Nghiên cứu vòng đời của vi tảo lục Haematococcus pluvialis trong điều kiện phòng thí nghiệm

òn chứa một số sắc tố bổ trợ như phycobiliprotein và carotenoit. Các loại carotenoit thông thường chỉ chiếm 0,1% TLK của vi tảo nhưng ở một số loài, chúng có thể đạt từ 5-14% TLK. Các sắc tố này có thể đánh dấu kháng thể đơn dòng ứng dụng trong nghiên cứu miễn dịch. Mặt khác, phycobiliprotein và β-caroten được biết đến như những yếu tố nâng cao sức đề kháng của cơ thể và là chất hỗ trợ phòng chống bệnh ung thư. Vi tảo còn chứa một lượng lớn carbonhydrat dưới dạng sản phẩm dự trữ (tinh bột, glycogen) hoặc các chất điều hoà thẩm thấu (glyceron, trehalose, glucose…). Ngoài ra có thể liệt kê một số chất chống oxy hoá có mặt trong sinh khối tảo như carotenoit (sắc tố), tocopherol, VTM C (VTM), superoxydismutase, catalase và glutation peroxydase (enzyme). Các vi tảo - nguồn các chất chống oxy hoá có triển vọng đang được khai thác là: Dunaliella salina: để sản xuất β-caroten, Heamatococcus pluvialis: để sản xuất astaxanthin, Porphyridium cruentum: để sản xuất Superoxydismutase (SOD). Vi tảo còn là nguồn cung cấp các chất có hoạt tính kháng sinh (như kháng vi khuẩn, nấm). Ví dụ như: axit acrylic thu từ vi tảo Phaecystis, axit g- linoleic trong dịch chiết methanol từ tảo Spirulina platensis, Chrococcum... Testraselamiss suecia là một chất ức chế hình thành virus Vibrio sp.,. Một lượng lớn các chất tách từ vi tảo biển có vai trò diệt tảo độc hoặc thuốc trừ sâu như cyanobacterin tách từ Scytonema hofmanni đã được công bố [7]. 1.3. Thực trạng nghiên cứu - nuôi trồng vi tảo hiện nay: 1.3.1. Trên thế giới: Tảo được trồng đại trà ở các nước trên thế giới từ những năm 1972, các nước sản xuất vi tảo chủ yếu tập trung ở Châu Á và vành đai Thái Bình Dương. Những khu vực và vùng lãnh thổ có sản lượng vi tảo lớn là Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Hàn Quốc, Thái Lan, Isarel, Hoa Kỳ, Mexico… Nhiều nhất là ở Mexico và Mỹ, nơi sản xuất tảo lớn nhất là ở Hawaii (khoảng 25 ha) và mới đây là Trung Quốc (16 ha). Trên thế giới còn có các trang trại nuôi trồng tảo với quy mô lớn, chất lượng cao như: Trang trại Twin Tauong (Myanmar) - Trang trại Sosa Texcoco (Mehico) - Công ty tảo Siam (Thái Lan) - Trang trại Chenhai (Trung Quốc) - Nông trại Hawai (HoaKỳ)… Tảo Spirulina được sử dụng như thực phẩm dinh dưỡng ở hơn 70 quốc gia trên thế giới. Người ta chỉ ra rằng ở hơn 30 trung tâm dinh dưỡng và bệnh viện ở các nước đang phát triển đã sử dụng chế phẩm từ tảo Spirulina làm thức ăn với hàm lượng 10g/ngày, kết quả cho thấy các bệnh nhân hồi phục trạng thái suy dinh dưỡng chỉ sau 1- 3 tuần lễ. Hiện có hơn 1000 bài báo khoa học được xuất bản đề cập đến hiệu quả sinh học của loài tảo này [40]. 1.3.2. Ở Việt Nam: Việt Nam có lợi thế là nước nhiệt đới, khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật, nhất là tảo ngày càng phát triển. Từ năm 1972 các nhà khoa học bắt đầu đặt vấn đề nghiên cứu tảo do cố GS.TSKH. Nguyễn Hữu Thước làm chủ trì. Năm 1976, việc thử nghiêm nuôi trồng tảo đã được tiến hành trong 4 - 5 tháng ở Nghĩa Đô, Hà Nội và thu được kết quả khá khả quan. Năm 1985, Sở Y Tế thành phố Hồ Chí Minh đã tiếp nhận giống tảo đầu tiên do ông bà R.D.Fox tặng. Sau đó, tảo giống được giao cho trạm nghiên cứu dược liệu giữ giống và nuôi trồng [39]. Hiện có 2 nơi nuôi trồng tảo ở nước ta, đó là: Công ty cổ phần nước khoáng Vĩnh Hảo (Bình Thuận) - đơn vị tiên phong trong việc nuôi trồng và sản xuất tảo lớn nhất nước ta. Ngoài ra còn một cơ sở ở Bình Chánh, thành phố Hồ Chí Minh. Nhìn chung, lịch sử nghiên cứu và nuôi trồng tảo ở nước ta đã có từ lâu và thu được nhiều kết quả ban đầu đáng khích lệ. Nhưng cho đến nay việc nuôi trồng đa số vẫn mang tính nhỏ lẻ, lạc hậu, không đáp ứng được nhu cầu sử dụng tảo ngày càng tăng cao. Vì vậy, trước những giá trị về mọi mặt mà tảo mang lại, cần phải tiến hành cải thiện, thúc đẩy ngành công nghiệp nuôi trồng tảo nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước và xuất khẩu ra thị trường nước ngoài. 1.4. Tổng quan về Haematococcus pluvialis Haematococcus pluvialis là một loài vi tảo lục, nước ngọt, đơn bào, sinh sản vô tính bằng cách nhân đôi, có thể di chuyển được [14]. Đây là một loài tảo có tiềm năng rất lớn vì khả năng tổng hợp astaxanthin của nó. Lượng astaxanthin tối đa mà loài tảo này có thể đạt được lên tới 5-6% TLK [11; 12]. Astaxanthin là một sắc tố được sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản, giúp tăng chất lượng và màu sắc thịt cá hồi và làm cá cảnh có màu sắc rực rỡ. Tuy nhiên để có thể nuôi trồng thành công và đạt được hàm lượng astaxanthin cao thì chúng ta phải biết về các giai đoạn sinh trưởng cũng như các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển của loài tảo H.pluvialis trong từng giai đoạn ấy. 1.4.1. Vị trí phân loại của Haematococcus pluvialis Vị trí của Haematococcus pluvialis trong hệ thống phân loại như sau [33]: Giới: Eukaryota Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae Bộ: Volvocales                   Họ:  Chlamydomonadales Chi:  Haematococcus  Loài: Haematococcus pluvialis. 1.4.2. Đặc điểm hình thái và sự thay đổi các thành phần nội bào trong vòng đời của vi tảo lục H.pluvialis: Tảo đơn bào nước ngọt Heamatococcus pluvialis (H. pluvialis) thuộc nhóm tảo lục hai roi và có khả năng chuyển động ở giai đoạn sinh dưỡng [32]. Sinh sản vô tính bằng cách nhân đôi. Hình thái TB của H.pluvialis có sự biến đổi khác nhau trong chu trình sống của chúng. TB có 2 dạng, tương ứng với đặc điểm sinh trưởng: TB sinh dưỡng và nang bào tử (cyst). Trong đó: Hình 2. a. Tế bào H.pluvialis ở dạng sinh dưỡng, b. Tế bào H.pluvialis ở dạng nang bàng tử (cyst)[36] - TB sinh dưỡng: màu xanh, dạng cầu hoặc elip với đường kính khoảng 10-20 µm, có thể chuyển động nhờ 2 roi. Trong điều kiện thuận lợi, phần lớn TB ở dạng sinh dưỡng, có hàm lượng chlorophyll a, b và tiền carotenoit, đặc biệt là β-carotene và lutein cao [47]. Sinh trưởng quang tự dưỡng khi có ánh sáng [11] và dị dưỡng trong tối [32]. - Nang bào tử: Khi gặp điều kiện bất lợi (cạn kiệt dinh dưỡng, cường độ ánh sáng cao, nhiệt độ cao, stress muối….) TB sẽ cảm ứng hình thành nang bào tử và hình thái thay đổi sang dạng cyst. TB dạng này hình cầu, mất roi, không còn khả năng di động. Thành TB dầy lên. Đường kính của TB tăng lên đột ngột tới 40-50 µm [27]. Ngoài ra, những TB nang này có hàm lượng carotenoit thứ cấp như echinenone, canthaxanthin và astaxanthin cao trong khi đó hàm lượng chlorophyll và tiền carotenoit lại giảm [13]. Tốc độ sinh trưởng của H. pluvialis ở giai đoạn này giảm, TB tích luỹ một lượng lớn astaxanthin. Ban đầu, astaxanthin chủ yếu được hình thành tập trung quanh nhân và quá trình được tiếp diễn tới khi toàn bộ TB chuyển sang màu đỏ [26]. Các TB dạng cyst có hàm lượng astaxanthin đạt khoảng 5% TLK [31]. Thời gian chuyển pha mất khoảng vài tuần dưới điều kiện quang tự dưỡng [14]. Cùng lúc với sự thay đổi hình thái và kích thước TB là sự thay đổi hàm lượng sắc tố và protein nội bào, trong đó diễn ra sự tích lũy asxanthin cao. Theo một số công bố cho thấy hàm lượng chlorophyll không thay đổi trong suốt quá trình tích lũy astaxanthin, [17] nhưng trong nghiên cứu của Spery, 1970 [34] lại cho rằng hàm lượng này có xu hướng giảm đi. Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới về vòng đời của vi tảo H.pluvialis đã chỉ ra rằng sinh trưởng của loài tảo này trải qua 4 giai đoạn với hình thái, kích thước TB, hàm lượng sắc tố và protein nội bào khác nhau. Theo Kobayashi và cs., [24] vòng đời của H. pluvialis trải qua các giai đoạn như sau (hình 3): Hình 3. Sự thay đổi hình thái trong vòng đời của H.pluvialis (I) Giai đoạn TB sinh dưỡng: TB hình elip, chuyển động bằng hai roi, phân chia TB để gia tăng số lượng. Hàm lượng carotenoit trong TB thấp. (II) Giai đoạn tạo bào nang: Các TB sinh dưỡng chuyển sang dạng màu nâu, hình khối cầu, mất roi. Trong suốt giai đoạn nang bào, mức độ sinh tổng hợp carotenoid và protein tăng lên [25]. (III) Giai đoạn TB nang hoàn chỉnh: TB nang đã hoàn chỉnh, bất động, tích lũy hàm lượng carotenoit cao nhất. (IV) Giai đoạn nảy mầm: Xảy ra sự tổng hợp chlorophyll và protein, xuất hiện sự phân giải carotenoit. Trong vòng đời của tảo, TB sinh dưỡng chứa hàm lượng cao chlorophyll và protein nhưng hàm lượng carotenoit rất thấp. Khi quá trình bao nang kèm theo việc giảm sút hàm lượng cholophyll và protein. TB trưởng thành và tăng quá trình sinh tổng hợp carotenoit, giảm protein. Sự nảy mầm cùng với tổng hợp chlorophyll, protein và giảm carotenoit. Sự bao nang, trưởng thành và chín thường được quan sát dưới kính hiển vi. Sự tích lũy carotenoit/chlorophyll được thể hiện qua các thông số để phân biệt giữa các TB sinh dưỡng (lục), các TB còn non (nâu), và TB chín (đỏ). Tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a vào khoảng 0.5; 1.0 và 7.0 trong TB sinh dưỡng, non và chín [25]. 1.4.2. Tổng quan về astaxanthin: Carotenoit là dẫn xuất của các hợp chất isopropenoit. Chúng tạo nên các màu sắc khác nhau trong tự nhiên và có các chức năng sinh học thiết yếu đối với động vật. Astaxanthin (- 3,3’-dihydroxy-β,β’-carotene-4,4’-dione) là một oxycarotenoit, có công thức phân tử C40H52O4, khối lượng phân tử M = 595, điểm nóng chảy xấp xỉ 224˚C, một chất thuộc nhóm carotenoit. Astaxanthin được tìm thấy trong nhiều loại hải sản như cá hồi, cá vền (seabream), tôm, cua, trứng cá, đôi khi nó cũng được phát hiện ở một số loài chim [18]. Ngoài tự nhiên, astaxanthin tồn tại ở dạng liên kết với protein tạo phức chất màu xanh đen. Khi gia nhiệt hay bị oxy hoá, liên kết bị cắt đứt, giải phóng astaxanthin tự do có màu đỏ cam. Động vật có vú không có khả năng tổng hợp astaxanthin mà phải được cung cấp từ khẩu phần ăn. Ở H. pluvialis, astaxanthin được tổng hợp ở giai đoạn tạo bào nang và là loại sắc tố rất đặc trưng, có giá trị kinh tế cao. Astaxanthin có vai trò là một chất chống oxi hóa với hoạt tính cao hơn các carotenoit khác nhiều lần nên được gọi là một “siêu VTM E”. Màu sắc của các loại giáp xác bắt nguồn từ loại carotenoit chúng thu nhận trong thức ăn, chính là astaxanthin. Nó còn có vai trò thúc đẩy sự thành thục, tăng tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ sống sót của trứng và cải thiện sự phát triển của phôi [18]. 1.4.3. Các yếu tố môi trường khác nhau: * Ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng của H. Pluvialis: gồm các yếu tố sau: Ánh sáng: Cường độ ánh sáng tối ưu cho sinh trưởng của H. pluvialis dao động từ 2-24 klux [15; 16; 23]. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của H. pluvialis dao động từ 15-27˚C [26; 33]. pH tối ưu cho sự phát triển của H. pluvialis nằm trong khoảng từ 6,5-8 [27]. Cuối cùng là nguồn dinh dưỡng: Bao gồm đa lượng và vi lượng. Dinh dưỡng đa lượng phải được cung cấp với lượng lớn (carbon, nitơ, phospho, canxi...). Tốc độ sinh trưởng của H. pluvialis cao khi nồng độ nitơ và phospho cao. Các nguyên tố vi lượng chỉ cần cung cấp với hàm lượng thấp, dao động từ mức μg/l đến mg/l. Một số dinh dưỡng vi lượng cần thiết cho sinh trưởng của tảo đã được biết gồm sắt, boron, mangan, đồng và các VTM... [23]. * Ảnh hưởng tới sự tích luỹ astaxanthin ở H. pluvialis Khả năng tích luỹ astaxanthin ở H. pluvialis cũng bị phụ thuộc rất nhiều vào những thông số môi trường sau [22]: Ánh sáng là yếu tố quan trọng kích thích quá trình sinh tổng hợp carotenoit, đặc biệt là astaxanthin ở H. pluvialis. Cường độ ánh sáng tối ưu cho tổng hợp - tích luỹ astaxanthin ở H. pluvialis dao động từ 75-100 klux. Tuy nhiên khả năng sinh tổng hợp carotenoit còn phụ thuộc vào chất lượng ánh sáng (dưới ánh sáng xanh hiệu quả hơn ánh sáng đỏ). Nhiệt độ: việc tổng hợp và tích luỹ astaxanthin tăng lên dần dần khi tảo được nuôi trồng ở điều kiện nhiệt độ cao. Nhiệt độ tối ưu cho sự tổng hợp astaxanthin là trên 30˚C [36; 15]. Cuối cùng là các yếu tố dinh dưỡng: Nguồn carbon và nitơ: Đối với H. pluvialis, giới hạn nguồn nitơ là yếu tố chìa khoá cho tổng hợp và tích luỹ astaxanthin [24]; Phospho: Trong điều kiện thiếu hụt phosphate, H. pluvialis có thể tích luỹ một lượng lớn astaxanthin [19; 10]; Stress độ mặn: dưới điều kiện stress độ mặn, tích luỹ astaxanthin trong bào nang xảy ra cả trong tối và ngoài sáng. 1.5. Nguồn cung cấp astaxanthin: 1.5.1. Nguồn astaxanthin tổng hợp hoá học Hiện nay, astaxanthin tổng hợp là nguồn cung cấp chủ yếu cho nuôi trồng thuỷ sản. Hơn 95% astaxanthin tổng hợp trên thị trường được sử dụng làm thức ăn, tạo ra các màu sắc khác nhau. Dù vậy, nguồn astaxanthin này có giá thành rất cao, không tinh khiết và tiềm ẩn nhiều sản phẩm phụ có nguy cơ gây hại. 1.5.1. Các nguồn astaxanthin trong tự nhiên Nguồn astaxanthin được tìm thấy trong nhiều đối tượng như từ phế liệu giáp xác thuỷ sản: (astaxanthin tập trung chủ yếu ở phần vỏ ngoài, chiếm 58-87% carotenoit tổng số) [11], từ nấm men Phaffia rhodozyma [6], một số loại vi khuẩn như Mycobacterium lacticola, Brevibacterium sp. và một số chủng nấm mốc thuộc chi Peniophora cũng có khả năng tích luỹ astaxanthin (khoảng 30 μg/g TB) [14]. Tuy nhiên hàm lượng astaxanthin tích lũy được lại ít, quá trình sinh trưởng – phát triển diễn ra chậm nên không thích hợp để sản xuất trên quy mô công nghiệp. Ngoài ra còn một nguồn cung cấp astaxanthin khác có triển vọng hơn những đối tượng trên, đó là vi tảo: Astaxanthin có thể được sản xuất từ nhiều loại vi tảo khác nhau như Ankitrodesmus branuii, Chlorella zofingiensis, Dunaliella salina, Chlamydomonas (<50 μg/g TB)... nhưng hàm lượng astaxanthin ở những đối tượng này lại khá thấp và không thích hợp để sản xuất thương mại. Trong khi đó loại tảo lục Heamatococcus pluvialis đã thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà nghiên cứu và sản xuất ứng dụng vì chúng có khả năng tích luỹ 1 lượng lớn astaxanthin (7.000-55.000 μg/g TB, tương ứng 0,7-5,5% SKK) [37]. Trước đây, giá thành sản xuất vi tảo rất cao (khoảng 5-20 USD/kg SKK) nên khó có thể sử dụng nguồn H. pluvialis để sản xuất astaxanthin cho mục đích thương mại. Gần đây, nhờ sự phát triển mạnh mẽ các kĩ thuật, công nghệ trong nuôi trồng vi tảo nên giá thành sản xuất H. pluvialis đã giảm đáng kể và làm cho loại vi tảo này thực sự trở thành một trong những nguồn astaxanthin tự nhiên quan trọng, có tiềm năng thương mại lớn nhất hiện nay. 1.6. Vai trò của Haematococcus pluvialis trong sản xuất astaxanthin Trong nuôi trồng thuỷ sản H. pluvialis được đánh giá là nguồn cung cấp astaxanthin phù hợp, có giá thành thấp để cung cấp làm nguồn thức ăn cho cá hồi vì nó tổng hợp và tích luỹ được một lượng lớn astaxanthin. Theo các tài liệu đã công bố, để sinh khối tảo nuôi trồng có hàm lượng astaxanthin cao, H. pluvialis cần phải được nuôi cấy theo 2 pha liên tục. Giai đoạn đầu gọi là giai đoạn tăng sinh khối TB (Green Stage): H. pluvialis được nuôi ở điều kiện thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển để tăng sinh khối tối đa. Giai đoạn này bắt đầu từ khi nuôi tảo trong nhà từ khuẩn lạc rồi tiếp tục nuôi ngoài trời trong các photobioreactor sử dụng năng lượng ánh sáng mặt trời. Giai đoạn thứ hai là giai đoạn kích thích sinh tổng hợp astaxanthin (Red Stage): sự tổng hợp astaxanthin được kích thích bằng cách thay đổi điều kiện môi trường theo hướng bất lợi (stress), chủ yếu là chiếu sáng với cường độ cao và thay đổi môi trường sinh trưởng. Theo đó, các TB H. Pluvialis bắt đầu hình thành dạng nang bào, tổng hợp, tích luỹ dần dần astaxanthin dưới dạng ester hoá. Sau giai đoạn hai, hàm lượng astaxanthin trong TB tảo có thể đạt 4-6% TLK. Khả năng tích lũy astaxanthin của TB tảo H. pluvialis phụ thuộc rất lớn vào mức độ bất lợi của điều kiện nuôi trồng như: ánh sáng, chất dinh dưỡng… [22]. Tuy nhiên, nuôi trồng tảo H. pluvialis hiện nay đang gặp rất nhiều khó khăn. Nguyên nhân chính là do tảo này có tốc độ sinh trưởng chậm và chu kì sống phức tạp, biểu hiện TB ở từng giai đoạn khác nhau là khác nhau nhưng những giai đoạn nêu trên đều chưa được làm sáng tỏ. Ở Việt Nam, vi tảo lục H.pluvialis là đối tượng nghiên cứu hoàn toàn mới, chưa có công trình nào nghiên cứu đầy đủ về đối tượng này. Trước tình hình đó, việc tiến hành nghiên cứu để có thêm những hiểu biết về các đặc điểm chính trong chu trình sống cũng như một số đặc điểm sinh học của loài tảo H. pluvialis là rất cấp thiết. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu vòng đời của vi tảo lục Haematococcus pluvialis trong điều kiện phòng thí nghiệm”. PHẦN 2 VẬT LIỆU NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Chủng giống Chủng tảo Heamatococus pluvialis Flotow (H. pluvialis) phân lập tại Hoà Bình, năm 2009 được nuôi cấy và lưu giữ trên môi trường C tại phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học ở 250C, dưới cường độ chiếu sáng 2 klux với chu kỳ sáng tối 12 : 12 giờ. 2.1.2. Môi trường sử dụng trong quá trình nghiên cứu: Môi trường được sử dụng trong toàn bộ quá trình nghiên cứu là hai môi trường C và RM theo công bố của Rudic, 2005. Thành phần môi trường C và RM được chỉ ra ở bảng 1: Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của môi trường C và RM được dùng trong nghiên cứu Thành phần môi trường Môi trường (mg/l) Thành phần môi trường Môi trường (mg/l) C RM C RM NaNO3 - 300 H3BO3 - 0,3 K2HPO4 - 80 MnCl2.4H2O 0,108 - KH2PO4 - 20 MnSO4.H2O - 1,5 Ca (NO3)2 150 - ZnSO4. 7 H2O 0,066 0,1 KNO3 100 - Na2MoO4. 2 H2O 0,0075 - b-Na2glycerolphosphate 50 - (NH4)6Mo7O24. 4H2O - 0,3 MgSO4.7 H2O 40 10 CuSO4.5 H2O - 0,08 CaCl2. 2 H2O - 58,5 Co(NO3)2.6 H2O - 0,26 EDTA-Na2 2,71 - FeCl3.6 H2O 5,888 17 EDTA - 7,5 CoCl.6H2O 0,012 - NaCl - 20 Trisaminomethane 500 - Vitamin B12 0,0001 - Biotin 0,0001 - Thiamine-HCl 0,01 - Ghi chú: (-): không có. 2.1.3. Hoá chất: - Các hóa chất dùng để pha môi trường nuôi tảo: C, RM đều do Trung Quốc và Việt Nam sản xuất, các VTM B12, H, B1 (Việt Nam) - Các hóa chất sử dụng cho tách chiết protein và sắc tố: các hóa chất để pha dung dịch A, dung dịch B; NaCl 1M; NaCl 0,01M; Aceton; thuốc thử Folin; nước cất vô trùng… 2.1.4. Máy móc và thiết bị: - Pipetteman các loại (Gilson, France); Pipette Pasteur (USA); Pipette tự động; Tủ lạnh sâu -80oC (Sanyo, Japan); Cân kỹ thuật Precisa XB 1200C (max 1200 g; e= 0,1 g; min 0,5 g; d= 0,01 g) (Switzerland); Cân phân tích AY 120 (Shimadzu, Japan) Shimadzu AY 120 (max 120g; d= 0,1mg); Máy đo OD UV 1601 (Shizuma, Japan); Máy ly tâm Sorvall Legen RT 1900W (Kendro, Germany); Kính hiển vi quang học Olympus CX21 (Japan); Máy khử trùng ALP (Japan); tủ sấy trọng lượng khô Gallenkamp (USA); buồng đếm Burker-Turk (Germany) ; máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY Digital 70 (Japan); Máy đo pH Melter Toledo (Germany); máy nén khí, các loại cột lọc khí, màng lọc khí Satarious (Mỹ); các bình tam giác loại 250 ml,...đều được sử dụng cho nuôi tảo. - Các dụng cụ thông thường khác của phòng thí nghiệm phục vụ cho thí nghiệm và nghiên cứu. 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: - Địa điểm: Phòng công nghệ Tảo, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam. - Thời gian: 23/02/2011 đến 22/05/2011. 2.3. Phương pháp nghiên cứu: 2.3.1. Mô tả thí nghiệm vòng đời: Chủng tảo Haematoccus pluvialis được nuôi trong môi trường C khoảng 2-3 ngày, khi đó các TB chủ yếu ở trạng thái sinh dưỡng (khoảng 80-90% tổng số TB). Dịch này được ly tâm ở 6000 vòng/5 phút. Loại bỏ phần dịch trên, thu cặn TB và bổ sung môi trường C và RM mới. Lắc đều rồi chia dịch tảo vào 2 bình tam giác 250 ml chứa 150 ml dịch tảo/bình. Thí nghiệm vòng đời được tiến hành ở 2 môi trường C và RM cấp độ bình tam giác 250ml. Thành phần môi trường C và RM được chỉ ra ở bảng 1. Mỗi công thức môi trường tiến hành lặp lại 2 lần. Mật độ TB ban đầu trong các công thức thí nghiệm là 6x104 TB/ml. Các bình tam giác chứa dịch tảo được nuôi đến khi màu sắc dịch tảo chuyển từ màu xanh sang màu đỏ đậm. Khi đó, lượng dịch này được ly tâm ở 6000vòng/5 phút và chuyển sang môi trường C và RM mới để nảy mầm trở lại. Các bình tam giác thí nghiệm được nuôi quang tự dưỡng dưới điều kiện nhiệt độ 250C và chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang có cường độ chiếu sáng 2-3 klux với chu kỳ sáng tối 12:12. Trong 24 giờ đầu, mẫu được lấy 2 tiếng/lần. Sau 24 giờ đầu tiên, lấy mẫu 2 ngày/lần, sau đó mẫu sẽ được tiến hành xác định các thông số sinh trưởng của tảo. Vòng đời tự nhiên của tảo H.pluvialis trong hai môi trường C và RM được xác định thông qua sự thay đổi hình thái TB, mật độ TB, hàm lượng sắc tố (chlorophyll a, astaxanthin) và hàm lượng protein qua các giai đoạn sinh trưởng khác nhau. - Xác định hình thái TB: Quan sát TB tảo dưới kính hiển vi quang học OLYMPUS CX21 (Nhật Bản) ở độ phóng đại 400 lần và chụp lại hình thái. Đo kích thước TB bằng phần mềm Map info. - Mật độ TB: Mật độ TB tảo được đếm bằng buồng đếm hồng cầu Burker – Turk (Đức). - Xác định sinh trưởng bằng phương pháp đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng 680nm. Phân tích hàm lượng sắc tố chlorophyll a và astaxanthin theo Strickland & Person. - Phân tích hàm lượng protein được định lượng theo phương pháp Lowry. 2.3.2. Phương pháp xác định hình thái tế bào: Hình thái TB được chụp bằng máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY 7.0 của Nhật Bản ở điều kiện: dưới kính hiển vi quang học Olympus CX21 ở độ phóng đại 400 lần và độ phóng đại của máy ảnh 3 lần. Kích thước TB được đo bằng phần mềm MapInfo Professional 7.5: Sử dụng thước chuẩn để chụp ảnh chuẩn và tiến hành chụp ảnh TB cùng độ phóng đại với ảnh chuẩn sau đó chuyển ảnh vào máy tính và sử dụng công cụ đo khoảng cách trong phần mềm để xác định kích thước TB, công thức xác định kích thước: KT tb (ft) x 25 (µm) Kích thước TB (µm) = KT tc (ft) KT tb (ft): kích thước TB đo được trên ảnh bằng phần mềm. KT tc (ft): kích thước đo được trên ảnh của đoạn thước chuẩn kích thước thực tế là 25 µm. 2.3.3. Xác định tốc độ sinh trưởng của tảo bằng phương pháp đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng 680nm: Mật độ TB tảo H.pluvialis trong môi trường có thể được xác định một cách gián tiếp nhờ phương pháp đo mật độ quang học tại bước sóng 680nm trên máy quang phổ (OD680). Theo phương pháp này, số lượng photon ánh sáng bị hấp thụ tỉ lệ thuận với lượng sinh khối TB trong mẫu đem đo (trừ những mẫu có nồng độ tế bào quá đậm đặc), hay nói cách khác là trong những điều kiện sinh trưởng nhất định thì OD tỉ lệ thuận với mật độ TB. Đối với H.pluvialis mỗi lần đo, thu 3-5ml dịch tảo, đo OD ở bước sóng ánh sáng 680nm. Trong quá trình đo, nếu giá trị OD > 1,0 thì cần pha loãng dịch tảo sao cho OD luôn nhỏ hơn 1,0. 2.3.4. Xác định sinh trưởng của tảo bằng đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm Burker – Turk: Dụng cụ để xác định mật độ tế bào là kính hiển vi Olympus CX21 (Japan), buồng đếm Burker – Turk (Germany), lamen. Dùng pippete man trộn đều mẫu cần đếm, pha loãng mẫu (nếu thấy cần thiết) và nhỏ một lượng cần thiết (40µl) chia đều vào mỗi buồng đếm, đậy lamen sao cho lamen không lệch ra khỏi buồng đếm, không tạo bọt, sau đó đặt buồng đếm lên kính hiển vi. Điều chỉnh tiêu cự của kính hiển vi quang học và tiến hành quan sát ở vật kính 10X để tìm được buồng đếm trên thị trường, điều chỉnh ốc vi cấp để quan sát TB rõ hơn. Tiến hành đếm trên cả 16 ô lớn trong buồng đếm, chú ý khi đếm phải quy ước cạnh được đếm trên ô vuông lớn. Số lần đếm được lặp lại 2 đến 8 lần. Mật độ TB được tính theo công thức sau: D = A*X*104 D: Mật độ tế bào (tb/ml) A: Tổng số tế bào trong cả buồng đếm X: Hệ số pha loãng (Chú ý: đối với các mẫu tảo có khả năng di động, trước khi đếm mẫu phải được cố định bằng dung dịch 98% Ethanol hoặc 4% Foocmon). * Xác định các thông số tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ) của tảo theo mật độ TB: Tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ/ngày): µ = (ln Nt – ln N0)/(tt - t0) Trong đó: Nt , N0 là mật độ TB ở thời điểm tt và t0 (TB/ml); t là thời gian (ngày) [29]. 2.3.5. Xác định hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b, carotenoit của TB H. pluvialis Sinh khối tảo được nghiền với cát thủy tinh và chiết trong 10ml acetone 90%. Lọc lại dịch với giấy lọc GF/C, thu lấy dịch trong, định mức lại 10ml bằng acetone. Phần dịch trong này được đo ở các bước sóng 665, 645, 630 và 480 nm. (Lưu ý: toàn bộ quá trình trên phải tiến hành trong tối). Hàm lượng các sắc tố nói trên được tính theo công thức sau [35]: mg sắc tố/m3 (mg/l) = C / V Trong đó: V: lượng thể tích dịch tảo đem lọc (lít) C: giá trị nhận được từ các công thức sau C (chlorophyll a) = 11,6*E665 – 1,31*E645 – 0,14*E630 C (chlorophyll b) = 20,7*E645 – 4,34*E665 – 4,42 *E630 C (carotenoit tổng số) = 4,0*E480 Với Ei : là giá trị OD đo được ở bước sóng i. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy hàm lượng carotenoid tổng số của TB H. pluvialis được xem chủ yếu là astaxanthin và được hấp thụ ở bước sóng 480nm. Do vậy, hàm lượng carotenoit ở tảo H. pluvialis được xem chính là hàm lượng của astaxanthin [21]. 2.2.6. Xác định hàm lượng protein của H. pluvialis: - Tách chiết protein: Lọc 10ml dịch tảo bằng giấy lọc GF/C, cho vào lọ penicilin, cất trong ngăn đá tủ lạnh. Dùng panh gắp giấy lọc có sinh khối tảo vào cối sứ đặt trong hộp đá, thêm cát thuỷ tinh, nghiền bằng chày cho đến khi sinh khối thấy mịn, thêm 1ml dung dịch NaCl 1M, nghiền tiếp, chuyển vào lọ penicilin. Sau đó tráng chày cối bằng 3ml dung dịch NaCl 1M, chia làm 3 lần đến khi dịch tráng không còn màu xanh để thu sinh khối 1 cách tối đa. Đem ủ lạnh trong 2h, ly tâm 12000 vòng/5 phút, thu lấy phần dịch trên cho sang lọ penicilin khác. Thêm 2V axeton, ủ lạnh qua đêm, ly tâm 12000 prm/10 phút, thu tủa, làm khô tủa trong 10 phút, hoà tan tủa trong 100 μl dung dịch NaCl 0,01M. Ly tâm 10000 prm/20 phút, thu lấy phần dịch trong phía trên để tiến hành làm phản ứng Lowry. - Định lượng protein theo phương pháp Lowry [28]: Nguyên tắc của phương pháp: Đây là phương pháp xác định hàm lượng protein rất nhạy và thông dụng dựa trên phản ứng tạo phức giữa thuốc thử Folin-Ciocalicau (chứa axit phospho molybdic, natriwonfamat) với các axit amin thơm có trong phân tử protein (phenylalanin, tirozin, triptophan). Phản ứng xảy ra rất phức tạp, sản phẩm tạo thành là dạng khử của phospho molipdat và natriwonfamat có màu xanh đen (dark blue) được đo độ hấp thụ ánh sáng ở vùng ánh sáng đỏ (620 - 720nm). Hạn chế của phương pháp này là chỉ xác định được hàm lượng những protein chứa các axit amin thơm. Chẳng hạn gelatin là một protein chứa rất ít các axit amin thơm do đó không thể áp dụng được phương pháp này. - Hoá chất: gồm: Dung dịch A: 2% Na2CO3 hoà tan trong NaOH 0,1 N; dung dịch B: 0,5 % CuSO4.5H2O trong dung dịch 1% natri; dung dịch C: là hỗn hợp của dung dịch A và B với tỷ lệ 49A.1B (v/v) và thuốc thử Folin. Lưu ý: dung dịch C chỉ pha trong ngày dùng. - Tiến hành: +/ Hút 300 µl dung dịch C cho vào ống mẫu; +/ Thêm 30 μl mẫu tách protein, lắc đều, để trong 10 phút; +/ Thêm 15 µl thuốc thử Folin, lắc đều, để trong 30 phút, thêm 1655 μl nước cất; +/ Đem so màu ở vùng ánh sáng đỏ (620 – 720 nm); +/ Ghi giá trị OD và so sánh với bảng chuẩn. - Xây dựng đường chuẩn: Tiến hành với 9 nồng độ protein chuẩn (albumin) từ 5–100 µg, blank là mẫu 0 µg và kết quả đo được với protein chuẩn ở các nồng độ khác nhau. Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và thống kê ANOVA một thành phần. PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu sự thay đổi hình thái TB, hàm lượng sắc tố và protein nội bào trong vòng đời của Haematococcus pluvialis nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới về vòng đời của vi tảo H. pluvialis đã chỉ ra rằng sinh trưởng của loài tảo này trải qua 4 giai đoạn với hình thái, kích thước, hàm lượng sắc tố và protein ở phần nội bào khác nhau. Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng đã quan sát được 4 giai đoạn sinh trưởng cơ bản của tảo nói trên: giai đoạn I: giai đoạn TB sinh trưởng sinh dưỡng (vegetative cell growth); giai đoạn II: giai đoạn tạo bào nang (encyst); giai đoạn III: giai đoạn tế bào nang hoàn chỉnh (maturation); giai đoạn IV: giai đoạn TB nảy mầm (germination). Hình thái TB và các giai đoạn đặc trưng trong vòng đời tự nhiên của H. Pluvialis nuôi ở bình tam giác 250ml trên môi trường RM và C được trình bày ở hình 4: - Từ 0-10 ngày: Tế bào ở dạng sinh dưỡng có 2 roi, chuyển động. - Kích thước tế bào: 13 x 16 ÷ 19 x 25 ± 0,5µm. - Từ 20-30 ngày: Tế bào chuyển sang dạng cyst. Kích thước tế: 18 ÷ 35 ± 0,5 µm. - Sau 50 ngày tế bào chuyển dạng đỏ hoàn toàn. Kích thước: 40 ± 1 µm. - Sau 48h cho nảy mầm lại: Tế bào chuyển về trạng thái có 2 roi, chuyển động. - Từ sau khi cho nảy mầm trở lại, sau 15 ngày tế bào trở lại trạng thái sinh dưỡng màu xanh với 2 roi, chuyển động. Giai đoạn I: Tế bào sinh dưỡng Giai đoạn II: Tế bào nang (encyst) Giai đoạn III: Tế bào chín (cyst) Giai đoạn IV: Tế bào nảy mầm Hình 4: Sự thay đổi hình thái và kích thước TB trong vòng đời của vi tảo H. pluvialis được quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần Như vậy, có 4 dạng hình thái TB của vi tảo H. pluvialis đã quan sát được trong vòng đời của chúng. Các TB sinh dưỡng hình elíp màu xanh, chuyển động được nhờ 2 roi. Dạng TB này chiếm tới 90% so với tổng số TB trong 10 ngày nuôi trồng đầu tiên. Kích thước TB dao động trong khoảng 13 x 16 ÷ 19 x 25 µm. Từ 10 đến 20 ngày nuôi trồng tiếp theo, số lượng TB sinh dưỡng giảm dần, số lượng TB dạng nang non tăng lên – đây là dạng TB hình khối cầu, màu xanh, mất roi, không có khả năng chuyển động. Sau 20 ngày nuôi trồng, các TB chuyển hoàn toàn sang dạng encyst và kích thước TB tăng rõ rệt (đạt khoảng 40 µm), nội chất trong TB dần có màu nâu do bắt đầu tích lũy astaxanthin. Sau 50 ngày nuôi, các tế bào này hoàn toàn chuyển sang dạng cyst (nang bào tử hoàn chỉnh) có màu đỏ đậm rất đặc trưng. Thành TB dày, sắc tố chủ yếu là astaxanthin. Giai đoạn nảy mầm được tính từ khi toàn bộ TB ở trạng thái chín được ly tâm loại bỏ môi trường cũ và chuyển sang môi trường mới (sau 50 ngày nuôi cấy). Giai đoạn nảy mầm có thể kéo dài từ 2 ngày và hoàn thiện trong vòng 15 ngày. Trong 24 giờ đầu tiên TB có những biến đổi hết sức rõ nét, màu sắc bên trong nội chất biến đổi từ đỏ đậm sang nâu đỏ và đồng thời xuất hiện màu xanh. Trong giai đoạn này xảy ra 2 quá trình ngược nhau đó là quá trình tổng hợp chlorophyll và quá trình phân giải astaxanthin, đồng thời protein cũng được tổng hợp khá mạnh. 24 giờ tiếp theo là giai đoạn nảy mầm thực sự. Có hai cách thức nảy mầm ở vi tảo H. pluvialis đã quan sát được: dạng thứ nhất là nảy mầm trực tiếp từ một nang bào tử hình cầu, không di động thành một TB sinh dưỡng hình elíp, có hai roi; và dạng thứ hai là nảy mầm gián tiếp thông qua pamella (cụm TB được bao bọc bằng một lớp màng). Khi đó, màng bao bọc pamella bị vỡ ra, từ một TB nang tạo ra tám TB sinh dưỡng. Tuy nhiên, khi đó các TB sinh dưỡng này vẫn chỉ chứa sắc tố màu đỏ trong phần nội chất. Chỉ sau 15 ngày nuôi cấy trong môi trường mới, các TB mới có màu xanh hoàn toàn. 3.2. Nghiên cứu vòng đời của H. pluvialis trong bình tam giác 250 ml: Nghiên cứu vòng đời của H. pluvialis là một trong những nghiên cứu hết sức quan trọng, quyết định thành công trong công nghệ nuôi trồng loài vi tảo này trên quy mô lớn. Khi chúng ta đã nắm rõ được các giai đoạn, những thay đổi quan trọng trong thành phần của loài vi tảo này thì có thể chủ động trong việc nuôi cấy có định hướng và tác động kịp thời để tạo được các sản phẩm mong muốn. Nhiều tài liệu trên thế giới đã mô tả thành công việc nuôi cấy loài vi tảo này ở nhiều cấp độ thể tích khác nhau, đặc biệt là trong các hệ thống ống dẫn kín [42] có chiếu sáng nhân tạo hoặc sử dụng ánh sáng mặt trời đến các bể nuôi hở ngoài trời [43]. Tuy nhiên ở Việt Nam chưa có một cơ sở hay một công trình công bố nào nuôi trồng thành công loài vi tảo này, vì vậy chúng tôi đã thực hiện những bước đi đầu tiên trong công nghệ nuôi trồng H. pluvialis nhằm thu được những lợi ích mà nó mang lại. 3.2.1. Nghiên cứu vòng đời của Haematococcus pluvialis trong bình tam giác 250 ml trên môi trường RM: Kết quả nghiên cứu vòng đời tự nhiên của H. pluvialis trong bình tam giác 250 ml trên môi trường RM được trình bày ở hình 5, hình 6 và bảng 2, bảng 3. Hình 5: Mật độ tế bào của H. pluvialis nuôi ở bình tam giác 250ml trong môi trường RMBảng 2: Mật độ tế bào trung bình trong môi trường RM (104 TB/ml) Ngày MĐTB Ngày MĐTB Ngày MĐTB 0 6,12 16 33,85 32 50 2 6,75 18 35,52 34 47,28 4 12,11 20 36,61 36 40,16 6 21,48 22 39,13 38 33,72 8 26,66 24 43,2 40 30,19 10 27,02 26 43,78 42 27,754 12 30,25 28 47,3 46 22,84 14 32,5 30 49,18 50 21,09 MĐTB – mật độ trung bình Hình 6: Sự thay đổi của hàm lượng sắc tố (chlorophyll a, astaxanthin) và protein của H. pluvialis nuôi ở bình tam giác 250ml trong môi trường RM Bảng 3: Hàm lượng các chất trong TB H. pluvialis trong môi trường RM Ngày Chlo a (µg/l) Astaxanthin (µg/l) Protein (pg/TB) Ngày Chlo a (µg/l ) Astaxanthin (µg/l ) Protein (pg/TB) 0 148,91 52,99 241,67 26 614,77 396,08 79,23 2 193,4 51,37 212,5 28 643,21 390,11 77,65 4 205,84 62,38 198,73 30 656,11 388,71 70,06 6 212,82 60,21 177,09 32 723,99 423,63 68,97 8 220,15 111,48 153,81 34 754,2 502,89 67,29 10 224,48 153,66 141,67 36 785,33 600,06 65,88 12 287,27 207,14 125,31 38 794,7 693,62 63,37 14 326,5 241,7 142,2 40 816,79 812,25 59,96 16 371,44 283,5 106,27 42 790,22 839,76 57,12 18 419,97 298,67 98,22 44 761,39 870,1 53,5 20 482,23 323,01 96,06 46 674,7 942,23 51,19 22 508,24 358,45 92,27 48 635,93 932,19 49,75 24 563,42 387,3 86,36 50 600,08 935,24 45,34 Kết quả theo dõi được đã cho thấy: Ở cấp độ bình tam giác 250ml, trong môi trường RM, vi tảo H. pluvialis sinh trưởng và đạt mật độ TB cao nhất là 50,00x104 TB/ml sau 32 ngày nuôi cấy (bảng 2 và hình 5). Khi thời gian nuôi tảo đạt từ 0 – 36 ngày, hàm lượng protein nội bào và hàm lượng sắc tố (chlorophyll a và astaxanthin) có sự thay đổi rõ nét và theo hướng ngược chiều nhau. Trong suốt quá trình nuôi, hàm lượng protein nội bào có xu hướng giảm dần. Khi TB tảo có màu đỏ đậm, tức là hoàn toàn chuyển sang giai đoạn bào nang hoàn chỉnh thì hàm lượng protein nội bào của TB H. pluvialis có giá trị nhỏ hơn 100 pg/TB (bảng 3 và hình 6). Hàm lượng chlorophyll a trong TB tăng dần theo thời gian nuôi tảo và đạt giá trị cực đại là 816,79 µg/lit ở thời điểm 40 ngày (bảng 3 và hình 6). Sau đó hàm lượng này giảm dần ở những ngày nuôi tiếp theo. Kết quả thí nghiệm chúng tôi thu được phù hợp với công bố của Sperry (1970) đã phát hiện thấy hàm lượng chlorophyll có xu hướng giảm dần trong quá trình tích lũy astaxanthin [34]. Tuy nhiên, điều này lại trái ngược với công trình của Zlotnik và cs., (1993) đã công bố: Hàm lượng chlorophyll không thay đổi trong suốt quá trình tích lũy astaxanthin [38]. Ở 40 ngày đầu nuôi cấy, hàm lượng astaxanthin bắt đầu được tích luỹ và tăng chậm khi TB tảo chuyển từ dạng sinh dưỡng sang dạng tạo bào nang. Hàm lượng sắc tố này tăng đột ngột khi thời gian nuôi khoảng từ 40 đến 50 ngày. Đây là lúc môi trường trở nên thiếu dinh dưỡng. Hàm lượng astaxanthin tích lũy cao nhất là 942,23 µg/l ở 46 ngày nuôi (bảng 3 và hình 6). Ngoài ra, kích thước tế bào ở giai đoạn này tăng mạnh và đạt cực đại vào khoảng 40 µm. 3.2.2. Nghiên cứu vòng đời của Haematococcus pluvialis trong bình tam giác 250 ml trên môi trường C: Kết quả nghiên cứu vòng đời tự nhiên của vi tảo lục H. pluvialis nuôi trong bình tam giác 250ml trên môi trường C được thể hiện ở hình 7, hình 8 và bảng 4, bảng 5. Hình 7: Mật độ tế bào của H. pluvialis nuôi ở bình tam giác 250ml trong môi trường C Bảng 4: Mật độ tế bào trung bình trong môi trường C (104 TB/ml) Ngày MĐTB Ngày MĐTB Ngày MĐTB 0 6,24 16 24,87 32 37,54 2 7,03 18 27,17 34 38,56 4 9,1 20 29,96 36 36,3 6 11,05 22 31,75 38 34,88 8 13,52 24 34,16 40 29,77 10 15,27 26 35,77 42 24,99 12 19,18 28 36,21 46 21,57 14 22,91 30 36,28 50 20,05 MĐTB – mật độ trung bình Hình 8: Sự thay đổi của hàm lượng sắc tố (chlorophyll a, astaxanthin) và protein của H. pluvialis nuôi ở bình tam giác 250ml trong môi trường C. Bảng 5: Hàm lượng các chất trong TB H. pluvialis trong môi trường C Ngày Chlo a (µg/l ) Astaxanthin (µg/l ) Protein (pg/TB) Ngày Chlo a (µg/l ) Astaxanthin (µg/l ) Protein (pg/TB) 0 151,82 53,12 237,5 26 593,21 264,54 74,14 2 200,2 53,28 206,25 28 611,9 270,39 71,77 4 249,89 60,29 187,72 30 638,27 282,55 68,64 6 313,21 100 172,33 32 681,07 298,59 64,43 8 385,66 113,82 156,11 34 693,53 334,14 57,88 10 421,17 154,3 143,75 36 721,4 395,42 58,65 12 463,5 175,82 130,2 38 789,01 447,88 54,29 14 477,01 176,05 120,85 40 811,45 526,66 51,3 16 509,4 182,12 115,73 42 808,36 550,01 50,02 18 514,02 191,16 104,7 44 786,52 644,11 48,98 20 528,81 203,55 100,11 46 700,39 705,15 47,22 22 540,03 238,94 90,8 48 653,8 817,68 46,18 24 559,31 250,17 78,29 50 607,44 912,56 44 Vòng đời của TB tảo H. pluvialis trong môi trường C cũng xảy ra tương tự như trong môi trường RM. Tuy nhiên có một số điểm khác biệt như sau: vi tảo H. pluvialis sinh trưởng trong môi trường C đạt mật độ TB cao nhất là 38,56x104 TB/ml sau 32 ngày nuôi cấy (hình 7 và bảng 4), thấp hơn so với so với mật độ đạt được khi nuôi tảo trong môi trường RM ở cùng thời điểm khảo sát. Không chỉ vậy, TB tảo trong môi trường C có hàm lượng protein nội bào, hàm lượng sắc tố đều chỉ đạt giá trị thấp hơn so với khi nuôi trong môi trường RM. Hàm lượng protein nội bào giảm dần đến giá trị 44 pg/TB sau 50 ngày nuôi cấy. Cũng tại thời điểm này, hàm lượng astaxanthin đạt giá trị cao nhất là 912,56 µg/l. Hàm lượng chlorophyll a cao nhất đạt 811,45 µg/l ở 40 ngày nuôi (hình 8 và bảng 5). Cùng với việc đánh giá về hàm lượng các thành phần nội bào để đánh giá cũng như xác định các giai đoạn sinh trưởng của TB, chúng tôi còn đánh giá thông qua tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a. Theo công trình công bố của Kobayashi và cs. 1992 [24] về vòng đời của tảo H. pluvialis, tỷ lệ hàm lượng astaxanthin/ chlorophyll a là một thông số tốt nhất để xác định pha sinh trưởng của TB. Nếu tỷ lệ astaxathin/ chlorophyll a ≤ 0,5 thì TB được xem chủ yếu đang ở giai đoạn sinh dưỡng. Khi tỷ lệ astaxathin/ chlorophyll a dao động từ 0,5 - 1, TB chủ yếu được xem đang ở giai đoạn encyst. Trong khi đó, nếu tỷ lệ này trong khoảng 2 – 7 thì TB chủ yếu ở giai đoạn cyst [25]. Kết quả thu được của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với những kết quả công bố ở trên, được trình bày chi tiết ở bảng 6. Kết quả thí nghiệm chúng tôi thu được hoàn toàn phù hợp với những kết quả theo công trình đã công bố của Kobayashi và cs. (1997) [25] về vòng đời của vi tảo H. pluvialis. Thông số tốt nhất để xác định được các pha sinh trưởng của TB chính là tỷ lệ giữa hàm lượng astaxanthin và hàm lượng chlorophyll a (astaxanthin/chlorophyll a). Nếu: - Tỷ lệ astaxathin/chlorophyll a dưới 0,5 thì TB được xem chủ yếu đang ở giai đoạn sinh dưỡng. - Tỷ lệ astaxathin/chlorophyll a dao động từ 0,5 - 1, TB chủ yếu được xem đang ở giai đoạn tạo bào nang non (encyst). - Tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a trong khoảng 2 – 7 thì TB chủ yếu ở giai đoạn bào nang hoàn chỉnh (cyst). Bảng 6: Tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a của vi tảo H. pluvialis ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau: Giai đoạn Sinh dưỡng Encyst Cyst Nảy mầm Trạng thái TB TB tảo hình elip, màu xanh, có hai roi. Kích thước TB: 13 x 16 ÷ 19 x 25 ± 0,50 µm TB tảo hình cầu, màu xanh, không có roi. Kích thước từ 14 ÷ 30 ± 0,50 µm TB tảo hình cầu, màu đỏ đậm, không có roi. Kích thước: 35 ÷ 40 ± 0,20 µm TB hình elip, có hai roi, màu nâu đỏ đến xanh. Kích thước: 8 x 11 ÷ 10 x 15 ± 0,30 µm Tỷ lệ astaxanthin/ chlorophyll a 0,30 ± 0,05 0,90 ± 0,20 2,40 ± 0,10 0,60 ± 0,20 Trong 10 ngày nuôi đầu, các TB H. pluvialis chủ yếu ở dạng sinh dưỡng, có thể chuyển động được. Màu đặc trưng của TB ở giai đoạn này là màu xanh do phần nội bào giàu chlorophyll, hàm lượng astaxanthin thấp. Tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a đạt 0,30 ± 0,05. Khi thời gian nuôi đạt tới 20 ngày, các TB tảo chuyển từ dạng sinh dưỡng sang dạng tạo bào nang (encyst). Mức độ sinh tổng hợp astaxanthin tăng lên trong khi hàm lượng chlorophyll a lại giảm dần. Lúc này, tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a trong TB đạt giá trị 0,90 ± 0,20. Kéo dài thời gian nuôi trồng lên đến 50 ngày, TB tảo bất động, chuyển dần từ dạng encyst sang giai đoạn bào nang hoàn chỉnh (cyst). Trong TB H. pluvialis xảy ra sự tích lũy astaxanthin. Do đó, phần nội chất của TB chuyển hoàn toàn sang màu đỏ đậm. Tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a đạt giá trị cao nhất 2,40 ± 0,10. Ở giai đoạn nảy mầm, hình dạng, cấu tạo TB tảo cũng xuất hiện sự thay đổi: từ hình cầu chuyển sang hình elip, từ không có roi chuyển thành có roi. Ngoài ra màu sắc của TB cũng biến đổi: từ màu đỏ đậm đặc trưng của giai đoạn cyst chuyển thành màu nâu đỏ do sự phân giải astaxanthin. Cùng với sự thay đổi hình thái là quá trình biến đổi hàm lượng các sắc tố bên trong nội bào, đặc trưng là tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a có xu hướng giảm và đạt giá trị 0,60 ± 0,20. Quá trình chuyển giai đoạn của TB vi tảo H. pluvialis từ dạng sinh dưỡng sang dạng bào nang tổng hợp - tích lũy astaxanthin cao có thể được thực hiện theo 2 con đường khác nhau: - Nuôi tảo trong môi trường cho đến khi dịch tảo tự chuyển sang màu đỏ do cạn kiệt nguồn dinh dưỡng. Tiến hành nuôi theo phương thức này thể hiện vòng đời tự nhiên của TB tảo H. pluvialis với thời gian chuyển giai đoạn tương đối dài (trên 50 ngày) và hàm lượng astaxanthin được tổng hợp là không cao. - Điều khiển quá trình chuyển giai đoạn trong vòng đời của H. pluvialis bằng nuôi cấy 2 pha. Trong đó, pha đầu sẽ nuôi cấy tảo ở điều kiện tối ưu để tảo đạt mật độ TB cực đại. Tiếp theo tiến hành chuyển sinh khối tảo vào pha thứ hai có môi trường nuôi cấy bất lợi về cường độ ánh sáng, nhiệt độ cao, thiếu nitơ, shock về muối... để kích thích TB nhanh chóng chuyển sang dạng nang bào tử có tích lũy astaxanthin cao. Một số hình ảnh minh họa hình thái và kích thước TB thay đổi ở các giai đoạn trong vòng đời của H. pluvialis nuôi ở bình tam giác 250 ml được chỉ ra trên hình 9. Hình ảnh TB chụp trên kính hiển vi quang học cho thấy được rõ các các dạng TB khác nhau trong từng giai đoạn của chúng. TB ở dạng màu xanh với 2 roi trong khoảng 10 ngày nuôi cấy và bắt đầu hình thành nang bào từ 15 đến 20 ngày. Sau 20 ngày nuôi cấy, trong nội chất TB bắt đầu hình thành astaxanthin, TB có mầu nâu đỏ, giai đoạn này kéo dài đến 60 ngày, lúc này trong nội chất TB chủ yếu là astaxanthin và TB có màu đỏ rực. Giai đoạn nảy mầm từ TB chín màu đỏ rực sang TB sinh dưỡng có 2 roi mất khoảng 15 ngày Hình 9. Một số hình ảnh minh họa hình thái và kích thước TB thay đổi ở các giai đoạn trong vòng đời của H. pluvialis nuôi ở bình tam giác 250 ml: Ngày 0 10 16 22 32 50 60 KT: 13,34 x 22,72 µm KT: 15,54 x 24,31 µm KT: 24,95 μm KT: 23,87 µm KT: 36,89 μm KT: 39,07 µm KT: 36,37 μm Ngày 0 2 7 9 15 Giai đoạn nảy mầm KT: 37,02 μm KT: 24,46 μm KT: 21,79 μm KT: 11,14 x 15,54 µm KT: 12,84 x 17,56 µm PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua các kết quả nghiên cứu đã được trình bày ở trên, chúng tôi xin rút ra một số kết luận như sau: 1. Vòng đời tự nhiên của vi tảo H. pluvialis trong môi trường C và RM đều trải qua 4 giai đoạn tương ứng với 4 dạng hình thái TB có các đặc điểm khác nhau: +/ Giai đoạn sinh dưỡng: TB sinh dưỡng có hình elip, màu xanh, có hai roi chuyển động, kích thước TB dao động từ 10 – 20 µm. Giai đoạn này kéo dài khoảng 10 ngày nuôi cấy. +/ Giai đoạn tạo bào nang non (encyst): Kéo dài từ 10 đến 20 ngày nuôi cấy. Các TB có dạng hình cầu, mất roi, không có khả năng chuyển động. Kích thước TB tăng lên đáng kể, khoảng 40 µm. Ở giai đoạn này, trong nội chất có sự biến đổi màu sắc từ xanh sang nâu đậm. +/ Giai đoạn tạo bào nang hoàn chỉnh (cyst): Sau 50 ngày nuôi cấy, các TB nang non chuyển thành nang hoàn chỉnh, có màu đỏ đậm. Đây là giai đoạn tích lũy astaxanthin cao nhất. +/ Giai đoạn nảy mầm: Kéo dài trong vòng 2 ngày. Có 2 cách nảy mầm: thứ nhất là từ một TB nang hoàn chỉnh nảy mầm trực tiếp thành TB sinh dưỡng và thứ hai là nảy mầm gián tiếp thông qua dạng pamella. 2. Đồng thời với sự thay đổi hình thái, kích thước TB, có sự thay đổi về hàm lượng sắc tố và protein trong nội bào. Hàm lượng sắc tố chlorophyll a và astaxanthin có xu hướng tăng chậm ở 20 ngày đầu tiên khi tảo được nuôi trong cả 2 môi trường C và RM ở cả bình tam giác 250ml. Tuy nhiên, sau 40 ngày nuôi cấy, hàm lượng astaxanthin tăng đột ngột, trong khi hàm lượng chlorophyll a lại bị giảm dần. Hàm lượng các sắc tố (chlorophyll a và astaxanthin) trong môi trường RM cao hơn trong môi trường C khi tảo được nuôi ở bình tam giác 250 ml. Hàm lượng astaxanthin đạt giá trị cực đại trong môi trường RM và C thứ tự là 942,23 và 912,65 µg/l. Trong cả 2 môi trường nuôi, hàm lượng protein giảm dần khi tăng thời gian nuôi cấy. Sau 50 ngày nuôi, hàm lượng protein nội bào nhỏ hơn 100 pg/TB, giảm từ 20 - 40 lần so với khi TB ở giai đoạn sinh dưỡng. 3. Tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a là thông số rất tốt giúp xác định pha sinh trưởng của vi tảo H. pluvialis. Ở các giai đoạn sinh dưỡng, encyst, cyst và nẩy mầm, tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a đạt giá trị 0,30 ± 0,05; 0,90± 0,20; 2,4 ± 0,10 và 0,60 ± 0,20, tương ứng. 4.2. Đề nghị: Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu vòng đời của vi tảo lục Haematococcus pluvialis trong điều kiện phòng thí nghiệm” bước đầu chúng tôi đã thu được một số kết quả rất khả quan. Tuy nhiên, để có thể nuôi loài vi tảo Haematococcus pluvialis này đạt mật độ 4 - 6 triệu TB/ml, sinh khối tảo giàu astaxanthin chiếm 4 - 6 % TLK trong điều kiện thí nghiệm của Việt Nam còn rất nhiều vấn đề cần đặt ra để nghiên cứu như sau: 1. Cần tiến hành nghiên cứu quy trình bảo quản Haematococcus pluvialis để thuận tiện cho việc lưu giữ loài vi tảo lục này vừa kinh tế, vừa được lâu dài nhưng vẫn giữ được tốt các đặc điểm sinh học của nó. 2. Cần nghiên cứu hoàn thiện các môi trường nuôi cấy tối ưu nhưng lại đơn giản, rẻ tiền và tiện lợi để có thể dễ dàng nuôi vi tảo lục Haematococcus pluvialis trên qui mô lớn. 3. Nghiên cứu độc tính của sinh khối tảo H. pluvialis và astaxanthin trên động vật thực nghiệm. 4. Nghiên cứu công nghệ bảo quản astaxanthin sau khi tách chiết từ H. pluvialis được sử dụng để bổ sung vào thành phần thức ăn cho một số đối tượng nuôi trong nuôi trồng thủy sản. TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt: 1. Dương Đức Tiến, Võ Văn Chi (1978) Phân loại học thực vật - thực vật bậc thấp, NXB ĐH và THCN, Hà Nội 2. Đặng Diễm Hồng, Hoàng Minh Hiền, Phạm Hồng Sơn (2006) Sử dụng rong biển Việt Nam như là nguồn thực phẩm chức năng, thuốc và phân bón. Kỷ yếu 2006-Viện Công nghệ Sinh học-Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam. NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ. Trang : 241-243 3. Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền (1999) Công nghệ sinh học vi tảo, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 4. Đặng Thị Sy (2005) Tảo học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 5. Ngô Kế Sương, Nguyễn Thị Quý, Nguyễn Văn Hòa (1994) Kết quả bước đầu nghiên cứu tảo lam cố định nitơ. Tạp chí sinh học 16(3): tr 50 – 54 6. Tống Kim Thuần và cs., 2006, Nghiên cứu sinh trưởng và tổng hợp astaxanthin từ nấm men Phaffia rhodozyma NT5 làm thức ăn bổ sung cho nuôi trồng thủy sản. Hội nghị khoa học lần thứ IV, Trường Đại học KHTN, 10/11/2006. Tiểu ban liên ngành CNMT&PTBV: 255 – 265 * Tài liệu tiếng Anh: 7. Algo Rythme (2000) The information bulletin on algae “The biomedical potential of microalgae” No 49 1st Quarter 8. Becker W (2004) Microalgae for aquaculture. The nutritional value of microalgaefor aquaculture, p. 380 – 391. In Richmond, A. (ed.), Handbook of microalgal culture. Blackwell, Oxford 9. Bourrelly P (1970) Les Algues d’eau douce. Initiation à la Systèmatique. Eugleniens, Peridi-nies, Algues rouges et Algues bleues. Editions N. Boubèe, Paris. 10. Boussiba S. and Vonshak A. 1991: Plant Cell Physiol., 32, 1077-1082 11. Bubrick P, 1991, Bioresource Technology, 38: 327-329 12. Cifuentes AS, et al., 2003, Biol Res, 36:343-357 13. Droop, M.R. 1994. Condition governing Haematococcus formation and loss of alga Haematococcus pluvialis Flotow. Arch Microbiol 20:391-397 14. Droop MR (1995) Carotenogenesis in Haematococcus pluvialis. Nature 175-42 15. Fan L, et al., 1994, Phycol, 30: 829 – 833 16. Garcia Malea MC, et al., 2006, Enzyme and Microbial Technology, 38: 981-989 17. Hagen C.et al., 1993: J. Photochem Photobiol Biol. 20: 153 – 160 18. Hagen C, et al., 2002, Eur J Phycol, 37: 217-226 19. Harker M, et al., 1996, Fermentation and Bioengineering, 82(2): 113-118 20. Hata N, et al., 2001, Appl Phycol, 13: 395-402 21. Jeffrey S.W., et al., 1997: Phytoplankton Pigments in Oceanography:Guidelines to Modern Methods. UNESCO, Paris: 37–84 22. Johnson EA, An GH (1991) Crit Rev Biotechnol 11: 297-326 23. Kang CD, et al., 2007, Appl Microbiol Biotechnol, 74: 987-994 24. Kobayashi M, et al., 1992, Fermentation and Bioengineering, 74: 61-63 25. Kobayashi M, et al., 1997, Journal of fermentation and Bioengineering, 84: 94-97 26. Lee YK, Soh CW (1991), Phycol, 27:575-577 27. Lorenz RT and Cysewski GR, 2000 Trends Biotechnol, 18:160–167 28. Lowry O.H.; Rosebrough N.J.; Farr A.L., Randall R.J., (1991). Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem 193: 265 – 275 29. Molina E., et al., (2001). Journal of Biotechnology 92: 113 – 131 30. Ördög V, Szigeti J, Pulz O (1996) Proceedings of the conference on progress in plant sciences from plant breeding to growth regulation. Pannon University, Mosonmagyarovar 31. Renstrom B, et al., 1981, Optical purity of (3S, 3¨S)-astaxanthin from Haematococcus pluvialis. Phytochemistry 20(11), 2561-2564 32. Riley LW, et al., Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype. N Engl J Med 1983; 308:681-5 33. Smith GM (1950) Freshwater algae. (n.p.) Mcgraw Hill Book, pp.109-111 34. Sperry 1970: Psychlogical Review, volume 77, Issue 6, November 1970: 585 – 590 35. Strickland J.D.H., et al., 1977: Fish Res. Bd. Can. Bull. No. 167. 311 p 36. Tjahjono AE, et al., 1994, Fermentation and Bioengineering, 77(4): 352-357 37. Vonshak (1990), Biotechnology Advences, 8: 709 – 727 38. Zlotnik IS, et al., 1993, J. Phycol. 29: 463-469 Trang web: 39. 40. 41. 42. 43. 44.