IC50 nhỏ nhất. 21 3.3.3. Điểm nổi bật từ kết quả thử hoạt tính sinh học 3.3.3.1. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ lá na Trong số 7 hợp chất được được phân lập, có 4 hợp chất được thử hoạt tính gây độc tế bào nhưng chỉ có 2 hợp chất thể hiện hoạt tính là axit ent-kaur-16-en-19-oic (ASE1) và 16,17-dihydroxy-ent-kauran- 19-al (ASE5). Với kết quả hoạt tính sinh học và so sánh với các tư liệu có liên quan cho thấy hợp chất ASE1 với khả năng gây độc hai dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư vú (MCF-7) cũng đã được biết đến trong các công trình đã công bố, nhưng với hợp chất ASE5 chỉ gây độc dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) và đây là lần đầu tiên hợp chất này được báo cáo về hoạt tính sinh học. 3.3.3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ lá dủ dẻ trâu Đây là lần đầu tiên các hợp chất này được tiến hành thử hoạt tính kháng viêm dựa trên khả năng ức chế sự tạo thành O2 - khi cho bạch cầu trung tính phản ứng với formyl-L-methionyl-L-leucyl-L- phenylalanin/cytochalasin B (FMLP/CB), trong số 8 hợp chất được thử hoạt tính, có 3 hợp chất gồm melodamit A (MFE1), flavokawain A (MFE3), 2,6’-dihydroxy-4’-metoxychalcon (MFE4) thể hiện hoạt tính kháng viêm. Đặc biệt nhất là hợp chất MFE1 lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên nên hoạt tính kháng viêm của MFE1 cũng là lần đầu tiên được công bố. Khả năng kháng viêm của hợp chất MFE3 đã được biết đến dựa trên khả năng ức chế sự giải phóng iNOS, COX-2, NO và PGE2 khi được kích thích bởi lipopolysaccharides (LPS) qua thử nghiệm trên đại thực bào chuột [59], nhưng là lần đầu tiên được tiến hành khảo khát khả năng kháng viêm theo phương pháp này. 22 KẾT LUẬN Lần đầu tiên ở Việt Nam, có công trình khoa học báo cáo về thành phần hóa học và cả về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ lá cây na (Annona squamosa L.) và lá cây dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.). Nghiên cứu thành phần hoá học lá cây na và lá cây dủ dẻ trâu của Việt Nam chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau:  Từ dịch chiết lá cây na (Annona squamosa L.) đã phân lập và xác định cấu trúc 5 hợp chất ent-kauran diterpenoit: axit ent-kaur- 16-en-19-oic (ASE1), axit 16-hydro-17-axetoxy-ent-kauran-19-oic (ASE2), axit 16- hydro-ent-kauran-17,19-dioic (ASE3), axit 16- hydro-19-al-ent-kauran-17-oic (ASE4), 16,17-dihydroxy-ent-kauran- 19-al (ASE5) và 02 hợp chất steroit là: β-sitosterol (ASE6) và - sitosterol-3-O--D-glucopyranozit (ASE7).  Từ dịch chiết của lá cây dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) đã chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc được 13 hợp chất bao gồm: - 01 hợp chất amit thơm mới là melodamit A (MFE1), - 08 hợp chất flavonoit là: flavokawain A (MFE3), 2,6’- dihydroxy-4’-metoxychalcon (MFE4), 2’,4’-dihydroxy-4,6’- dimetoxydihydrochalcon (MFE5), tsugafolin (MFE6), 5-O- metylnaringenin (MFE7), naringenin - 4',7- dimetylete (MFB8), kaempferol 3-O-{-D-apiofuranozyl-(12)-[-L-rhamnopyranozyl- (16)]--D-glucopyranozit} (MFB9), rutin (MFB10), - 01 hợp chất ankaloit là oxoanolobin (MFB11), - 01 hợp chất tannin là axit 3,3’,4’- trimetoxy ellagic (MFB12), - 02 hợp chất steroit là β-sitosterol (MFH2) và -sitosterol- 3-O--D-glucopyranozit (MFB13). 23 - Xác định được các thông số về cấu trúc tinh thể của hợp chất melodamit A (MFE1). Các số liệu về tinh thể học của hợp chất melodamit A (CCDC 872 187) hiện được lưu trữ tại Trung tâm dữ liệu Cambridge.  Hợp chất axit ent-kaur-16-en-19-oic (ASE1) có khả năng gây độc dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư vú (MCF-7), còn hợp chất 16,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al (ASE5) chỉ gây độc dòng tế bào ung thư vú (MCF-7), trong đó, hợp chất ASE1 gây độc tế bào ung thư vú mạnh hơn ASE5.  Hợp chất melodamit A (MFE1), flavokawain A (MFE3) và 2,6’-dihydroxy-4’-metoxychalcon (MFE4) có khả năng ức chế sự tạo thành các anion peroxit trên bạch cầu trung tính của người được hoạt hóa bởi FMLP/CB cùng với khả năng ức chế bằng con đường ức chế đánh dấu bởi p38 MAPK từ đó cho thấy chúng có hoạt tính chống viêm nhiễm. 24 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 1. Bùi Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thị Lương Thiện, Nguyễn Phan Chung, Trần Đình Thắng (2011), các hợp chất Flavonoit từ lá cây Dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum L.) ở Việt Nam, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 49 (3A) tr. 7-11. 2. Bùi Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Nguyễn Thị Hồng, Trần Đình Thắng (2011), Các hợp chất diterpenoit lá cây na (Annona squamosa L.) ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 49 (3A) tr. 106-111. 3. Bùi Thị Minh Nguyệt, Trương Thị Ngọc Hiền, Trần Đình Thắng (2012), Một số hợp chất được phân lập từ lá cây dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum L.) ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 50 (3A) tr.120-125. 4. Hsiu-Hui Chan, Tsong-Long Hwang, Tran Dinh Thang, Yann- Lii Leu, Ping-Chung Kuo, Bui Thi Minh Nguyet, Do Ngoc Dai, Tian-Shung Wu (2013,) Isolation and synthesis of melodamide A, a new anti-inflammatory phenolic amide from the leaves of Melodorum fruticosum. Planta Medica, 79 (3-4), pp. 288-294.