Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus - Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học

TÓM TẮT NGUYỄN ĐỨC DUY ANH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh “Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học” thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Bán Công thành phố Hồ Chí Minh từ ngày 15/2/2005 đến 15/6/2005. GVHD: CN. TÔ MINH CHÂU TS. LÂM THỊ THU HƯƠNG Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus acidophilus. Chúng tôi sử dụng phương pháp đếm số lượng tế bào, xác định hoạt độ enzyme amylase, protease và khả năng tạo độ chua của hai vi khuẩn nghiên cứu trên nhiều loại môi trường khác nhau. Kết quả chúng tôi ghi nhận được như sau: Đối với Bacillus subtilis Môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột là môi trường nhân giống cấp 1 có khả năng cho sinh khối và hoạt độ enzyme amylase, protease cao nhất. Môi trường A là môi trường nhân giống cấp 2 có khả năng cho sinh khối và hoạt độ enzyme amylase, protease cao nhất. Thời gian nuôi cấy thích hợp là 72 giờ. Chế phẩm chứa Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản có số lượng vi khuẩn giảm dần nhưng hoạt độ enzyme amylase và protease không thay đổi. Đối với Lactobacillus acidophilus Môi trường sữa đậu nành có nồng độ 15% đậu và bổ sung 15% đường là môi trường thích hợp nhất để sản xuất chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus. Chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus sau thời gian bảo quản ở nhiệt độ thường số lượng vi khuẩn giảm dần. Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, con người có xu hướng trở dần về với tính chất thiên nhiên thông qua việc sử dụng một số chất có hoạt tính sinh học hay các phương pháp sinh học để ứng dụng trong công nghiệp, nông nghiệp, cải thiện môi trường và để chữa bệnh. Lý do đơn giản là con người đã hiểu được mặt trái khi sử dụng các chất hóa học, chất kháng sinh. Những chất này tuy có hiệu quả nhanh chóng nhưng hậu quả mà nó mang lại rất lớn. Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản trước đây người ta thường dùng những chất kháng sinh để phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm và tôm, cá... Việc sử dụng kháng sinh trong một thời gian dài đã để lại nhiều hậu quả không mong muốn như sự kháng thuốc của vi khuẩn hoặc rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột làm bệnh tái phát nặng hơn và dẫn đến khó điều trị hơn. Nghiêm trọng hơn sự tồn dư kháng sinh trong thịt dẫn đến phẩm chất thịt giảm làm hạ giá thành sản phẩm, gây cản trở cho việc xuất khẩu làm thiệt hại rất lớn trong chăn nuôi. Để khắc phục được tình trạng này, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng trực tiếp những vi sinh vật sống, có lợi thường gọi là “probiotic”. Kết quả đã chứng minh được lợi ích của những vi khuẩn có lợi này trong việc phòng và điều trị một số bệnh trong chăn nuôi, thủy sản và cho cả con người. Điều quan trọng là nó không để lại những hậu quả hay di chứng khi sử dụng như các loại hóa chất và thuốc kháng sinh. Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học” để phục vụ trong chăn nuôi và thủy sản. 1.2. MỤC ĐÍCH Xác định được môi trường tối ưu của vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong chăn nuôi thú y và nuôi trồng thủy sản. 1.3.YÊU CẦU 1.3.1. Đối với Bacillus subtilis Thực hiện việc nuôi cấy Bacillus subtilis trên nhiều loại môi trường khác nhau để xác định xem môi trường nào làm cho vi khuẩn sinh enzyme protease và amylase nhiều nhất. Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis . Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản. 1.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus Phân lập từ chế phẩm Antibio do Hàn Quốc sản xuất. Tìm môi trường nhân giống thích hợp cho sinh khối và tạo acid lactic cao nhất. Sản xuất chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus. Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản. Phần 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN Khóa luận được thực hiện từ ngày 15/2/2005 đến 15/6/2005 tại phòng thí nghiệm Vi Sinh khoa Công Nghệ Sinh Học trường đại học Mở Bán Công thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1. Giống vi khuẩn Bacillus subtilis ATCC - 6633 được cung cấp từ khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Bán Công thành phố Hồ Chí Minh. Lactobacillus acidophilus được phân lập từ chế phẩm Antibio do Hàn Quốc sản xuất. 2.2.2.Thiết bị - dụng cụ Thiết bị: tủ ấm, tủ sấy, giá đỡ ống nghiệm, nồi hấp autoclave, tủ lạnh, giấy đo pH, kính hiển vi, cân, máy lắc, đường kế, bếp điện … Dụng cụ: ống nghiệm, que cấy, đĩa petri, pipet, micropipet, đầu type vô trùng, que cấy trang, đũa thủy tinh, khăn giấy… 2.2.3. Hóa chất Các loại thuốc nhuộm: crystal violet, fuschin, lugol Thuốc thử kowac, methyl red, NaOH 1N, HCl 1N, H2O2 30%, dầu soi kính, cồn... Dung dịch tinh bột 0,1%, dung dịch NaCl 0,1%, dung dịch iốt 0,02%, dung dịch casein 0,1%... 2.2.4. Môi trường nuôi cấy 2.2.4.1. Đối với Bacillus subtilis Môi trường tăng sinh nutrient broth (NB) Môi trường giữ giống và đếm số lượng tế bào nutrient agar (NA) Môi trường nhân giống cấp1: môi trường Frage, pepton – gelatin, rỉ đường + 2 % tinh bột, Edward và môi trường Nomura. Môi trường sản xuất: bắp, đậu nành, bột sữa, bột mì… 2.2.4.2. Đối với Lactobacillus acidophilus Môi trường tăng sinh chọn lọc MRSB Môi trường phân lập MRSA Môi trường nuôi cấy và thử các phản ứng sinh hóa Môi trường sản xuất: môi trường sữa đặc có đường và môi trường sữa đậu nành. 2.3. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.3.1. Đối với Bacillus subtilis Nhuộm Gram, kiểm tra độ thuần Hoạt độ enzyme amylase Số lượng vi khuẩn có trong 1ml Hoạt độ enzyme protease Môi trường E Chọn môi trường tối ưu nhất 10 % giống Môi trường C Môi trường D Môi trường B Môi trường A Chọn môi trường tối ưu nhất 48 giờ, nhiệt độ phòng Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis Bảo quản, kiểm tra Kiểm tra 5% giống Giống gốc Bacillus subtilis Môi trường NB (nutrient broth) Tăng sinh Môi trường Nomura s Môi trường Fragie su Môi trường rỉ đường +2 % tinh bột s s Môi trường Edwards Môi trường pepton - gelatin Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Bacillus subtilis 2.3.1.1. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 1 Giống chứa Bacillus subtilis được tăng sinh trong môi trường NB có pH = 7 trong thời gian 24 giờ/37oC. Sau 24 giờ cho dung dịch tăng sinh này vào từng loại môi trường: Edward, Nomura, Fragie, Rỉ đường + tinh bột 2 %, và pepton-gelatin với các điều kiện khảo sát: nhiệt độ phòng, pH = 7, lượng giống: 5% và thời gian nuôi cấy là 48 giờ. Sau 48 giờ tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn, hoạt độ enzyme amylase và protease. Từ kết quả kiểm tra số lượng và hoạt độ enzyme trên từng loại môi trường chúng tôi chọn được môi trường nhân giống cấp 1 tối ưu nhất để tiếp tục nhân giống trên môi trường nhân giống cấp 2. Thí nghiệm được lập lại 3 lần. 2.3.1.2. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 2 Sau khi chọn lọc được môi trường nhân giống cấp 1 tốt nhất chúng tôi tiến hành xác định môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất. Cách bố trí thí nghiệm được thực hiện như sau: Môi trường sử dụng là môi trường bán rắn được bố trí gồm 5 loại môi trường A, B, C, D và E có bổ sung CaCO3 2% để ổn định pH môi trường. Tất cả các loại môi trường trước khi đem nuôi cấy đều được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 - 20 phút. Lượng giống sử dụng ở môi trường nhân giống cấp 2 là 10% với độ ẩm của môi trường là 60 – 65%, pH = 7. Từng loại môi trường được đặt trong các khay bằng nhựa có kích cỡ 0,5 × 0,25 × 0,08 m, mỗi khay chứa 0,6 kg môi trường. Trong quá trình nuôi phải giữ ẩm cho môi trường bằng cách phủ vải ẩm. Sau thời gian nuôi 72 giờ ở nhiệt độ phòng bắt đầu thu hoạch sau đó đem sản phẩm này kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ enzyme amylase, protease. Sau khi kiểm tra trên tất cả các loại môi trường A, B, C, D và E nhằm tìm được môi trường nhân giống cấp 2 nào cho sinh khối và hoạt độ enzyme cao nhất để tiến hành sản xuất. Mỗi môi trường thí nghiệm được lập lại 3 lần. 2.3.1.3. Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis Sau khi tìm được môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất chúng tôi tiến hành sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis. Cách thực hiện tương tự như thí nghiệm 2.3.1.2. Sau thời gian nuôi 72 giờ bắt đầu thu hoạch và đem sấy ở nhiệt độ 40 - 45oC trong 2 ngày sao cho sản phẩm khô hoàn toàn. Sau đó đem đóng gói, kiểm tra và bảo quản. Quy trình sản xuất được thực hiện theo sơ đồ 2.2. Nước 60 – 65 % so với nguyên liệu Môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu Khoáng hỗn hợp Hấp khử trùng 1210C trong 20 - 25 phút Đổ lên khay Làm nguội đến 37oC Nuôi 72 giờ ở nhiệt độ phòng Giống Bacillus subtilis 10% Sấy khô 40 - 45oC Đánh tơi Xay mịn Đóng gói, kiểm tra và bảo quản Sơ đồ 2.2. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis Chế phẩm chứa Bacillus subtilis 2.3.1.4. Kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ enzyme Chế phẩm chứa Bacillus subtilis sau khi sấy khô tiến hành kiểm tra số lượng bằng phương pháp đếm khóm vi khuẩn trên đĩa, hoạt độ enzyme amylase theo phương pháp Wolhgemuth, protease bằng phương pháp Gross + Fuld và kiểm tra các chỉ tiêu trên sau thời gian bảo quản 10, 20 và 30 ngày ở nhiệt độ phòng. 2.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus Phân lập Chế phẩm Antibio (chứa L. acidophilus) MRSA MRSB tăng sinh (24 giờ /37oC) Môi trường sữa đặc có đường Môi trường sữa đậu nành 24 giờ, nhiệt độ phòng Kiểm tra Số lượng vi khuẩn có trong 1ml Độ chua Therne à tính ra lượng acid lactic Chọn khuẩn lạc điển hình Kiểm tra sinh hóa Xác định Lactobacillus acidophilus Sơ đồ 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Lactobacillus acidophilus Kiểm tra, đóng gói và bảo quản Sản xuất chế phẩm chứa L. acidophilus trên môi trường tối ưu Chọn ra môi trường tối ưu 2.3.2.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Mẫu phân lập: sử dụng chế phẩm Antibio chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus do Hàn Quốc sản xuất. 1ml Quy trình phân lập: 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Đồng nhất và pha loãng mẫu Môi trường phân lập MRSA Cấy giữ giống Chọn khuẩn lạc điển hình, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hóa Môi trường giữ giống MRSA Sơ đồ 3.4. Quy trình phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 10-2 10-3 1 gam mẫu + 9ml dd NaCl 90/00 10-4 10-1 10-7 10-6 10-5 Cách tiến hành Chế phẩm Antibio (gói/1gam) hòa vào 9 ml nước muối sinh lý (nồng độ 9 o/oo) sau đó lắc đều sao cho dung dịch trở nên đồng nhất ta được dung dịch có nồng độ pha loãng 10-1 . Tiếp theo lấy 1ml dung dịch 10-1 cho vào 9 ml dung dịch NaCl 90/00 ta được dung dịch có nồng độ 10-2. Tiếp tục như thế cho đến khi được các dung dịch có nồng độ 10-6, 10-7. Dùng micropipet hút 0,2ml dịch khuẩn ở nồng độ 10-6, 10-7 (mỗi nồng độ cho vào 2 đĩa) trang đều trên mặt thạch chứa môi trường MRSA rồi đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ và chọn khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc tròn đều, nhô lên và bên ngoài có vòng trong) đem nhuộm Gram và cấy giữ giống. Những khuẩn lạc nghi ngờ này được tăng sinh trong môi trường MRSB trong 24 giờ ở nhiệt độ 37oC để tiến hành thử các phản ứng sinh hóa. Xác định vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus được xác định dựa trên các phương pháp truyền thống như: Quan sát hình dạng tế bào khuẩn lạc và sự bắt màu khi nhuộm Gram. Thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa. 2.3.2.2. Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne trên môi trường sữa đặc có đường Giống chứa Lactobacillus acidophilus sau khi phân lập được tăng sinh trên môi trường MRSB trong thời gian 24 giờ ở 37oC. Sau đó cho lượng giống 5% vừa tăng sinh này vào môi trường sữa đặc có đường với từng nồng độ sữa là:15%, 20% và 25%. Sau thời gian nuôi 24 giờ, pH = 6,5 - 7 ở nhiệt độ phòng chúng tôi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne của từng loại nồng độ. 2.3.2.3. Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne trên môi trường sữa đậu nành Tương tự như ở thí nghiệm 2.3.2.2 sử dụng là 5% giống và môi trường là sữa đậu nành với nồng độ đậu nành là 10%, 15% và 20% ứng với mỗi nồng độ đậu chúng tôi khảo sát từng nồng độ đường cho vào là 0%, 10%, 15% và 20%. Những nồng độ này được ký hiệu như sau: Ở nồng độ 10% đậu có bổ sung từng hàm lượng đường là 0%,10%,15% và 20% được ký hiệu lần lượt là NA0, NA10, NA15, NA20. Tương tự ở nồng độ 15% đậu có: NB0, NB10, NB15 và NB20. Ở nồng độ 20% đậu có: NC0, NC10, NC15 và NC20. Sau thời gian nuôi cấy là 24 giờ, pH = 6,5 - 7 ở nhiệt độ phòng chúng tôi tiến hành kiểm tra độ chua Therne và số lượng tế bào vi khuẩn. 2.3.2.4. Tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus Từ kết quả khảo sát độ chua và số lượng vi khuẩn ở hai loại môi trường sữa đặc có đường và sữa đậu nành chúng tôi chọn được môi trường tối ưu nhất để tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus. Sau 24 giờ nuôi trên môi trường tối ưu ở nhiệt độ phòng với lượng giống cho vào là 5%. Chúng tôi bắt đầu thu hoạch và đem phối trộn với bột đậu nành khô đã qua khử trùng (sấy 100oC trong 2giờ). Tỷ lệ phối trộn là 1:1 sau đó đem sấy ở nhiệt độ 40 - 45oC trong 2 ngày sao cho sản phẩm khô hoàn toàn. Sản phẩm này được xây mịn, đóng gói sau đó đem kiểm tra và bảo quản ở nhiệt độ phòng. 2.3.2.5. Kiểm tra sản phẩm sau thời gian bảo quản Sản phẩm sau khi sấy khô chúng tôi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn có trong 1 gam sản phẩm và sau thời gian bảo quản là 10 và 20 ngày bằng phương pháp đếm số lượng tế bào sống trên thạch. 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 2.4.1. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab release 13.20 để so sánh sự khác biệt giữa các môi trường. Đối với thí nghiệm trên Bacillus subtilis Môi trường nhân giống cấp 1 và môi trường nhân giống cấp 2 chúng tôi dùng dùng trắc nghiệm 1 yếu tố để xem tác động của: Môi trường lên số lượng tế bào vi khuẩn Môi trường lên hoạt độ enzyme amylase Môi trường lên hoạt độ enzyme protease Đối với thí nghiệm trên Lactobacillus acidophilus Môi trường sữa đặc có đường dùng trắc nghiệm một yếu tố để xem ảnh hưởng của nồng độ sữa lên số lượng và độ chua của L. acidophilus. Môi trường sữa đậu nành dùng trắc nghiệm hai yếu tố là nồng độ đậu nành và hàm lượng đường trong sữa đậu nành để: So sánh sự khác biệt giữa từng nồng độ đậu và từng hàm lượng đường lên số lượng và độ chua Therne của sữa. Ảnh hưởng của nồng độ đậu và hàm lượng đường lên số lượng và độ chua của sữa. 2.4.2. Biểu đồ Biểu đồ được vẽ bằng phần mềm Excel phiên bản 2003. Phần 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐỐI VỚI BACILLUS SUBTILIS 3.1.1. Kết quả về khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 1. 3.1.1.1. Khả năng tăng sinh khối Bảng 3.1. Số lượng tế bào B. subtilis trên từng loại môi trường nhân giống cấp 1 Môi Trường Edward Fragie Nomura pepton-gelatin Rỉ đường + 2% tinh bột Lặp lại (n) (×1010 cfu/g) SD CV% 3 1,5667a 0,21455 13,69 3 1,3600b 0,391 28,78 3 1,4267b 0,411 28,83 3 0,4537c0,0773 17,05 3 1,9200d 0,2455 12,78 Ghi chú : Chữ a, b, c, d chỉ sự khác biệt về mặt thống kê giữa từng loại môi trường 3.1.1.2. Khả năng sinh enzyme amylase và protease Bảng 3.2. Hoạt độ enzyme amylase và protease trên từng loại môi trường nhân giống cấp1 Môi trường Enzyme Edward Fragie Nomura pepton-gelatin Rỉ đường + 2% tinh bột Amylase Lặp lại (n) (W0/ml) SD Cv% 3 8a 0 0 3 16b 0 0 3 26,67c 9,2376 34,63 3 10,67a 4,6188 43,28 3 265d 0 0 Protease Lặp lại (n) (Hđp/ml) SD Cv% 3 8a 0 0 3 13,33b 4,6188 34,64 3 16b 0 0 3 32c 0 0 3 128d 0 0 Qua kết quả khảo sát số lượng tế bào/ml, hoạt độ enzyme amylase, protease trên môi trường nhân giống cấp 1 chúng tôi nhận thấy rằng môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột là môi trường tối ưu nhất trong 5 loại môi trường khảo sát. Từ đây chúng tôi quyết định chọn môi trường này là môi trường nhân giống cấp 1 thích hợp nhất để sử dụng cho môi trường nhân giống cấp 2. 3.1.2. Kết quả về khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 2 3.1.2.1. Khả năng tăng sinh khối Bảng 3.3. Số lượng tế bào B. subtilis trên từng loại môi trường nhân giống cấp 2 Môi Trường A B C D E Lặp lại (n) (×1010 cfu/g) SD CV% 3 345,67a 126,595 36,62 3 155,33b 55,229 35,55 3 11,368c 1,362 11,98 3 13,26c1,623 12,24 3 12,74c 2,619 20,56 3.1.1.2. Khả năng sinh enzyme amylase và protease Môi trường Enzyme A B C D E Amylase Lặp lại (n) (W0/ml) SD Cv % 3 160a 0 0 3 160a 0 0 3 80b 0 0 3 80b 0 0 3 80b 0 0 Protease Lặp lại (n) (Hđp/ml) SD Cv % 3 80a 0 0 3 80a 0 0 3 80a 0 0 3 80a 0 0 3 40b 0 0 Bảng 3.4. Hoạt độ enzyme amylase và protease trên môi trường nhân giống cấp 2 Qua bảng 3.3 và 3.4 chúng tôi nhận thấy ở môi trường A và B có sự tương đồng về khả năng sinh enzyme amylase và protease. Tuy nhiên khi xét đến khả năng tạo sinh khối thì môi trường A là môi trường tối ưu nhất. Từ kết quả khảo sát số lượng và hoạt độ enzyme trên môi trường A, B, C, D và E, chúng tôi quyết định chọn môi trường A làm môi trường sản xuất thích hợp nhất để sản xuất chế phẩm chứa B. subtilis. 3.1.3. Kết quả kiểm tra số lượng B. subtilis và hoạt độ enzyme sau khi sản xuất chế phẩm Số lượng tế bào vi khuẩn : 58,9 × 1010 cfu/g  Hoạt độ amylase: 160 Wo/ml Hoạt độ protease: 80 Hđp/ml 3.1.4. Kết quả kiểm tra chế phẩm chứa Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis trong thời gian bảo quản Chế độ bảo quản Thời điểm kiểm tra (ngày) Số lượng tế bào (×109 cfu/g) Hoạt độ amylase (W0/ml) Hoạt độ protease (Hđp/ml) Nhiệt độ thường 10 20 30 118 88,9 68,9 160 160 160 80 80 80 Quy đổi hoạt độ enzyme amylase và protease sang đơn vị quốc tế. Hoạt độ amylase là 160 Wo/g ~ 6576 UI/ml Hoạt độ protease là 80 Hđp/ml ~ 572,8 UI/ml Biểu đồ 3.1. Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản Thời gian (ngày) Số lượng cfu/g 3.2. ĐỐI VỚI LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 3.2.1. Đặc điểm của Lactobacillus acidophilus 3.2.1.1. Quan sát đại thể Trên môi trường thạch đĩa MRSA khuẩn lạc có dạng tròn, nhỏ, ở giữa dày và đục hơn mép bên ngoài, xung quanh khuẩn lạc có vòng trong. Sau 48 giờ ở tâm khuẩn lạc có màu hơi vàng, đường kính khuẩn lạc từ 1 - 2 mm. 3.2.1.2. Quan sát vi thể Qua quan sát trên kính hiển vi chúng tôi nhận thấy vi khuẩn có dạng hình que, hai đầu tròn, kích thước trung bình từ 0,6 - 0,9 × 1,5 – 6 µm. Chúng tồn tại dạng đơn, cặp đôi hay đôi khi tạo chuỗi ngắn, bắt màu tím (Gram dương) và không có bào tử. 3.2.1.3. Đặc điểm sinh hóa Bảng 3.6. Kết quả thử phản ứng sinh hóa của Lactobacillus acidophilus Phản ứng Kết quả Lên men đường Kết quả Indol VP MR Citrat Nitrat Di động Catalase Khả năng đông vón sữa - - + - - - - + Lactose Sucrose Glucose Manitol Rabinose + + + - - Từ kết quả 3.2.1.1, 3.2.1.2 và 3.2.1.3 chúng tôi kết luận chủng vi khuẩn nghi ngờ được phân lập từ chế phẩm đó là vi khuẩn Lactobacillus acidophilus. 3.2.2. Kết quả kiểm tra số lượng L. acidophilus và độ chua Therne trên từng loại môi trường 3.2.2.1. Trên môi trường sữa đặc có đường Bảng 3.7. Khả năng tạo độ chua của L. acidophilus trên môi trường sữa đặc có đường Nồng độ sữa 15 % 20 % 25 % Lặp lại (n) (g/100ml) SD CV % 3 0,8233a 0,045 5,477 3 0,9420b 0,059 6,361 3 1,169c 0,046 4,009 Bảng 3.8. Số lượng của L. acidophilus trên môi trường sữa đặc có đường. Nồng độ sữa 15% 20% 25% Lặp lại (n) ( ×109 cfu/ml) SD CV % 3 8,83a 0,317 3,59 3 11,017b 1,086 9,86 3 21,967c 3,350 15,25 Qua bảng 3.7 và 3.8 chúng tôi nhận thấy nồng độ sữa càng cao thì khả năng tạo độ chua và sinh khối của vi khuẩn L. acidophilus càng nhiều. Độ chua và số lượng tế bào vi khuẩn cao nhất ở môi trường có nồng độ sữa 25%. 3.2.2.2. Trên môi trường sữa đậu nành Bảng 3.9. Khả năng tạo độ chua của L. acidophilus trên môi trường sữa đậu nành. Nồng độ Kết quả 10 % 15 % 20 % NA0 NA10 NA15 NA20 NB0 NB10 NB15 NB20 NC0 NC10 NC15 NC20 Lặp lại (n) (g/100ml) SD CV % 3 1,05 0,035 3,38 3 1,27 0,045 3,54 3 1,32 0,047 3,57 3 1,41 0,035 2,47 3 1,0 0,017 1.61 3 1,27 0,066 5,25 3 1,6 0,017 1,08 3 1,70 0,024 1,42 3 1,13 0,055 4,08 3 1,41 0,047 3.35 3 1,61 0,034 2,15 3 1,8 0,025 1,39 Nồng độ Kết quả 10% 15% 20% NA0 NA10 NA15 NA20 NB0 NB10 NB15 NB20 NC0 NC10 NC15 NC20 Lặp lại (n) (× 1010 cfu/g) SD CV % 3 1,093 0,066 6,08 3 1,126 0,267 23,75 3 1,37 0,157 11,47 3 1,45 0,088 6,12 3 3,60 0,156 4,33 3 5,68 0,682 12 3 7,316 0,301 4,11 3 7,993 0,507 6,35 3 3,61 0,19 5,26 3 6,04 0,359 5,94 3 7,596 0,175 2,31 3 8,093 0,102 1,26 Bảng 3.10. Số lượng của Lactobacillus acidophilus trên môi trường sữa đậu nành. Qua bảng 3.9 và 3.10 cùng với kết quả xử lý thống kê chúng tôi nhận thấy nồng độ đậu và hàm lượng đường có ảnh hưởng đến khả năng tạo độ chua và số lượng tế bào của vi khuẩn L. acidophilus. Độ chua và số lượng đạt cao nhất ở môi trường NC20. Tuy nhiên sau khi xử lý thống kê cho thấy không có sự khác biệt giữa môi trường NB15 và NC20 (P = 0,1113) hay NB15 và NB20 (P = 0,1520). Như vậy xét về mặt kinh tế ở môi trường NB15 là môi trường cho hiệu quả kinh tế cao. Từ kết quả xử lý ở trên chúng tôi quyết định chọn môi trường NB15 làm môi trường sản xuất chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus. 3.2.3. Kết quả sản xuất thử và kiểm tra chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus Bảng 3.11. Số lượng vi khuẩn L. acidophilus sau thời gian bảo quản Thời gian 0 ngày 10 ngày 20 ngày Số lượng (×106 cfu/g) 38 4,15 2,83 Thời gian (ngày) Số lượng × 106 cfu/g Biểu đồ 3.2. Số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sau thời gian bảo quản Qua bảng 3.11 chúng tôi nhận thấy số lượng vi khuẩn giảm nhiều nhất vào 10 ngày đầu và giảm dần sau thời gian bảo quản. Chế phẩm chứa B. subtilis và L. acidophilus sau khi đóng gói Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN 5.1.1. Đối với Bacillus subtilis Trong số 5 loại môi trường nhân giống cấp 1 là Edward, Nomura, Fragie, Rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột và pepton-gelatin, chúng tôi ghi nhận được môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột là môi trường có khả năng cho sinh khối và hoạt độ enzyme amylase và protease cao nhất, với số lượng tế bào là 19,2 × 109 cfu/ml, hoạt độ amylase là 256 (Wo/ml) và protease là 128 (Hđp/ml). Môi trường A là môi trường nhân giống cấp 2 có khả năng cho sinh khối và hoạt độ enzyme amylase, protease cao nhất, với số lượng tế bào là 345,67×1010 cfu/g, hoạt độ amylase là 160 (Wo/ml) và protease là 80 (Hđp/ml). Sau khi sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis có số lượng tế bào 589 × 109 cfu/g, hoạt độ amylase là 160 (Wo/ml) và protease là 80 (Hđp/ml). Sau thời gian bảo quản 10, 20 và 30 ngày ở nhiệt độ thường chúng tôi nhận thấy số lượng tế bào có giảm nhưng hoạt độ enzyme amylase và protease không thay đổi. 5.1.2. Đối với Lactobacillus acidophilus Trên môi trường sữa đặc có đường, độ chua và số lượng tế bào tăng dần khi nồng độ sữa tăng dần. Số lượng vi khuẩn và độ chua cao nhất ở nồng độ 25% sữa và có số lượng tế bào 21,96 × 109 cfu/ml và độ chua 1,1093g/100ml. Đối với môi trường sữa đậu nành số lượng và độ chua cao nhất ở môi trường NB15. Số lượng tế bào 73,1 × 109 cfu/ml và độ chua 1,6g/100ml. Chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus sau khi sản xuất có số lượng tế bào 38 × 106 cfu/g. Sau thời gian bảo quản số lượng tế bào giảm nhanh vào 10 ngày đầu sau đó giảm dần sau thời gian bảo quản. 5.2. ĐỀ NGHỊ Cần khảo sát thêm khi nuôi cấy B. subtilis ở từng thời điểm khác nhau như 24, 36 giờ để xác định chính xác điều kiện tối ưu nhất để sản xuất chế phẩm. Chiết xuất ra enzyme tinh khiết phục vụ trong chăn nuôi và các ngành công nghiệp khác. Khảo sát thêm khả năng sinh enzyme lipase của vi khuẩn Bacillus subtilis. Cần phân lập thêm nhiều chủng Lactobacillus acidophilus từ nhiều nguồn khác nhau như sữa chua, nem… để tìm ra chủng tốt nhất phục vụ cho sản xuất. Sản xuất trên dây chuyền khép kín với số lượng lớn để hạ giá thành sản xuất 5.3. TỒN TẠI Chưa kiểm tra được khả năng ức chế của chế phẩm đối với các vi khuẩn gây bệnh như E. coli, Salmonella… Chưa kiểm tra được độ an toàn cũng như tác dụng của chế phẩm trên thú và thủy sản.