Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung người

o xoaén khoâng phuï thuoäc ATP vaø raát thieát yeáu cho söï sao cheùp cuûa papillomavirus. Noù cuõng coù töông taùc vôùi DNA polymerase (alpha) teá baøo. Beân caïnh L1, khung ñoïc môû cuûa E1 laø caáu truùc baûo toàn nhaát giöõa caùc type viruùt khaùc nhau. 1.7.5.2. Protein E2 Khung ñoïc môû cuûa E2 maõ hoùa töø 2-3 protein khaùc nhau, taát caû ñeàu laø nhaân toá phieân maõ. Chuùng coù nhöõng aûnh höôûng khaùc nhau ñeán söï bieåu hieän gen cuûa viruùt vaø thöïc hieän ñieàu hoaø trong boä gen baèng caùch taïo dimer ôû nhöõng vò trí gaén thích hôïp. Trong nhieàu tröôøng hôïp, protein E2 coù khaû naêng öùc cheá söï phieân maõ cuûa protein viruùt E6 vaø E7. Protein E2 cuûa HPV 16 vaø HPV 18 coù chöùc naêng cuûa moät yeáu toá hoaït hoùa phieân maõ ôû teá baøo söøng coå töû cung ngöôøi. ÑAÙP ÖÙNG MIEÃN DÒCH TEÁ BAØO AÙC TÍNH HPV SAÛN SINH SÖÏ NHIEÃM GAÉN p53 vaø pRb HPV E6 / E7 SÖÏ SAÙT NHAÄP HPV DNA Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 40 Söï maát gen E2 thöôøng thaáy trong sinh thieát ung thö coå töû cung vaø trong doøng teá baøo cuûa loaïi ung thö naøy, cho thaáy söï maát ñoaïn naøy taïo thuaän lôïi cho söï chuyeån sang traïng thaùi aùc tính. Khoâng chæ ñoät bieán trong khung ñoïc môû cuûa E2 maø caû nhöõng ñoät bieán trong vuøng DNA gaén E2 trong LCR cuõng daãn ñeán taêng cöôøng hoaït ñoäng gaây ung thö cuûa HPV 16. Trong quaù trình phaùt trieån ung thö, söï ñöùt gaõy E2 laø moät hieän töôïng xaûy ra muoän vì trong nhöõng toån thöông tieàn aùc tính khoâng coù hieän töôïng naøy. Ngoaøi chöùc naêng hoaït hoùa phieân maõ, E2 coøn töông taùc vôùi E1 deã daøng gaén vôùi ñieåm khôûi ñaàu sao cheùp. 1.7.5.3. Protein E4 Saûn phaåm cuûa gen E4, protein E4, ñoùng vai troø trong söï tröôûng thaønh vaø phoùng thích HPV. Quaù trình naøy khoâng laøm tan teá baøo. 1.7.5.4. Protein E5 Protein E5 quan troïng trong giai ñoaïn ñaàu cuûa söï xaâm nhieãm. Noù hoaït hoùa söï phaùt trieån cuûa teá baøo baèng caùch taïo ra caùc phöùc hôïp vôùi receptor cuûa caùc nhaân toá taêng tröôûng vaø bieät hoùa. Ngoaøi ra, protein naøy coøn coù vai troø trong vieäc ngaên chaän söï cheát theo chöông trình cuûa caùc teá baøo coù DNA hö hoûng. 1.7.5.5. Protein E6 Protein E6 cuûa HPV16 chöùa 151 amino acid vaø chöùa 4 caáu truùc gaén keõm ñieàu hoaø Cys-X-X-Cys coù theå taïo thaønh hai caáu truùc ngoùn tay keõm. Protein E6 cuûa HPV nguy cô cao coù moät soá tính chaát sinh hoïc ñaùng chuù yù nhö lieân keát vôùi protein E7 trong vieäc baát töû hoaù teá baøo ngöôøi, thaäm chí protein naøy coù theå baát töû hoùa moät soá loaïi teá baøo ñoäng vaät höõu nhuõ ngay caû khi khoâng coù söï hieän dieän cuûa protein E7. Protein E6 cuûa nhöõng viruùt naøy lieân keát vôùi gen ras trong quaù trình baát töû hoaù teá baøo cô baûn cuûa chuoät vaø kích thích söï phaùt trieån cuûa teá baøo Tính chaát quan troïng nhaát cuûa protein E6 laø noù coù khaû naêng gaén vaøo protein p53 cuûa teá baøo. Söï gaén keát naøy laøm taêng söï phaân giaûi cuûa p53 bôûi heä thoáng phaân giaûi Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 41 protein ubiquitin cuûa teá baøo. Söï töông taùc cuûa E6 ñoái vôùi p53 ñöôïc xem laø nguyeân nhaân chính cuûa baát oån nhieãm saéc theå trong teá baøo xaâm nhieãm bôûi HPV gaây ung thö. 1.7.5.6. Protein E7 Protein E7 goàm 98 amino acid laø moät phosphoprotein lieân keát keõm coù hai vuøng cys-X-X-Cys. Caáu truùc naøy cho thaáy söï töông ñoàng vôùi protein E6, chöùng toû chuùng coù lieân heä veà maët tieán hoùa. Phaàn ñaàu N cuûa protein E7 chöùa hai vuøng töông öùng moät phaàn vôùi vuøng baûo toàn 1 (CR-1) vaø hoaøn toaøn töông öùng vôùi vuøng baûo toàn 2 (CR-2) cuûa protein adenovirus E1A vaø vôùi moät vuøng töông töï treân khaùng nguyeân T lôùn cuûa SV40. Caû hai vuøng töông öùng treân protein E7 (cd1 vaø cd 2) goùp phaàn taïo neân tieàm naêng gaây ung thö cuûa noù. Töông töï vôùi E1A vaø khaùng theå T cuûa SV40, protein E7 cuûa HPV taïo phöùc hôïp vôùi protein retinoblastoma (pRB). ÔÛ caùc type HPV coù khaû naêng gaây ung thö (nguy cô cao) aùi löïc lieân keát cuûa E7 vôùi pRB lôùn hôn khoaûng 10 laàn so vôùi caùc type HPV thoâng thöôøng (nguy cô thaáp) do khaùc nhau moät amino acid ôû vò trí thöù 21. AÙi löïc cuûa E7 vôùi pRB coù aûnh höôûng lôùn ñeán hieäu quaû chuyeån hoaù teá baøo cuûa viruùt. Ngoaøi ra, söï lieân keát E7 vôùi pRB coøn laøm giaûi phoùng moät soá nhaân toá teá baøo nhö nhaân toá phieân maõ E2F. Söï taêng noàng ñoä E2F töï do trong teá baøo coù theå daãn ñeán söï keùo daøi tuoåi thoï teá baøo. 1.7.5.7. Protein p53 Protein p53 laø moät protein ñieàu hoøa phieân maõ, coù khaû naêng gaén vôùi moät soá trình töï DNA baèng ñaàu N, vaø taïo dimer hoaëc tetramer baèng ñaàu C. Chöùc naêng cuûa p53 trong chu trình teá baøo laø hoaït ñoäng ôû ñieåm kieåm soaùt R ñeå chi phoái söï tieáp dieãn cuûa chu trình phaân baøo. Ngoaøi ra p53 coøn taêng cöôøng kieåm soaùt ñeå ñöa teá baøo vaøo söï cheát theo chöông trình (apoptosis) khi coù sai hoûng. Protein E6 cuûa caùc type HPV gaây ung thö coù theå taïo thaønh phöùc hôïp vôùi p53, qua trung gian cuûa protein keát hôïp E6 (E6AP). Phöùc hôïp E6/p53 gaây ra söï giaûm noàng ñoä p53 trong teá baøo do ñoù khieán cho teá baøo coù DNA sai hoûng coù theå toàn taïi qua quaù trình phaân baøo. Protein cuûa caùc type HPV nguy cô thaáp (low risk) khoâng coù khaû naêng gaén vôùi p53 vaø khoâng aûnh höôûng gì leân söï oån ñònh p53 trong thöïc nghieäm. Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 42 1.7.5.8. Retinoblastoma Protein (pRb) Ñaây laø moät phosphoprotein coù troïng löôïng phaân töû khoaûng 105kD, ñöôïc phosphoryl hoùa ôû giai ñoaïn G2 cuûa chu trình teá baøo. Khi khoâng ñöôïc phosphoryl hoùa pRb taïo phöùc vôùi protein E2F vaø öùc cheá phieân maõ baèng caùch gaén protein öùc cheá. Khi ñöôïc phosphoryl hoùa, pRb khoâng coøn taïo phöùc vôùi E2F ñöôïc nöõa, khi ñoù. E2F dimer hoùa vôùi protein DP vaø hoaït hoùa söï bieåu hieän cuûa moät soá gen ñieàu hoøa ñöa teá baøo vaøo giai ñoaïn S, nhö DNA polymerase α, thymidylate synthase, ribonucleotide redutase, cyclin E vaø dihydrofolate reductase. Söï taêng cöôøng E2F töï do daãn ñeán taêng cöôøng chu trình teá baøo. Nhö ñaõ ñeà caäp ôû treân, protein E7 cuûa HPV nguy cô cao coù khaû naêng taïo phöùc lieân keát vôùi pRB vaø coù aùi löïc vôùi pRB cao hôn protein E7 ôû nguy cô gaây lieàu thaáp nhieàu laàn. Khi protein E7 taïo phöùc vôùi pRB, pRB khoâng theå taïo phöùc vôùi E2 vaø do ñoù E2F coù theå laøm chaát hoaït hoùa phieân maõ daãn ñeán söï taêng sinh teá baøo taïo ra khoái u. 1.7.5.9. Protein p27kip I Thuoäc hoï Cip/Kip thuoäc nhoùm CKI, p27kip I laø moät phosphoprotein nhaân coù 198 amino acid, coù gaén CDK ôû ñaàu N ñeå gaén vaø öùc cheá cyclin kinase D, E, A, B. Ñaàu 3’C cuûa protein E7 cuûa HPV coù khaû naêng lieân keát vôùi p27kip I vaø laøm maát hoaït tính cuûa noù. Nhö ñaõ ñeà caäp, nhoùm CKI öùc cheá hoaït ñoäng xuùc tieán phaân baøo cuûa nhaân toá CDK, do ñoù khi E7 lieân keát vôùi p27kip I laøm cho maát hoïat tính öùc cheá, khieán cho quaù trình tieán ñeán phaân baøo xaûy ra deã daøng hôn. Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 43 Hình 6: Söï nhieãm HPV Hình 7: Tyû leä nhieãm caùc type HPV trong ung thö coå töû cung 1.7.6. Phaân loaïi HPV Taïi hoäi nghò thöôøng nieân veà Papillomavirus naêm 1995 (Quebec, Canada), ngöôøi ta thoáng nhaát phöông phaùp phaân loaïi caùc type HPV döïa treân söï so saùnh möùc ñoä khaùc nhau cuûa boä gen, cuï theå laø neáu coù söï khaùc bieät hôn 10% treân khung ñoïc môû cuûa L1 thì ñöôïc coi nhö thuoäc moät kieåu viruùt môùi. Öôùc tính hôn 77 type HPV ñaõ ñöôïc xaùc ñònh vaø giaûi trình töï hoaøn toaøn. Khoaûng hôn 39 kieåu khaùc ñang ñöôïc giaûi trình töï moät phaàn cho thaáy toång soá caùc type HPV leân ñeán hôn 100. Döïa treân caáu taïo cuûa nucleic acid, ngöôøi ta chia HPV ra thaønh nhieàu nhoùm nhoû. Moät trong nhöõng nhoùm nhoû ñöôïc bieát ñeán nhieàu nhaát laø nhoùm caùc HPV xaâm nhieãm chuû yeáu ôû beà maët nieâm maïc, thöôøng thaáy nhaát ôû ñöôøng sinh duïc. Hôn 40 type HPV ñöôïc xaùc ñònh thuoäc nhoùm naøy trong ñoù ñöôïc bieát nhaát laø HPV 16. Moät nhoùm nhoû Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 44 khaùc laø nhöõng viruùt ñaïi dieän bôûi caùc viruùt tìm thaáy trong caùc muïn coùc loaïn saûn daïng bieåu moâ (epidermodysplasia veruciformis lesions), thöôøng gaëp nhaát laø HPV 5. Nhöõng viruùt naøy cuõng ñöôïc tìm thaáy trong caùc veát lôû cuûa ngöôøi bò suy yeáu mieãn dòch. 1.7.7. Lòch söû nuoâi caáy teá baøo bieåu moâ coå töû cung Naêm 1975 Rheinwald vaø Green ñaõ thöû nghieäm nuoâi caáy haøng loaït lôùp teá baøo bao qui ñaàu söøng hoaù cuûa treû sô sinh nhöng khoâng thaønh coâng. Vaøo naêm 1976 Wilbank vaø Find laàn ñaàu tieân thöû nghieäm nuoâi caáy moät maãu teá baøo bieåu moâ coå töû cung thì thaáy teá baøo coù khaû naêng phaùt trieån in vitro. Nhöng tyû leä thaønh coâng trong caùc loaït thöû nghieäm nuoâi caáy naày raát haïn cheá. Thöôøng ôû laàn nuoâi caáy sô caáp tyû leä baùm ôû lôùp teá baøo söøng hoùa raát thaáp vaø nhanh choùng suy yeáu ôû laàn nuoâi caáy thöù caáp. ÔÛ nhöõng thöû nghieäm nuoâi caáy naøy nguyeân baøo sôïi thöôøng chieám öu theá. Thôøi gian sau ñoù caùc nhaø nghieân cöùu baét ñaàu chính thöùc tieán haønh nuoâi caáy teá baøo ung thö söøng hoùa töø caùc beänh nhaân bò toån thöông noäi bieåu moâ coå töû cung. Maëc duø doøng teá baøo ung thö coå töû cung ñuôïc Gay vaø coäng söï thieát laäp töø nhöõng naêm 1952 vaø ñöôïc söû duïng roäng raõi trong caùc nghieân cöùu sinh hoïc, nhöng chöa coù chöùng thöïc naøo xaùc nhaän doøng teá baøo Hela naøy coù nguoàn goác töø toån thöông noäi bieåu moâ. Maõi ñeán khi doøng teá baøo W12 (Sanley vaø coäng söï thieát laäp vaøo naêm 1989) vaø CIN 612 (Badell vaø coïâng söï thieát laäp vaøo naêm 1991) caû hai ñeàu coù nguoàn goác töø toån thöông bieåu moâ töû cung ñoä thaáp. Nhöõng haïn cheá gaëp trong nuoâi caáy teá baøo bieåu moâ bình thöôøng cuõng xaõy ra ôû quaù trình nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung söøng hoùa, theâm vaøo ñoù laø söï phöùc taïp cuûa caùc maãu sinh thieát coù nguoàn goác khaùc nhau. Nhöõng thí nghieäm sau ñoù cuûa Stanley vaø Parkison cuõng chöùng minh raèng teá baøo coå töû cung söøng hoùa coù theå nuoâi caáy lieân tuïc. Ham vaø coäng söï thöû nghieäm caùc phöông phaùp nuoâi caáy ñeå xaùc ñònh moâi tröôøng dinh döôõng vaø phaùt trieån cuûa caùc teá baøo söøng hoùa. Keát quaû laø teá baøo coå töû cung söøng hoùa coù theå phaùt trieån ôû moâi tröôøng MCDB 153 (Boyce vaø Ham) vaø teá baøo söøng hoùa phaùt trieån thaønh lôùp ñôn maø khoâng traõi qua quaù trình bieät hoùa in vitro. Trôû ngaïi lôùn thöôøng gaëp trong nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung laø söï nhieãm khuaån, nhieãm mycoplasma vaø nhieãm nguyeân baøo sôïi. Vì vaäy moâi tröôøng phaùt trieån Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 45 teá baøo ung thö coå töû cung ngay töø ñaàu phaûi coù thuoác khaùng sinh. Ngoaøi ra ngöôøi ta coù theå kieåm tra moät caùch coù hieäu quaû söï laây nhieãm nguyeân baøo sôïi baèng caùch thöïc hieän caùc thao taùc thaønh thuïc ñeå loaïi boû caùc daïng teá baøo khaùc trong quaù trình nuoâi caáy. Noùi chung, tyû leä thaønh coâng khi nuoâi caáy doøng teá baøo ung thö coå töû cung thöôøng thaáp, tyû leä thaønh coâng laø 1/10 maãu sinh thieát. 1.7.8. Thò tröôøng doøng teá baøo ung thö coå töû cung Hieän nay phaàn lôùn doøng teá baøo ung thö coå töû cung ñöôïc cung caáp bôûi ATCC (American Tissue Culture Collection) vaø DSMZ (Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen). Moät soá doøng ñöôïc söû duïng phoå bieán ôû caùc phoøng thí nghieäm hieän nay nhö: C-33A, C-41, C41 II, Caski, Hela, Hs 588.T, Hs 636.T, HT-3, KB-3-1, ME 180, MS751, SiHa, SISO, SW756, Hela P3, Hela AG, Hela S3, SNG-N, SNG-P…Hela S3 (coù nguoàn goác töø teá baøo ung thö bieåu moâ coå töû cung ngöôøi) nuoâi caáy trong moâi tröôøng HAM’s F12 vaø 10% FBS vaø thích hôïp phaùt trieån doøng trong moâi tröôøng N16 HHF. Hela S3 do T.T vaø P.I.Drarcus thieát laäp töø naêm 1955. Doøng teá baøo Hela S3 cuõng ñöôïc söû duïng ñeå nghieân cöùu caùc khaùng nguyeân coù nguoàn goác töø caùc viruùt sinh u. Caùc nghieân cöùu cho thaáy raèng caùc khaùng nguyeân coù nguoàn goác töø caùc viruùt sinh u coù theå ñöôïc nhaän bieát bôûi caùc teá baøo T. Ví duï ñieån hình nhaát ôû ngöôøi laø caùc peptid coù nguoàn goác töø protein E7 cuûa HPV 16, virut naøy coù maët trong nhieàu ung thö bieåu moâ coå töû cung, caùc teá baøo T ñaàu ñoäc teá baøo coù theå taán coâng vaø gieát caùc teá baøo ung thö ngay khi chuùng xuaát hieän. Doøng teá baøo SNG-M vaø SNG-P laø khoái u di caên coù nguoàn goác töø ung thö coå töû cung ngöôøi ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng HAM’s F12 vôùi 20% FBS (Ishiwatari.Y vaø Nozawas). Ñaây laø doøng teá baøo phaùt trieån khaù toát nuoâi caáy hôn 13 thaùng vaø caáy chuyeàn hôn 65 laàn vaø vaãn tieáp tuïc phaùt trieån oån ñònh. SNG-M vaø SNG-P ñöôïc söû duïng treân cô sôû phaân tích chu trình teá baøo ñeå nghieân cöùu so saùnh giöõa moät teá baøo bình thöôøng vaø teá baøo ung thö coå töû cung ñang ñöôïc xaï trò ñeå xem xeùt vieäc xaï trò vaøo thôøi ñieåm naøo laø ñaït hieäu quaû nhaát. Trong moâi tröôøng nuoâi caáy ôû phoøng thí nghieäm, haàu heát caùc teá baøo bình thöôøng chæ phaân chia trong voøng 20 – 50 theá heä thì ngöøng laïi. Chuùng tieáp tuïc phaân chia cho ñeán khi chuùng chaïm phaûi nhau thì ngöøng laïi khoâng Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 46 phaân chia nöõa, hieän töôïng naøy ñöôïc goïi laø öùc cheá phuï thuoäc maät ñoä. Ngöôïc laïi caùc teá baøo ung thö khoâng phaûn öùng vôi cô cheá kieåm soaùt naøy. Baèng caùch nghieân cöùu caùc teá baøo ung thö trong moâi tröôøng nuoâi caáy caùc nhaø nghieân cöùu thaáy raèng teá baøo ung thö khoâng chòu aûnh höôûng gì hoaëc chòu aûnh höôûng caùc nhaân toá kieåm soaùt phaân baøo keùm hôn caùc teá baøo bình thöôøng. Caùc teá baøo ung thö coù theå phaân chia maõi khoâng bò giôùi haïn chöøng naøo chuùng coøn ñöôïc cung caáp chaát dinh döôõng. Neáu teá baøo ung thö ngöøng phaân chia chuùng seõ ngöøng taïi nhöõng thôøi ñieåm ngaãu nhieân hôn laø ngöøng ñuùng ôû thôøi ñieåm khuûng hoaûng. Vieäc xöû lyù ung thö baèng phöông phaùp xaï trò laø nhaèm ngaên chaën ñeå caùc teá baøo ung thö ngöøng phaân chia. Vì vaäy khi teá baøo bò huyû dieät trong gian kyø thì moïi hoaït ñoäng phaân baøo seõ ngöøng ngay. Hieän töôïng naøy coù theã thaáy khi chieáu xaï lieàu cao. Hela P3 (coù nguoàn goác töø teá baøo ung thö bieåu moâ coå töû cung ngöôøi) ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng DM210 khoâng huyeát thanh. Doøng SiHa vaø CaSki (cuõng coù nguoàn goác töø teá baøo ung thö bieåu moâ coå töû cung ngöôøi) ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng DMEM vôùi 10% fetal cafl serum – coù söû duïng theâm 0,25% trypsin khi taïo doøng. Doøng SiHa vaø CaSki coù khaû naêng kieåm soaùt HPV16 vaø Hela P3 coù theå khaùng laïi HPV18. Caùc nhaø nghieân cöùu ñaõ söû duïng nhieàu doøng teá baøo nuoâi caáy nhö Hela P3, CaSki, SiHa ñeå thöû nghieäm vieäc ñieàu trò ung thö coå töû cung baèng caùch döïa treân söï maát taùc duïng töông hoã giöõa protein vôùi protein, coù lieân quan ñeán protein gaây öùc cheá ung thö. Chaúng haïn nhö oncoprotein E7 vaø E6 lieân keát, taùc duïng töông hoã naøy vôùi protein viruùt nhö viruùt papilloma ôû ngöôøi coù theå giaûi phoùng ra nhöõng protein öùc cheá ung thö vaø ñieàu naøy coù theå coù ích trong ñieàu trò ung thö coå töû cung. Baèng caùc nghieân cöùu nuoâi caáy teá baøo caùc nhaø khoa hoïc coøn chöùng minh raèng söï thay ñoåi tieán trình cuûa nhieãm saéc theå vaø söï xaâm nhaäp cuûa HPV laøm phaùt trieån ung thö coå töû cung. Ngoaøi caùc HPV ñaùng chuù yù nhö HPV 16, HPV 18 coøn coù caùc HPV khaùc nhö HPV31, HPV33, HPV35, HPV45 ñöôïc tìm thaáy trong caùc khoái u coå töû cung. Caùc nhaø khoa hoïc cho raèng söï xuaát hieän cuûa caùc HPV naøy coù lieân quan ñeán vaán ñeà ñòa lyù (HPV 45 tìm thaáy phoå bieán ôû caùc beänh nhaân nöõ ôû Chaâu Phi vaø caùc nöôùc Nam Myõ). Trong nhieàu naêm qua baèng caùc thöû nghieäm nuoâi caáy töø doøng teá baøo Hela, CaSki caùc nhoùm nghieân cöùu ñaõ chæ ra ñöôïc nhieàu gen öùc cheá ung thö, trong ñoù coù gen BRCA 1 khu truù ôû 17q bieåu hieän beänh ung thö vuù vaø ung thö töû cung. Caùc nhaø khoa Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 47 hoïc cho raèng neáu söï ñieàu trò döïa treân gen öùc cheá ung thö ñöôïc phaùt trieån thì caùc nhaø ung thö hoïc coù khaû naêng xaây döïng nhöõng test chaån ñoaùn thích hôïp vaø beänh nhaân hoaøn toaøn ñöôïc lôïi töø bieän phaùp ñieàu trò nhö theá. Söï maát thöôøng xuyeân caùc gen öùc cheá ung thö ñaët ra cho caùc nhaø khoa hoïc moät caâu hoûi coù phaûi beänh naøy gioáng nhö beänh khieám khuyeát di truyeàn. Vaø caâu traû lôøi laø tìm bieän phaùp ñieàu trò baèng caùch thay theá gen chính laø muïc tieâu thích hôïp nhaát. Coâng trình nghieân cöùu nhieàu naêm qua ñaõ cho thaáy raèng gen p53 coù theå raát phuø hôïp ñeå duøng ngaên chaêän söï sinh saûn teá baøo ung thö hoaëc ñeå phaù huûy caùc teá baøo naøy. Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 48 1. VAÄT LIEÄU – HOAÙ CHAÁT 1.1. Ñoái töôïng nghieân cöùu Ñeå thöïc hieän ñöôïc nhöõng thí nghieäm nghieân cöùu veà ñeà taøi naøy, chuùng toâi ñöôïc söï giuùp ñôõ vaø hoã trôï veà nguoàn maãu vaø nhöõng thoâng tin caàn thieát cuûa nguoàn maãu töø Beänh vieän Ung Böôùu cung caáp. Sau khi tieán haønh khaùm laâm saøng vaø chaån ñoaùn giai ñoaïn beänh, caùc baùc só taïi phoøng khaùm seõ laáy sinh thieát nguoàn maãu töø choã suøi cuûa coå töû cung cuûa beänh nhaân. Tuøy theo töøng giai ñoaïn, choã suøi coù theå töø 2 – 5cm. Troïng löôïng maãu ñöôïc cung caáp thöôøng khoaûng 1,4 – 1,6g. Nguoàn maãu coù ñöôïc töø nhieàu beänh nhaân coù ñoä tuoåi khaùc nhau, giai ñoaïn beänh khaùc nhau, nôi sinh soáng khaùc nhau. Qui trình xöû lyù nguoàn maãu seõ ñöôïc tieán haønh taïi phoøng thí nghieäm Coâng ngheä Sinh Hoïc Phaân Töû – Lab C, tröôøng Ñaïi hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân. Hình 6: Maãu sinh thieát 1.2. Duïng cuï – Thieát bò – Hoùa chaát I.2.1. Duïng cuï - Ñóa petri (ñöôøng kính 10cm) - Erlen 50ml, 100ml, 250ml - Ñeøn coàn - Becher 50ml, 100ml, 250ml - Micropipette (10-100ml vaø 100-1000ml) - Keïp cong vaø thaúng - Keùo cong vaø thaúng - Ñaàu type 10-100ml vaø 100-1000ml - Buoàng ñeám NEUBAUER Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 49 - Lamelle - OÁng ly taâm - Bình roux - Eppendorf 1500µl - Bình xòt coàn 1.2.2. Thieát bò - Tuû caáy voâ truøng - Tuû aám CO2 daïng kho - Noài aùp suaát (autoclave) - Maùy khuaáy töø gia nhieät - Maùy ly taâm - Maùy aûnh kyõ thuaät soá - Tuû saáy - Tuû laïnh - Kính hieån vi ñieän töû - Kính hieån vi soi ngöôïc - Microfilter - Caân ñieän töû 1.2.3. Hoùa chaát Dung dòch PBSA g/l NaCl 8,00 KCl 0,20 Na2HPO4.7H2O 2,16 KH2PO4 0,20 H2O caát vöøa ñuû 1000ml pH 7,2 Boå sung 50µg/ml Gentamicin, 5µg/ml Ampotericin B sau khi PBS ñaõ ñöôïc haáp khöû truøng. - Trypsin 1% Trypsin 1g PBS voâ truøng (vt) 100ml Loïc voâ truøng baèng 0,45 – 0,22µm Microfilter Baûo quaûn laïnh ôû 4oC. - EDTA 1% EDTA 1g Nöôùc caát 100ml Haáp khöû truøng Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 50 - Trypsin – EDTA Trypsin 0,25% vt 25ml EDTA 1% vt 500µm PBS vt 24ml Baûo quaûn laïnh ôû 4oC. - Pen – Strep 200X Penicilin G 1.000.000 ñôn vò Streptomycin 1g sulfate Loïc voâ truøng baèng microfilter 0,45 – 0,22µm Baûo quaûn laïnh – 20oC - Gentamicin Gentamycin 80mg/2ml Loïc voâ truøng baèng microfilter 0,45 – 0,22µm Baûo quaûn laïnh – 20oC. - Ampotericin B Ampotericin B 50mg Nöôùc caát 10ml Loïc voâ truøng baèng microfilter 0,45 – 0,22µm Baûo quaûn laïnh ôû 4oC. - Moâi tröôøng DMEM (Dulbecco’s modification of Eagle’s medium) vôùi huyeát thanh 10%. L-Arginine HCl 84 mg/l L-cystine 48 L-glutamic acid 75 L-glutamine 584 Glycine 30 L-histidine.HCl.H2O 42 L-isoleucine 105 L-leucine 105 L-lysine.HCl 146 L-methionine 30 L-phenylalanine 66 L-serine 42 L-threonine 95 L-tryptophan 16 L-tyrosine 72 L-valine 94 CaCl2 200 Fe(NO3)3.9H2O 0,10 KCl 400 Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 51 MgSO4.7H2O 200 NaCl 6400 NaHCO3 3700 Na2HPO4.H2O 125 D-Ca pantothenate 4 Choline chloride 4 Folic acid 4 i-insitol 7,2 Nicotinamide 4 Pyridoxal HCl 4 Riboflavin 0,4 Thiamine HCl 4 D-Glucose 4500 Phenol red 15 Sodium pyruvate 110 Boå sung huyeát thanh FBS (Fetal Bovine Serum) 10% 2. PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU ÑEÅ TAÙCH TEÁ BAØO UNG THÖ 2.1. Caùc yeáu toá caàn ñöôïc khaûo saùt - Taùch teá baøo ung thö coå töû cung baèng phöông phaùp cô hoïc. - Taùch teá baøo ung thö coå töû cung baèng quy trình Trypsin aám. - Khaûo saùt thôøi gian khuaáy maûnh moâ. - Thöû nghieäm nuoâi caáy sô caáp teá baøo ung thö coå töû cung. 2.2. Trình töï thí nghieäm Böôùc 1: Thu nhaän maãu vaø ghi nhaän caùc thoâng tin lieân quan ñeán maãu vaät, bao goàm: - Teân tuoåi ngöôøi cho maãu - Chaån ñoaùn giai ñoaïn beänh - Thôøi gian laáy maãu (ngaøy, giôø) - Thôøi gian tieán haønh thao taùc taïi phoøng thí nghieäm Böôùc 2: Tieán haønh chieáu UV khöû truøng tuû caáy, maãu, duïng cuï vaø hoùa chaát (haáp khöû truøng neáu caàn) Böôùc 3: Tieán haønh taùch teá baøo töø maãu moâ baèng phöông phaùp cô hoïc hoaëc baèng quy trình Trypsin aám. Böôùc 4: Thöû laïi quy trình taùch teá baøo baèng caùch thay ñoåi noàng ñoä Trypsin ghi nhaän maät ñoä teá baøo theo thôøi gian. Böôùc 5: Thöû nghieäm nuoâi caáy sô caáp teá baøo. Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 52 2.3. Caùc quy trình chính söû duïng trong thöïc nghieäm. 2.3.1. Quy trình voâ truøng 2.3.1.1. Duïng cuï – Hoùa chaát a) Duïng cuï - Duïng cuï baèng thuûy tinh vaø kim loaïi ñöôïc voâ truøng baèng caùch haáp khöû truøng hôi nöôùc vôùi autoclave (121oC ôû 1 atm trong 30 phuùt). - Duïng cuï nhöïa: lau baèng coàn 70o, ñeå khoâ töï nhieân vaø chieáu UV 30 phuùt tröôùc khi söû duïng. b) Hoùa chaát - PBS, nöôùc caát: haáp khöû truøng hôi nöôùc - Moâi tröôøng DMEM, enzym Trypsin: loïc voâ truøng. c) Thao taùc loïc voâ truøng - Duøng moät oáng tieâm môùi (khoâng caàn kim tieâm) hoaëc oáng huùt laáy dung dòch caàn loïc. - Môû bao bì filter, tra ñaàu oáng tieâm vaøo ñaàu filter, nhaác filter ra khoûi bao bì. - EÙp Piston hoaëc bao cao su ñeå dòch loïc chaûy vaøo moät bình chöùa voâ truøng. - Ñaët mieáng loïc trôû laïi bao bì, ruùt oáng tieâm ra, tieáp tuïc huùt dung dòch ñeå loïc neáu caàn thieát. 2.3.2. Quy trình xöû lyù maãu moâ taïi phoøng khaùm beänh vieän Ung Böôùu. Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 53 Chuù yù: Nhöõng thao taùc treân ñöôïc tieán haønh trong ñieàu kieän khoâng voâ truøng, vì vaäy deã daøng xaûy ra söï nhieãm vi sinh vaät vaøo maãu vaät. Ñeå traùnh ñöôïc söï nhieãm thì caùc duïng cuï vaø dung dòch phaûi ñöôïc voâ truøng, thao taùc xöû lyù maãu phaûi nhanh vaø ñöôïc thöïc hieän gaàn ñeøn coàn. Vieäc söû duïng khaùng sinh trong dung dòch PBSA ñeå röûa maãu nhaèm muïc ñích coù theå loaïi boû hoaëc giaûm söï nhieãm vi sinh vaät vaøo maãu vaät. 2.3.2. Quy trình taùch teá baøo baèng quy trình trypsin aám. (a) Chuyeån maãu ñöôïc tröõ trong eppendorf coù chöùa moâi tröôøng DMEM 10% FBS vaøo ñóa petri (ñöôøng kính10cm). (b) Röûa maãu baèng PBSA coù khaùng sinh Gentamycin – Ampotericin B töø 2 – 3 laàn ñeå laøm saïch maãu. (c) Söû duïng keùo cong hoaëc thaúng caét maãu moâ ra thaønh töøng maõnh nhoû, tieáp tuïc caét nhuyeãn caùc maõnh moâ. Röûa maãu qua dung dòch PBSA coù khaùng sinh Penicillin – Streptomycin trong 10 phuùt Röûa maãu qua dung dòch PBSA coù khaùng sinh Gentamycin – Ampotericin B trong 10 phuùt Ghi nhaän thoâng tin maãu, thôøi gian thu maãu Baám maãu sinh thieát Tröõ maãu trong eppendorf chöùa saün 1ml moâi tröôøng DMEM coù huyeát thanh FBS 10% Tröõ eppendorf ôû nhieät ñoä 4oC Chaån ñoaùn giai ñoaïn beänh baèng moû vòt Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 54 (d) Chuyeån nhöõng maõnh moâ ñaõ caét nhoû vaøo erlen 50ml, theâm vaøo 5ml Trypsin- EDTA. (e) Khuaáy töø ôû nhieät ñoä 37oC töø 15 – 60 phuùt, khaûo saùt maät ñoä teá baøo theo thôøi gian. (f) Sau 15 phuùt laáy erlen ra khoûi maùy khuaáy töø, ñeå yeân trong voøng 2 -3 phuùt. Huùt phaàn dung dòch noåi phía treân cho vaøo oáng ly taâm, ñem ly taâm 1000v/ 5 phuùt. (g) Phaàn maãu coøn laïi trong erlen tieáp tuïc khuaáy ôû 37oC. Sau 15 phuùt seõ tieán haønh thao taùc nhö phaàn (f) cho ñeán khi naøo thu ñöôïc toaøn boä löôïng teá baøo caàn thieát. (h) Sau khi ly taâm 1000v/ 5 phuùt, loaïi boû phaàn noåi, sau ñoù theâm vaøo 5ml moâi tröôøng DMEM 10% FBS. (i) Ñeám maät ñoä teá baøo ung thö (tröø teá baøo maùu, hoàng caàu, baïch caàu …). (j) Cho maãu vaøo gieáng nuoâi trong tuû aám 37oC, 5% CO2. (k) Quan saùt keát quaû sau 24 giôø, 48 giôø, 76 giôø … 2.3.3. Quy trình taùch teá baøo baèng phöông phaùp cô hoïc. (a) Chuyeån maãu ñöôïc tröõ trong eppendorf coù chöùa moâi tröôøng DMEM 10% FBS vaøo ñóa petri (ñöôøng kính10cm). (b) Röûa maãu baèng PBSA coù khaùng sinh Gentamycin – Ampotericin B töø 2 – 3 laàn ñeå laøm saïch maãu. (c) Söû duïng keùo cong hoaëc thaúng caét maãu moâ ra thaønh töøng maõnh nhoû, tieáp tuïc caét nhuyeãn caùc maõnh moâ. (d) Theâm vaøo ñóa petri 1ml FBS, chuyeån nhöõng maõnh moâ vaøo bình roux. (e) Ñeå yeân trong voøng 24 giôø, ñeå giuùp cho söï baùm teá baøo ñöôïc xaûy ra. (f) Theâm vaøo 5ml moâi tröôøng DMEM, cho vaøo tuû aám 37oC, 5% CO2. (g) Quan saùt keát quaû sau 24 giôø, 48 giôø, … Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 55 Hình 15: Maãu sinh thieát ñöôïc tröõ trong eppendorf chöùa 1ml moâi tröôøng DMEM coù huyeát thanh FBS 10% Hình 16: Chuyeån maãu ñöôïc tröõ trong eppendorf coù chöùa moâi tröôøng DMEM 10% FBS vaøo ñóa petri Hình 17: Söû duïng keùo cong hoaëc thaúng caét nhuyeãn maãu moâ . Hình 18: Huùt maãu sau khi khuaáy cho vaøo Hình 19: Chuyeån nhöõng maõnh moâ oáng ly taâm vaøo bình roux Theâm vaøo ñóa petri 1ml FBS, chuyeån nhöõng maõnh moâ vaøo bình roux Khuaáy töø ôû nhieät ñoä 37oC töø 15 – 60 phuùt, khaûo saùt maät ñoä teá baøo theo thôøi gian Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 56 Hình 21: Cho bình roux vaøo tuû aám 37oC, 5% CO2 Hình 20: Ñem ly taâm 1000v/ 5 phuùt Hình 22: Cho maãu vaøo gieáng nuoâi ñaët trong tuû aám 37oC, 5% CO2 2.3.4. Phöông phaùp xaùc ñònh maät ñoä teá baøo baèng phoøng ñeám NEUBAUER - Röûa phoøng ñeám baèng nöôùc caát - Saáy khoâ - Röûa laïi phoøng ñeám baèng coàn 70oC - Saáy khoâ - Ñaët lamelle leân phoøng ñeám - Ñoùng bôùt chaén saùng - Xaùc ñònh thò tröôøng phoøng ñeám döôùi kính hieån vi quang hoïc - Cho maãu vaøo phoøng ñeám - Xaùc ñònh maät ñoä teá baøo theo quy taéc ñeám phía treân, beân phaûi cuûa caùc oâ trong phoøng ñeám - Phoøng ñeám goàm 9 oâ lôùn - Moãi oâ lôùn goàm 16 oâ nhoû - Ñeám soá teá baøo trong 5 oâ lôùn (Vuøng 1,2,3,4,5) - Moãi oâ lôùn coù theå tích: 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm3 = 10-4 ml - Maät ñoä teá baøo = (soá teá baøo cuûa 5 oâ lôùn / 5) x 104 (soá teá baøo/ ml) Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 57 Hình 23: Caùc vò trí xaùc ñònh soá teá baøo treân phoøng ñeám 1. KEÁT QUAÛ KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG TAÙCH TEÁ BAØO UNG THÖ COÅ TÖÛ CUNG BAÈNG MAÙY LAÉC ÔÛ BA NOÀNG ÑOÄ TRYPSIN KHAÙC NHAU Baûng 2: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 1 Maãu 2 Maãu 3 Chaån ñoaùn giai ñoaïn IIA IIA IIB Tuoåi ngöôøi cho maãu 77 58 60 Thôøi ñieåm phaãu thuaät 8 giôø 5 phuùt 8 giôø 30 phuùt 9 giôø 5 phuùt Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm 13 giôø 30 phuùt 13giôø 30 phuùt 13 giôø 30 phuùt Baûng 3: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Thôøi gian khuaáy (phuùt) Maãu 1 khuaáy vôùi Trypsin 0,125% Maãu 2 khuaáy vôùi Trypsin 0,25% Maãu 3 khuaáy vôùi Trypsin 0,5% 30 6 11 15 60 10 21 35 Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 58 90 15 28 47 120 26 37 59 6 10 15 26 11 21 28 37 15 35 47 59 0 10 20 30 40 50 60 Maãu 1 Maãu 2 Maãu 3 30 phuùt 60 phuùt 90 phuùt 120 phuùt Bieåu ñoà 1: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian laéc Baûng 2 vaø bieåu ñoà 1 cho thaáy: - Khi ta caét maãu moâ thaønh nhöõng maõnh nhoû, khaûo saùt maät ñoä teá baøo thu ñöôïc baèng caùch söû duïng maùy laéc vôùi 3 noàng ñoä trypsin khaùc nhau (0,125%, 0,25%, 0,5%). Vôùi ba noàng ñoä treân, sau khi laéc 120 phuùt maät ñoä teá baøo thu ñöôïc chöa ñeán möùc cao nhaát. Ñieàu naøy cho thaáy raèng vieäc söû duïng maùy laéc taùc ñoäng ñeán söï taùch rôøi caùc teá baøo phaûi toán moät khoaûng thôøi gian khaù daøi, seõ aûnh höôûng ñeán thôøi gian thí nghieäm. - Do ñoù chuùng toâi ñaõ tieán haønh khaûo saùt cuõng vôùi ba noàng ñoä trypsin treân baèng phöông phaùp khuaáy töø ôû nhieät ñoä 37oC. 2. KEÁT QUAÛ KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG TAÙCH TEÁ BAØO UNG THÖ COÅ TÖÛ CUNG BAÈNG MAÙY KHUAÁY TÖØ ÔÛ 37OC VÔÙI BA NOÀNG ÑOÄ TRYPSIN KHAÙC NHAU Baûng 4: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 1 Maãu 2 Maãu 3 Chaån ñoaùn giai ñoaïn IB IIA IIB Tuoåi ngöôøi cho maãu 57 68 48 Thôøi ñieåm phaãu thuaät 8 giôø 15 phuùt 8 giôø 20 phuùt 8 giôø 30 phuùt M aät ñ oä te á b aøo (S TB x1 04 ) Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 59 Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm 13 giôø 5 phuùt 13giôø 5 phuùt 13 giôø 5 phuùt Baûng 5: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Thôøi gian khuaáy (phuùt) Maãu 1 khuaáy vôùi Trypsin 0,125% Maãu 2 khuaáy vôùi Trypsin 0,25% Maãu 3 khuaáy vôùi Trypsin 0,5% 30 13 27 35 60 22 30 82 90 27 60 67 120 30 47 43 13 22 27 30 27 30 60 47 35 82 67 43 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Maãu 1 Maãu 2 Maãu 3 30 phuùt 60 phuùt 90 phuùt 120 phuùt Bieåu ñoà 2: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Baûng 4 vaø bieåu ñoà 2 cho thaáy: - Maãu 1: khi khuaáy vôùi trypsin 0,125%, sau 120 phuùt khuaáy maät ñoä teá baøo khoâng ñaït ñeán möùc cao nhaát, ñieàu naøy seõ aûnh höôûng ñeán thôøi gian thí nghieäm. - Maãu 2: khi khuaáy vôùi trypsin 0,25%, sau 90 phuùt khuaáy maät ñoä teá baøo ñaït ñeán möùc cao nhaát. ÔÛ noàng ñoä trypsin 0,25%, tyû leä teá baøo soáng laø 98%. - Maãu 3: khi khuaáy vôùi trypsin 0,5%, sau 60 phuùt maät ñoä teá baøo ñaït ñeán möùc cao nhaát, tyû leä teá baøo soáng laø 85%. Qua keát quaû treân chuùng toâi choïn noàng ñoä trypsin 0,25%. Maëc duø thôøi gian khuaáy ñeå ñaït ñöôïc maät ñoä teá baøo laø 90 phuùt nhöng tyû leä teá baøo soáng cao. M aät ñ oä te á b aøo (S TB x1 04 ) Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 60 3. KEÁT QUAÛ KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG TAÙCH TEÁ BAØO UNG THÖ COÅ TÖÛ CUNG ÔÛ NOÀNG ÑOÄ TRYPSIN 0,25% Baûng 6: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 1 Maãu 2 Maãu 3 Chaån ñoaùn giai ñoaïn IIB IIA IIB Tuoåi ngöôøi cho maãu 55 56 76 Thôøi ñieåm phaãu thuaät 8 giôø 15 phuùt 8 giôø 30 phuùt 9 giôø 10 phuùt Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm 13 giôø 30 phuùt 13giôø 30 phuùt 13 giôø 30 phuùt Baûng 7: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Thôøi gian khuaáy (phuùt) Maãu 1 Maãu 2 Maãu 3 30 13 95 15 60 24 113 35 90 37 168 59 120 23 137 46 13 24 37 23 95 113 168 137 15 35 59 46 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Maãu 1 Maãu 2 Maãu 3 30 phuùt 60 phuùt 90 phuùt 120 phuùt Bieåu ñoà 3: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Baûng 6 vaø bieåu ñoà 3 cho thaáy: - Khi khuaáy vôùi noàng ñoä trypsin 0,25% ôû ba maãu 1, 2, 3, sau 90 phuùt maät ñoä teá baøo ñeàu ñaït ñeán möùc cao nhaát, tyû leä teá baøo soáng laø 95% - 98%. M aät ñ oä te á b aøo (S TB x1 04 ) Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 61 - Chuùng toâi ñaõ khaéc phuïc khuyeát ñieåm veà thôøi gian khuaáy baèng caùch tieán haønh thí nghieäm khuaáy vôùi noàng ñoä trypsin 0,25%, vaø theâm vaøo EDTA (chaát neàn giuùp cho taùc ñoäng trypsin leân söï taùch caùc teá baøo coù hieäu quaû vaø nhanh hôn) vôùi tyû leä EDTA:Trypsin laø 1:4. 4. KEÁT QUAÛ KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG TAÙCH TEÁ BAØO UNG THÖ COÅ TÖÛ CUNG BAÈNG PHÖÔNG PHAÙP KHUAÁY TÖØ GIA NHIEÄT VÔÙI NOÀNG ÑOÄ TRYPSIN 0,25% + EDTA 0,02%. Baûng 8: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 1 Maãu 2 Maãu 3 Chaån ñoaùn giai ñoaïn IIA IB IB Tuoåi ngöôøi cho maãu 41 55 44 Thôøi ñieåm phaãu thuaät 8 giôø 50 phuùt 9 giôø 00 phuùt 9 giôø 15 phuùt Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm 14 giôø 00 phuùt 14 giôø 00 phuùt 14 giôø 00 phuùt Baûng 9: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Thôøi gian khuaáy (phuùt) Maãu 1 Maãu 2 Maãu 3 15 28 11 13 30 38 23 25 45 48 33 29 60 64 36 35 90 54 27 31 Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 62 28 38 48 64 54 11 23 33 36 27 13 25 29 35 31 0 10 20 30 40 50 60 70 Maãu 1 Maãu 2 Maãu 3 15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt 90 phuùt Bieåu ñoà 4: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Baûng 9: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 4 Maãu 5 Maãu 6 Chaån ñoaùn giai ñoaïn IIB IIB IB Tuoåi ngöôøi cho maãu 51 52 50 Thôøi ñieåm phaãu thuaät 8 giôø 30 phuùt 9 giôø 15 phuùt 9 giôø 30 phuùt Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm 14 giôø 00 phuùt 14 giôø 00 phuùt 14 giôø 00 phuùt Baûng 10: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Thôøi gian khuaáy (phuùt) Maãu 4 Maãu 5 Maãu 6 15 122 66 14 30 153 92 16 45 180 142 23 60 235 188 36 90 201 145 32 M aät ñ oä te á b aøo (S TB x1 04 ) Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 63 122 153 180 235 201 66 92 142 188 145 14 16 23 36 32 0 50 100 150 200 250 Maãu 4 Maãu 5 Maãu 6 15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt 90 phuùt Bieåu ñoà 5: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Baûng 11: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 7 Maãu 8 Maãu 9 Chaån ñoaùn giai ñoaïn IIA IIB IIA Tuoåi ngöôøi cho maãu 38 56 43 Thôøi ñieåm phaãu thuaät 8 giôø 45 phuùt 9 giôø 25 phuùt 9 giôø 35 phuùt Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm 14 giôø 00 phuùt 14 giôø 00 phuùt 14 giôø 00 phuùt Baûng 12: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Thôøi gian khuaáy (phuùt) Maãu 7 Maãu 8 Maãu 9 15 38 35 25 30 55 68 43 45 69 85 68 60 86 104 78 90 67 92 59 M aät ñ oä te á b aøo (S TB x1 04 ) Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 64 38 55 69 86 67 35 68 85 104 92 25 43 68 78 59 0 20 40 60 80 100 120 Maãu 7 Maãu 8 Maãu 9 15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt 90 phuùt Bieåu ñoà 6: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Baûng 13: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 10 Maãu 11 Maãu 12 Chaån ñoaùn giai ñoaïn IIA IB IIB Tuoåi ngöôøi cho maãu 56 45 57 Thôøi ñieåm phaãu thuaät 10 giôø 10 phuùt 9 giôø 30 phuùt 9 giôø 45 phuùt Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm 14 giôø 30 phuùt 14 giôø 30 phuùt 14 giôø 30 phuùt Baûng 14: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Thôøi gian khuaáy (phuùt) Maãu 10 Maãu 11 Maãu 12 15 37 13 50 30 42 26 72 45 53 35 88 60 69 41 125 90 49 29 97 M aät ñ oä te á b aøo (S TB x1 04 ) Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 65 37 42 53 69 49 13 26 35 41 29 50 72 88 125 97 0 20 40 60 80 100 120 140 Maãu 10 Maãu 11 Maãu 12 15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt 90 phuùt Bieåu ñoà 7: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Baûng 15: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 13 Maãu 14 Maãu 15 Chaån ñoaùn giai ñoaïn IIA IIB IIB Tuoåi ngöôøi cho maãu 49 49 69 Thôøi ñieåm phaãu thuaät 8 giôø 15 phuùt 9 giôø 30 phuùt 8 giôø 45 phuùt Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm 13 giôø 30 phuùt 13 giôø 30 phuùt 13 giôø 30 phuùt Baûng 16: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Thôøi gian khuaáy (phuùt) Maãu 13 Maãu 14 Maãu 15 15 27 78 62 30 35 92 86 45 59 123 99 60 79 158 120 90 62 119 102 M aät ñ oä te á b aøo (S TB x1 04 ) Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 66 27 35 59 79 62 78 92 123 158 119 62 86 99 120 102 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Maãu 13 Maãu 14 Maãu 15 15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt 90 phuùt Bieåu ñoà 8: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Baûng 17: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 16 Maãu 17 Maãu 18 Chaån ñoaùn giai ñoaïn IB IIB IIA Tuoåi ngöôøi cho maãu 49 49 69 Thôøi ñieåm phaãu thuaät 9 giôø 15 phuùt 9 giôø 30 phuùt 9 giôø 40 phuùt Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm 13 giôø 30 phuùt 13 giôø 30 phuùt 13 giôø 30 phuùt Baûng 18: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Thôøi gian khuaáy (phuùt) Maãu 16 Maãu 17 Maãu 18 15 17 33 20 30 22 56 42 45 23 75 58 60 39 91 72 90 29 79 67 M aät ñ oä te á b aøo (S TB x1 04 ) Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 67 17 2223 39 29 33 56 75 91 79 20 42 58 72 67 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Maãu 16 Maãu 17 Maãu 18 15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt 90 phuùt Bieåu ñoà 9: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Baûng 19: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 19 Maãu 20 Maãu 21 Chaån ñoaùn giai ñoaïn IIA IIA IB Tuoåi ngöôøi cho maãu 60 41 64 Thôøi ñieåm phaãu thuaät 8 giôø 15 phuùt 8 giôø 20 phuùt 8 giôø 35 phuùt Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm 13 giôø 30 phuùt 13 giôø 30 phuùt 13 giôø 30 phuùt Baûng 20: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Thôøi gian khuaáy (phuùt) Maãu 19 Maãu 20 Maãu 21 15 22 38 12 30 38 42 26 45 69 73 39 60 89 98 40 90 72 79 32 M aät ñ oä te á b aøo (S TB x1 04 ) Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 68 22 38 69 89 72 38 42 73 98 79 12 26 39 40 32 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Maãu 19 Maãu 20 Maãu 21 15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt 90 phuùt Bieåu ñoà 10: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy. Baûng 21: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 22 Maãu 23 Maãu 24 Chaån ñoaùn giai ñoaïn IIA IB IB Tuoåi ngöôøi cho maãu 70 45 57 Thôøi ñieåm phaãu thuaät 8 giôø 45 phuùt 9 giôø phuùt 9 giôø 10 phuùt Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm 14 giôø 30 phuùt 14 giôø 30 phuùt 14 giôø 30 phuùt Baûng 22: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Thôøi gian khuaáy (phuùt) Maãu 22 Maãu 23 Maãu 24 15 39 15 14 30 55 28 23 45 79 35 28 60 96 44 38 90 87 32 29 M aät ñ oä te á b aøo (S TB x1 04 ) Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 69 39 55 79 96 87 15 28 35 44 32 14 23 28 38 29 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Maãu 22 Maãu 23 Maãu 24 15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt 90 phuùt Bieåu ñoà 11: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Baûng 23: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 25 Maãu 26 Maãu 27 Chaån ñoaùn giai ñoaïn IB IB IB Tuoåi ngöôøi cho maãu 44 58 56 Thôøi ñieåm phaãu thuaät 8 giôø 15 phuùt 8 giôø 30 phuùt 8 giôø 45 phuùt Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm 14 giôø 30 phuùt 14 giôø 30 phuùt 14 giôø 30 phuùt Baûng 24: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Thôøi gian khuaáy (phuùt) Maãu 25 Maãu 26 Maãu 27 15 12 22 14 30 15 28 23 45 28 32 26 60 35 39 37 90 21 25 32 M aät ñ oä te á b aøo (S TB x1 04 ) Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 70 12 15 28 35 21 22 28 32 39 25 14 23 26 37 32 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Maãu 25 Maãu 26 Maãu 27 15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt 90 phuùt Bieåu ñoà 12: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Baûng 25: Thoâng tin veà nguoàn maãu Maãu 28 Maãu 29 Maãu 30 Chaån ñoaùn giai ñoaïn IIB IIB IIA Tuoåi ngöôøi cho maãu 68 49 64 Thôøi ñieåm phaãu thuaät 8 giôø 30 phuùt 8 giôø 20 phuùt 8 giôø 45 phuùt Thôøi ñieåm tieán haønh thí nghieäm 14 giôø 30 phuùt 14 giôø 30 phuùt 14 giôø 30 phuùt Baûng 26: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung taïi caùc thôøi ñieåm khuaáy Maät ñoä teá baøo (STBx104/ml) Thôøi gian khuaáy (phuùt) Maãu 28 Maãu 29 Maãu 30 15 42 38 32 30 58 52 46 45 67 73 59 60 89 96 70 90 72 79 62 M aät ñ oä te á b aøo (S TB x1 04 ) Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 71 42 58 67 89 72 38 52 73 96 79 32 46 59 70 62 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Maãu 28 Maãu 29 Maãu 30 15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt 90 phuùt Bieåu ñoà 13: Maät ñoä teá baøo ung thö coå töû cung thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Caùc keát quaû khaûo saùt khaû naêng taùch teá baøo ung thö coå töû cung baèng phöông phaùp khuaáy töø gia nhieät vôùi noàng ñoä trypsin 0,25% - EDTA 0,02% ñöôïc trình baøy ôû treân cho thaáy: - Maät ñoä teá baøo taêng daàn trong khoaûng thôøi gian khuaáy töø 15 – 45 phuùt, vaø sau khi khuaáy 60 phuùt maät ñoä teá baøo ñaït möùc cao nhaát. Neáu tieáp tuïc khuaáy thì maät ñoä teá baøo giaûm daàn. - Vôùi thôøi gian vaø maät ñoä thu ñöôïc nhö treân coù theå thieát laäp quy trình phuø hôïp ñeå coù theå thu nhaän hoaøn toaøn toång soá löôïng teá baøo. Sau khi khuaáy 30 phuùt tieán haønh thu teá baøo laàn moät, tieáp tuïc ñeå khuaáy tieáp töø 15 phuùt – 30 phuùt cho ñeán khi caùc teá baøo ñöôïc taùch rôøi hoaøn toaøn, tieán haønh thu teá baøo laàn hai. Nhö vaäy vôùi noàng ñoä trypsin laø 0,25% vaø EDTA 0,02% vaø thôøi gian khuaáy töø 15 – 60 phuùt, coù theå thu ñöôïc maät ñoä teá baøo töø 1x105 – 5x106 ñeå tieán haønh nuoâi caáy sô caáp. - Moät ñieàu ñaùng chuù yù laø ta thaáy coù söï cheânh leäch maät ñoä teá baøo thu ñöôïc sau khi khuaáy giöõa caùc beänh nhaân theo töøng giai ñoaïn beänh. - Sau ñaây laø baûng thoáng keâ maät ñoä teá baøo sau khi khuaáy theo töøng giai ñoaïn: Giai ñoaïn IB: Baûng 27: Maät ñoä teá baøo cuûa maãu beänh phaãm giai ñoaïn IB thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Thôøi gian khuaáy 15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt 90 phuùt M aät ñ oä te á b aøo (S TB x1 04 ) Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 72 Maãu 2 11 23 33 36 27 Maãu 3 13 25 29 35 31 Maãu 6 14 16 23 36 32 Maãu 11 13 26 35 41 29 Maãu 16 17 22 23 39 29 Maãu 21 12 26 39 40 32 Maãu 23 15 28 35 44 32 Maãu 24 14 23 28 38 29 Maãu 25 12 15 28 35 21 Maãu 26 22 28 32 39 25 Maãu 27 14 23 26 37 32 Giai ñoaïn IIA: Baûng 28: Maät ñoä teá baøo cuûa maãu beänh phaãm giai ñoaïn IIA thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Thôøi gian khuaáy 15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt 90 phuùt Maãu 1 28 38 48 64 54 Maãu 7 38 55 69 86 67 Maãu 9 25 43 68 78 59 Maãu 10 37 42 53 69 49 Maãu 13 27 35 59 79 62 Maãu 18 20 42 58 72 67 Maãu 19 22 38 69 89 72 Maãu 20 38 42 73 98 79 Maãu 22 39 55 79 96 87 Maãu 30 32 46 59 70 62 Giai ñoaïn IIB: Baûng 29: Maät ñoä teá baøo cuûa maãu beänh phaãm giai ñoaïn IIB thu ñöôïc theo thôøi gian khuaáy Thôøi gian khuaáy 15 phuùt 30 phuùt 45 phuùt 60 phuùt 90 phuùt Maãu 5 66 92 142 188 145 Maãu 8 35 68 85 104 92 Maãu12 50 72 88 125 97 Maãu 14 78 92 123 158 119 Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 73 Maãu 15 62 86 99 120 102 Maãu 17 33 56 75 91 79 Maãu 28 42 58 67 89 72 Maãu 29 38 52 73 96 79 Bieän luaän: ƒ Trong ñieàu kieän cho pheùp thí nghieäm chæ coù theå söû duïng caùc maãu sinh thieát cuûa beänh nhaân bò toån thöông ung thö ôû caùc giai ñoaïn beänh IB, IIA, IIB. - Khi quan saùt caùc teá baøo ñöôïc taùch rôøi trong buoàng ñeám treân kính hieån vi ñieån töû, thaáy raèng vaãn coøn hieän dieän hoàng caàu, teá baøo maùu, baïch caàu … Döïa vaøo ñaëc ñieåm teá baøo ung thö ñöôïc ñeà caäp ôû treân, vaø phaân bieät vôùi caùc teá baøo khaùc khoâng phaûi laø teá baøo ung thö ta coù theå ñeám ñöôïc soá löôïng teá baøo ung thö moät caùch töông ñoái. - Ôû baûng 18, 19, vaø 20 ñeàu cho thaáy: ƒ ÔÛ caùc giai ñoaïn beänh khaùc nhau, maät ñoä teá baøo ñeàu taêng daàn theo thôøi gian khuaáy töø 15 phuùt – 40 phuùt, vaø sau khi khuaáy 60 phuùt maät ñoä teá baøo ñaït möùc cao nhaát, vaø neáu tieáp tuïc khuaáy maät ñoä teá baøo seõ giaûm daàn. ƒ Ngoaøi ra, coù söï cheânh leäch maät ñoä teá baøo giöõa caùc giai ñoaïn, ôû giai ñoaïn IIA maät ñoä teá baøo thu ñöôïc thaáp hôn IIB, vaø maät ñoä teá baøo thu ñöôïc ôû IB thaáp hôn so vôùi IIA vaø IIB. Do caùc baûng thoáng keâ treân chæ ñöôïc thöïc hieän treân soá löôïng maãu haïn cheá, coù theå giaûi thích moät caùch töông ñoái cho söï cheânh leäch treân nhö sau: ƒ ÔÛ giai ñoaïn IB,ï ña soá hieän dieän nhieàu caùc teá baøo vieâm (baïch caàu ña nhaân hay ñôn nhaân), soá löôïng teá baøo ung thö toàn taïi ít vaø khoù phaân bieät vôùi teá baøo khaùc do hình thaùi, caáu truùc baát thöôøng cuûa chuùng chöa bieåu hieän roõ. ƒ ÔÛ giai ñoaïn IIA, IIB soá löôïng teá baøo coù hình thaùi, caáu truùc baát thöôøng hieän dieän nhieàu hôn, tính ña dieän cuûa teá baøo theå hieän roõ hôn vaø giuùp phaân bieät roõ hôn vôùi caùc teá baøo khaùc. Nhaän xeùt: - Qua quaù trình tieán haønh thí nghieäm vaø caùc keát quaû thu ñöôïc, coù theå ruùt ra keát luaän raèng khi khuaáy maãu ôû nhieät ñoä 37oC vôùi dung dòch Trypsin 0,25% - EDTA 0,02% seõ thu ñöôïc maät ñoä teá baøo nhö mong muoán (1x105 – 5x106). Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 74 - Tuy nhieân, caùc ñieàu kieän laáy nguoàn maãu, nhöõng sai soùt trong quaù trình tieán haønh thí nghieäm ñaõ moät phaàn naøo ñoù aûnh höôûng ñeán keát quaû thí nghieäm. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO TAØI LIEÄU ÑAÕ ÑÖÔÏC XUAÁT BAÛN 1. Nguyeãn Chaán Huøng (2004), Ung böôùu hoïc noäi khoa, NXB Tp.Hoà Chí Minh. 2. Leâ Ñình Oanh (2001), Beänh hoïc caùc khoái u, NXB Haø Noäi. 3. Phan Kim Ngoïc (2002), Giaùo trình thöïc taäp cô sôû Coâng ngheä sinh hoïc ñoäng vaät, NXB Ñaïi hoïc quoác gia Tp.Hoà Chí Minh. 4. Töø ñieån baùch khoa sinh hoïc (2003), NXB Khoa hoïc Kyõ thuaät. 5. Simon P.Langdon (2003), Cancer cell culture, Human Press. 6. George H. Fried (1999), Theory and problem biology, Mc Graw Hill. TAØI LIEÄU TRUY CAÄP QUA INTERNET 7. Kwasniewska A, Semczuk M, Sikorski M and Kraczkowski J:Use of the Digene Hybrid Capture System for identification of the human papillomavirus (HPV-human papillomavirus) in women with cervical dysplasia. Przegl Lek 54: 848-850, 1997. 8. Ho GY, Bierman R, Beardsley L, Chang CJ and Burk RD: Natural history of cervicovaginal papillomavirus infection in young women. N Engl J Med 338: 423-428, 1998. 9. Saito J, Hoshiai H and Noda K: Type of human papillomavirus and expression of p53 in elderly women with cervical cancer. Gynecol Obstet Invest 49: 190-193, 2000. 10. Stanley MA (1986): Human cervical epithelium. In webber MM, Sekely LI. 11. Stanley MA, Parkinson EK (1979): Growth requirements of human cervical epithelial cells in culture.Int J Cancer 24. Thöû nghieäm phaân laäp vaø nuoâi caáy teá baøo ung thö coå töû cung Taï Ngoïc Tuyeát Minh 75 12. http//www.google.com.vn/search?q=cache:Yvv6UEJ+method+ identification +cervical+carcinoma+cell. 13. http//www.google.com.vn/search?q= cache +hela. 14. http//www.pubmedcentral.nih/gov/article/rapid+induction+of+senescence+in +human+cervical+carcinoma+cell. 15. http//www.pnas.org/cgi/dol/10.1073=cell+culture+forensics.